Abstract

Fundo

câncer se espalhou para outros órgãos é a principal causa de morte de pacientes oncológicos. A migração de células de cancro a partir de um tumor primário é o passo crucial no complexo processo de metástase, portanto, bloquear este processo é actualmente o principal estratégia de tratamento. inibidores da metástase derivados de produtos naturais, tais como, migrastatin, são agentes anticancerígenos muito promissores. Assim, o objetivo do nosso estudo foi investigar o efeito de seis análogos migrastatin (MGSTA-1 a 6) sobre a migração e invasão de linhas celulares de adenocarcinoma mamários caninos isolados de tumores primários e suas metástases para os pulmões. tumores mamários caninos constituem uma valiosa ferramenta para o estudo de aspectos múltiplos do câncer humano

Resultados

Nossos resultados mostraram que dois dos seis análogos totalmente sintéticas de migrastatin:. MGSTA-5 e MGSTA-6 foram potente inibidores de canino migração de células de cancro mamário e invasão. Estes dados foram obtidos utilizando o teste de cura de feridas, bem como ensaios de migração e invasão trans poços. Além disso, o tratamento de células cancerosas com o composto mais eficaz (MGSTA-6) perturbado ligação entre filamentoso F-actina e fascin1. A análise de microscopia confocal revelou que o tratamento com MGSTA-6 aumentaram a presença de fascin1 não ligado e reduzida co-localização de F-actina e fascin1 em células cancerosas canino. Muito provavelmente, os filamentos de actina não foram reticuladas por fascin1 e não geram a arquitectura filopoidais típico dos filamentos de actina em resposta à actividade de MGSTA-6. Assim, a administração de MGSTA-6 resultados em diminuição da formação de saliências filopódios e fibras de estresse em células cancerosas mamários caninos, causando a inibição da migração de câncer e invasão.

Conclusão

Dois análogos sintéticos migrastatin (MGSTA -5 e MGSTA-6) mostraram-se promissores compostos para a inibição da metástase do cancro. Eles podem ter efeitos terapêuticos benéficos na terapia do cancro em cães, especialmente em combinação com outros fármacos anti-cancerígenos. No entanto, mais

em

vivo

estudos são necessários para verificar esta hipótese

Citation:. Majchrzak K, Lo Re D, Gajewska M, Bulkowska M, Homa A, Pawłowski K, et al. (2013) Migração celular Migrastatin análogos, inibem a Canine câncer mamário e Invasão. PLoS ONE 8 (10): e76789. doi: 10.1371 /journal.pone.0076789

editor: Waldemar Debinski, Wake Forest University, School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de maio de 2013; Aceito: 04 de setembro de 2013; Publicação: 08 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Majchrzak et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo número de concessão N N308 574940 do Ministério da Ciência e do Ensino Superior da Polónia e da Science Foundation Ireland (número de concessão 07 /IN.1 /B966). A investigação conducente a estes resultados beneficiaram de financiamento do Programa Pessoas (Acções Marie Curie) do Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7 /2007-2013) ao abrigo do REA número do contrato de concessão PIEF-GA-2011-299042. Este trabalho foi apoiado por CM1106 Acção COST. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a metástase é a causa da maioria das mortes por câncer [1,2]. Embora seja amplamente investigada, continua a ser um dos aspectos mais impenetráveis ​​da doença. maus resultados das terapias atuais, em particular mau prognóstico para pacientes em estágios avançados de tumores sólidos devido à metástase incentivar os investigadores de todo o mundo para encontrar novos medicamentos que possam inibir a cascata metastática. Um agente promissor é o migrastatin produto natural: um novo composto anti-metastático de origem microbiana. É um produto natural isolado a partir de macrolactona originalmente

Streptomyces sp

. MK929-43F1 por Imoto et al. em 2000 [3-5] e, posteriormente, a partir de

Streptomyces platensis

por Licari et al. em 2002 [6], tal como um inibidor da migração de células do tumor. Apenas alguns anos mais tarde, a primeira síntese química total de migrastatin foi relatada [7,8]. Desde então, vários análogos mais eficazes de migrastatin foram sintetizados e descrito como drogas anti-metastáticos promissores [8-13]. Tem havido esforços para gerar novos análogos para estudos de estrutura-actividade [14-17]. actividade importante, análogos simples de migrastatin, tais como o macrólido MGSTA-8 (Figura 1), mostraram ~ 1000 vezes mais activo do que migrastatin-se em ensaios de migração de células tumorais in

in vitro

[9]. análogos truncados, tais como MGSTA-4 e o macroketone MGSTA-5 e MGSTA-8 inibem a metástase de células tumorais altamente metastáticas em modelos de ratinho [10,12]. No entanto, a inibição da capacidade de migração de células consideravelmente depende da estrutura dos compostos, bem como alguns análogos acíclicos mostram actividade [11,14,15].

O mecanismo molecular pelo qual migrastatin afecta a migração de células de cancro e invasão ainda não foi completamente descoberta, embora tenha sido propostos para direccionar fascin1, a proteína de agregação da actina [18]. Migrastatin pode ligar-se a um dos sítios de ligação à actina que impedem a ligação cruzada de actina e formação de filopodia filamentos [18]. Sobre-expressão de

fascin1

em células cancerosas tenha sido previamente associadas com o personagem clinicamente agressivo do tumor, mau prognóstico e tempo de sobrevida livre de doença encurtado [18-20].

Nossos estudos anteriores têm mostrado aumento da regulação do

fascina

em linhas mamários caninos altamente invasivos de células de câncer [21]. Assim, usamos-los como um modelo para investigação de drogas fascina-segmentação, como a migrastatin. Assim, examinámos um papel de seis vários análogos de migrastatin MGSTA-1 a 6, incluindo a macroketone Danishefsky (MGSTA-5) e macrolactona (MGSTA-4), na invasão de células de cancro mamário canino, migração e reorganização do citoesqueleto.

os tumores mamários caninos são modelo atraente e útil para estudar o cancro da mama humano, porque eles capturam a essência dos cancros da mama humanos, ao contrário da maioria geneticamente modificado ou modelos de xenotransplante de roedores. Em primeiro lugar, cães compartilham o mesmo ambiente como os seres humanos, assim, são expostos a muitos dos mesmos agentes cancerígenos. Em segundo lugar, os tumores ocorrer em cães naturalmente e espontaneamente e tem um curso idêntico ao utilizado em seres humanos. Numerosas semelhanças clínicos têm demonstrado até agora, a respeito da etiologia hormonal de tumores, idade de início, fatores de risco (por exemplo, obesidade), resultados clínicos, fatores prognósticos (por exemplo, tamanho do tumor, invasão de linfonodos e estadiamento clínico) (para revisão ver: [ ,,,0],22-24];). Além disso, muitas semelhanças fortes e significativas ao nível molecular têm sido mostrado em estudos comparativos de todo o genoma. Por exemplo, vias relacionadas com a promoção da proliferação foram sobre-regulada em ambas as espécies, e os relacionados com o desenvolvimento das células, a adesão da matriz celular e comunicação celular, foram regulada para baixo [23]. Além disso, a sobre-expressão de receptores de esteróides, os marcadores de proliferação, factor de crescimento epidérmico, mutações do gene p53 supressor, metaloproteinases e ciclooxigenases, foi encontrada em ambas as espécies, bem como grande homologia nas alterações de vias relacionadas com o cancro, tais como o fosfatidilinositol 3-quinase ( PI3K) /Akt, KRAS, fosfatase e tensina homólogo (PTEN), Wnt-β-catenina, e a cascata de proteína-quinase activada por mitogénio (MAPK) [23,25]. Portanto, o modelo de tumor mamário canino constitui uma ferramenta valiosa para a medicina translacional em particular para a avaliação e desenvolvimento de novas aplicações de diagnóstico e prognóstico, bem como estratégias terapêuticas que irão beneficiar ambos os cães e pacientes com câncer humanos [22-26].

Métodos

cultura celular

As linhas celulares utilizadas para este estudo foram descritos em nossa pesquisa previamente publicado [21,27]. Duas linhas de células de adenocarcinoma foram isolados a partir dos tumores mamários (CMT-W1 e CMT-W2) e duas linhas de células foram isolados das suas metástases pulmonares (CMT-W1M e CMT-W2M). As linhas de células foram cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS), 50 U /ml de penicilina, 50 ug /ml de estreptomicina e 2,5 ug /ml de anfotericina B (reagentes obtidos a partir de Sigma Aldrich Chemical Co., EUA). As células foram cultivadas em frascos de cultura de tecidos (Nunc ™, Dinamarca) numa atmosfera de 5% de CO2 e 95% de ar humidificado a 37 ° C, e foram rotineiramente subcultivadas a cada segundo dia.

Migrastatin análogos

As estruturas dos análogos testados (migrastatin MGSTA-1 a 6) são apresentados na Figura 1.

Síntese de análogos de migrastatin

Composto MGSTA-4 e MGSTA-5 foram sintetizados a partir de 9 , como relatado na literatura [9], enquanto compostos MGSTA-1 a 3 e MGSTA-6 foram preparados a partir de 9 [9] tal como ilustrado na Figura 2. Assim, a esterificação de 9 com ácido 5-hexenóico sob condições de Mitsunobu, seguido por metátese de fecho de anel (RCM) deu 10 e subsequente remoção do grupo TBS deu MGSTA-1. O tratamento de 9 com tetrabrometo de carbono na presença de trifenilfosfina suportada em polímero em diclorometano deu o brometo alilico 11 [9]. A reacção subsequente de β-cetosulfona 12 na presença de DBU, seguida por remoção redutiva do grupo sulfona deu 13. Anel de fecho de metátese e remoção do grupo TBS deu MGSTA-2. A tiolactona foi preparado a partir de 14, que foi em primeiro lugar convertido no ácido tio 15 utilizando o reagente de Lawesson [28]. Formação do tiolactona sob condições de Mitsunobu, RCM e remoção TBS deu MGSTA-3. O TBS protegido macroketone 16 foi preparado a partir de 9, tal como descrito anteriormente [9]. Formação do éter enólico TMS foi conseguida de uma maneira regio-selectiva e subsequente oxidação com Pd (OAc)

2 deu o α, β-insaturado macroketone 17. Finalmente, a remoção do grupo protector TBS deu macroketone insaturado MGSTA-6.

Reagentes e condições: (a) ácido 5-hexenóico, Ph

3P, DIAD, PhCH

3, ta, 3 h, 69%; (B) Grubbs 2

nd, PhCH

3, refluxo, 25 min, 68%; (C) HF. Py, THF, ta, 18 h, 61%; (D) CBr

4, Ph

3P ligado ao polímero, CH

2 Cl

2, rt, 50 min; (E) 12, DBU, PhCH

3, em seguida, 11, RT, 1,5 h; (F) Na /Hg, MeOH, ta, 3 h, 51% em três passos; (G) Grubbs 2

nd, PhCH

3, refluxo, 15 min, 99%; (H) HF. Py, THF, ta, 38h, 84%; (I) reagente de Lawesson, CH

2Cl

2, MW, de 100 ° C, 10 min; (J) 9, Ph

3P, DIAD, PhCH

3, rt, 15h, 42%; (K) Grubbs 2

nd, PhCH

3, refluxo, 15 min, 88%; (L) HF. Py, THF, ta, 18 h, 85%; (M) TMSCl, LHMDS, THF, 0 ° C, 2h; (N) de Pd (OAc)

2, CH

3CN, ta, 3 h, 64% em dois passos; (O) HF. Py, THF, ta, 18 h, 90%.

ensaio de viabilidade celular (MTT-ensaio)

A viabilidade celular (actividade metabólica das células viáveis) foi quantificada pelo ensaio de MTT. As células foram semeadas em placa de 96 poços (Nunc Inc., Dinamarca) a uma concentração de 1 × 10

4 células por poço. Quando as células atingiram 60-70% de confluência, o meio foi substituído por meio contendo FBS a 10% e seis vários análogos migrastatin (MGSTA-1 a 6) nas concentrações de: 1, 10 ou 100 uM. As culturas foram incubadas durante 24 horas. Em seguida, as células foram incubadas com 0,5 mg /ml de MTT tetrazólio de sal diluído em meio RPMI livre de fenol vermelho-1640 (Sigma Aldrich) durante 4 horas a 37 ° C. Para completar a solubilização dos cristais de forma zan, 100 ul de DMSO (sulfóxido de dimetilo, Sigma Aldrich) foram adicionados a cada poço. A viabilidade celular foi quantificada por medição da absorvência fotométrica a 570 nm num leitor de placas multi-poços (Infinito 200 PRO Tecan ™, TECAN, Suíça). Todas as amostras foram analisadas em triplicado, cada experimento foi realizado três vezes (n = 9).

cultura celular em uma membrana basal reconstituída (Matrigel)

As células cancerosas foram tratados com tripsina e ressuspensas em meio de cultura. Cada poço das Lab-Tek slides de cultura de 8 câmaras (Nunc Inc., EUA) foi revestida com 25 uL de factor de crescimento reduzida Matrigel (BD Biosciences) e as lâminas foram deixados solidificar durante 30 minutos. a 37 ° C. As células foram, então, plaqueadas a uma concentração de 10

4 células /mL em meio contendo análogo migrastatin ou meio com a adição de DMSO (veículo do fármaco). O crescimento de células em Matrigel foi observada todos os dias sob microscópio de contraste de fase (Olympus IX 70 Optical Co., Alemanha). O experimento foi realizado três vezes (n = 3).

In vitro

ferida ensaio de cura (teste de coçar)

O ensaio zero foi realizado para avaliar a influência de migrastatin análogos em mamário canino motilidade celular de carcinoma. As células foram semeadas em alta densidade em pratos de Petri de 600 mm (Corning-Costar, Cambridge, EUA). Após 24 horas, o meio foi removido e substituído com meio contendo FBS a 10% e uma de seis análogos migrastatin (MGSTA-1 a 6) ou DMSO (controlo). A monocamada foi ferido por arranhar a superfície: o mais uniformemente e em linha reta quanto possível, com uma ponta de pipeta (1000 mL), pelo menos três vezes. As imagens de células que invadem o zero foram capturados em pontos de tempo indicados (0, 4, 6, 8 e 24 horas) através de microscopia de contraste de fase (IX 70 Olympus Optical Co., Alemanha). As imagens foram analisadas utilizando um analisador de imagem assistida por computador (Análise de Imagem Olympus Microimage ™, software versão 4.0 para Windows, EUA). A taxa de migração foi expressa como percentagem de fecho zero e foi calculada como se segue:% de encerramento zero = ab /A, em que (a) é a distância entre os bordos da ferida, e (b) é a distância que se manteve isento de células durante a migração celular para fechar a ferida [29].

os valores são apresentados como meio de três campos de feridas independentes de três experimentos independentes (n = 9).

ensaio de migração Trans-well

ensaio de migração celular câmara de Boyden foi realizada utilizando o BD Falcon ™ FluoroBlock ™ 24-Multiwell placas de inserção (8 micron de tamanho de poro) (BD Biosciences, EUA). Em primeiro lugar, as células (1 x 10

5) foram suspensas em meio livre de FBS e adicionado às câmaras apicais de um inserto placas (500 ul). Em seguida, 750 ul de quimioatractor (10% de FBS) foi adicionado às câmaras basais. análogos Migrastatin (MGSTA-5 ou MGSTA-6 a 100