Abstract

células tumorais circulantes (CTCs) surgiram como uma potencial biomarcador para o diagnóstico, prognóstico, tratamento e vigilância de câncer de pulmão. No entanto, a detecção de CTC não é apenas caro, mas sua sensibilidade também é baixa, o que limita seu uso e a recolha de dados robustos sobre o significado de CTCs no câncer de pulmão. Nosso objetivo foi buscar variáveis ​​clínicas que aumentam a previsão de CTCs em pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). As amostras clínicas e dados patológicos foram coletados de 169 pacientes com NSCLC. CTC foram detectadas por meio de marcadores tumorais CellSearch e foram detectadas utilizando o ensaio de Luminex xMAP. Análises univariada revelou que histologia, estágio do tumor, tamanho do tumor, invasão, o grau do tumor e antígeno carcinoembrionário (CEA) foram associados com a presença de CTCs. No entanto, o nível de CTC não estava associada com o grau de envolvimento ganglionar (N) ou marcadores de prognóstico tumoral Ki-67, CA125, CA 19-9, CYFRA21-1, e SCCA. Usando análise de regressão logística, descobrimos que a combinação de CTCs com marcador tumoral CEA tem uma melhor previsão de doença. pacientes estágio NSCLC avançado com CEA elevado tiveram maior número de CTCs. Estes dados sugerem um modelo de previsão útil pela combinação de CTCs com CEA sérico em pacientes com NSCLC

Citation:. Chen X, Wang X, Ele H, Liu Z, Hu JF, Combinação de circulação Células Tumorais Li W (2015) com soro Antígeno carcinoembrionário Melhora de predição clínica de Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 10 (5): e0126276. doi: 10.1371 /journal.pone.0126276

Editor do Academic: Jeffrey Chalmers, The Ohio State University, Estados Unidos

Recebido: 01 de novembro de 2014; Aceito: 31 de março de 2015; Publicado em: 21 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo California Institute of Regenerative Medicine (CIRM) (RT2-01942), National Natural Science Foundation da China (CN) (# 81071920, 81372835 #, # . 81272294, # 31430021), Jilin Provincial Departamento de ciência e Tecnologia (11ZDGG003, # 20.120.720) e Nacional de Saúde e Comissão de Planejamento Familiar da República Popular da China (CN) (# 2001133)

Conflito de interesses: os os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. cancro do pulmão de não-pequenas células (NSCLC) é responsável por 75-80% dos casos de câncer de pulmão. NSCLC geralmente não é diagnosticada até que a doença atingiu o estágio avançado, levando a baixas taxas de sobrevivência, com uma taxa de sobrevida em 5 anos de 20% [1,2]. Um número de biomarcadores têm sido utilizados na prática clínica como marcadores de prognóstico em doentes com NSCLC. Estes incluem o antigénio carcinoembrionário (CEA), antigénio do cancro (CA) -199, CA-125, antígeno de carcinoma de células escamosas (SCC-Ag), e citoqueratina-19 fragmentos de antigénio 21-1 (CYFRA21-1). Níveis elevados desses marcadores têm sido associados com mau prognóstico [3-12]. Entre eles, CEA e Cyfra 21-1 são os marcadores tumorais mais sensíveis em NSCLC [13,14].

células tumorais circulantes (CTCs) são células tumorais que deixam o local do tumor primário e entram na corrente sanguínea, onde eles podem se espalhar para outros órgãos. CTC podem ser identificados no sangue periférico por coloração histológica para marcadores epiteliais e específicos do cancro. Atualmente, o único kit de detecção aprovado por os EUA Food and Drug Administration (FDA) é o sistema CellSearch (Veridex, NJ), que utiliza anticorpos específicos para identificar e quantificar CTCs em uma amostra de sangue de 7,5 mL.

Para data, o papel dos CTC em NSCLC permanece obscura. Por exemplo, enquanto alguns estudos correlacionam CTCs com mau prognóstico [15-18], outros não encontraram correlação [19]. Uma recente meta-análise de 20 estudos com um total de 1576 pacientes revelou que a presença de CTC foi associado com prognóstico pobre em doentes com NSCLC [20]. De nota, o valor prognóstico de CTCs permanece controverso. Estudos anteriores relataram que cerca de 30% de doentes com NSCLC, pelo menos, uma CTC por 7,5 ml de sangue, e cerca de 15% de doentes com NSCLC ter cinco ou mais CTC por 7,5 mL de sangue, com níveis mais elevados CTC nos doentes com metástases distantes [ ,,,0],15, 21-22]. Em adição à sua baixa sensibilidade, o alto custo de detecção CTC tornou difícil a tornar-se um teste clínico de rotina para NSCLC, especialmente em populações chinesas.

Para conseguir uma melhor compreensão da importância da CTC em NSCLC, nós iniciamos um estudo prospectivo instituição, único para caracterizar as CTCs em pacientes com NSCLC e examinou a relação entre CTC e outros fatores clínicos. Nosso objetivo foi testar a hipótese de que a presença de CTCs em combinação com biomarcadores tumorais poderia prever melhor capacidade de invasão do tumor em pacientes com NSCLC.

Materiais e Métodos

População do estudo

Este estudo foi realizado no primeiro hospital da Universidade de Jilin (Changchun, Jilin, China). O estudo foi aprovado pelo Comitê de o primeiro hospital da Universidade de Medicina de Jilin de Ética, e conduzida de acordo com a Declaração de princípios de Helsínquia. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes inscritos antes de qualquer intervenção. Os pacientes com diagnóstico histológico de CPNPC eram elegíveis. Antes do tratamento, Tumor metástase (TNM) (7ª edição) foi avaliada por Computated Tomography (TC) [23].

análise CTC

O sistema CellSearch (Veridex, NJ, EUA) foi utilizado para quantificar CTC em 7,5 mL de amostras de sangue tiradas dos pacientes dentro de sete dias antes do tratamento (definido como linha de base). Amostras de sangue foram coletadas em 10 mL CellSave (Veridex) tubos de conservantes, armazenado à temperatura ambiente, e processado dentro de 96 horas após a colheita, de acordo com as instruções do fabricante. CTC são definidas como células com rodada a morfologia oval, A, 6-diamidino-2-fenilindole, 4 ‘(DAPI) núcleo positivo de 4 uM ou superior, a coloração citoplasmática positiva para citoqueratinas (CK-8, CK-18, e CK -19), e a ausência de expressão de CD45.

análise marcador tumoral

os soros foram separados a partir de uma amostra de 2 mL de sangue coagulado a partir de cada paciente. Um ensaio de Luminex xMAP (Luminex, Austin, TX, EUA) foi utilizado para detectar os marcadores tumorais antigénio carcinoembrionário (CEA), antigénio do cancro (CA) -199, CA-125, antígeno de carcinoma de células escamosas (SCC-Ag), e citoqueratina -19 fragmentos de antigénio 21-1 (CYFRA21-1). O nível de cada marcador foi comparado com os valores de 5 ng /ml de CEA, 35 U /mL de CA19-9, 35 U /ml de CA 125, 1,5 ng /mL SCC, e 5 ng /mL CYFRA21-1 normais de referência. Devido ao limite do volume de soro, apenas 109 pacientes tiveram seu soro analisadas para níveis de CEA, 70 pacientes para CA125, 76 pacientes para CA 19-9, 107 pacientes para CYFRA21-1, e 75 patentes de SCCA.

espécime Patologia e imuno-histoquímica

amostras de tumor foram obtidas de pacientes com estágio IIIB ou IV NSCLC para análise patológica. amostras de tumores foram fixados em formalina, embebidos em parafina, cortados em secções de 4 mm, e aposta em lâminas de vidro. A proliferação celular foi avaliada por imuno-histoquímica utilizando um anticorpo monoclonal contra Ki-67 (MAIXIN-BIO Inc., China). Ki-67 de coloração em menos do que 25% de células foi considerado negativo, ao passo que a coloração em 25% das células foi considerada Ki-67 positivo [24].

A análise estatística

As variáveis ​​individuais foram avaliadas por análise univariada usando o teste qui-quadrado. razões de risco foram calculados para cada variável para avaliar o valor preditivo para CTCs. A análise de regressão logística foi usada para avaliar as relações entre a contagem CTC e os dados clínico-patológico. Todas as análises foram realizadas usando o software v19.0 SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA). Para todas as análises, um

p

-valor menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

características do paciente

Cento e sessenta e nove pacientes com NSCLC foram recrutados entre Julho de 2012 e Janeiro de 2014, e suas características foram registradas (Tabela 1). CTC foram quantificadas a partir de uma amostra de sangue de 7,5 ml para cada paciente (Fig 1). A mediana de duração de seguimento foi de 1,1 anos. Assim, a análise de sobrevivência não seria realizado nesta população de coorte. No geral, a previsão de NSCLC de CTCs foi relativamente baixa em nossas amostras de coorte. Em um total de 169 pacientes com NSCLC, apenas 40 (23,7%) pacientes apresentaram detecção de CTC positivo ( 1 por 7,5 mL de sangue), em um acordo semelhante com o relatado em populações ocidentais [15, 21-22]

.

selecção imunomagn�ica positivo com anti-EpCAM Ab foi seguido por confirmação morfológica com coloração para citoqueratinas (citoplasma), DAPI (núcleo) e CD45 (negativo).

Curiosamente, o nosso amostras de coorte exibiu uma percentagem relativamente baixa de pacientes do sexo feminino (33,7%) em comparação com os países ocidentais, onde NSCLC é mais prevalente em mulheres [1-2]. Poderia ser possível que as diferenças de etnia e etiológicos fatores de pacientes com NSCLC pode explicar esta discrepância. Por exemplo, a taxa de fumar é relativamente baixo em mulheres chinesas.

A análise univariada da CTC conta com dados clínicos e patológicos

Em análises de correlação, não houve associação significativa do CTC conta com sexo, idade, tabagismo e localização do tumor primário (Tabela 2). No entanto, o tipo histológico foi positivamente associado com o CTCs (p 0,05 para CTC limiares ≥ 1 e ≥ 2CTC /7,5 mL de sangue). Nenhum paciente na fase I NSCLC tinha CTC ≥ 1 CTC /7,5 ml de sangue, enquanto 15,8% (6/38) dos pacientes do estágio II-III-A e 29,1% (34/117) de estágio paciente IIIB-IV foram encontrados para ter CTC ≥ 1 CTC /7,5 ml de sangue. TNM clínico foi positivamente associado com o CTCs, quando foi dividido em fase I, fase II, fase III e IV fase (p 0,05 para CTC limiares ≥ 1 e 2 CTC /7,5 mL de sangue). Mesmo quando o estadiamento TNM clínico foi dividido em estágio I-III-A e III-B-IV, permaneceu associado com CTCs (p 0,05 para CTC limiares ≥1, 2 e 5 CTC /7,5 mL de sangue).

Para entender melhor, se o tamanho do tumor, invasão ou linfática e metástases à distância têm um impacto sobre CTC contar, a relação entre CTCs e estádio TNM foi também avaliada. Descobrimos que 28,1% (9/32) dos T1, 12,1% (8/66) de T2, 29,4% (5/17) de T3, e 34,9% (15/43) dos pacientes T4 teve CTCs ≥ 1 CTC /7,5 mL de sangue, que constitui uma significativa correlação entre o tamanho do tumor e a presença de pelo menos uma CTC /7,5 mL de sangue. No entanto, não houve correlação entre outros limiares contagens CTC e o tamanho do tumor. Da mesma forma, não houve relação entre qualquer limite de contagem CTC e linfonodos metástases. No entanto, metástases à distância foi correlacionada com a CTC conta a limiares de ≥ 1, 2 e 5 CTCs /7,5 ml (p 0,05).

A análise multivariada demonstra que CTCs se correlaciona com a doença em estágio avançado

Para aumentar o valor de predição de CTCs no NSCLC, foi realizada análise multivariada incluem idade, sexo, história de tabagismo, histologia, clínico-teste e a localização do tumor primário. Descobrimos que os pacientes com doença em estágio IIIB-IV tiveram uma incidência elevada de CTCs comparação com aqueles com estágio I-III-A. (P 0,05; Tabela 3).

Associação dos CTC conta com Ki-67 e grau tumoral em NSCLC pacientes

O exame anatomopatológico indicou que os tumores pouco diferenciados foram correlacionados com maior contagem CTC (CTCs ≥ 2 /7.5 sangue mL, p 0,05, Tabela 4), em comparação com os tumores moderadamente diferenciados. Pacientes com tumores Ki-67-positivas parecem ter maior CTC conta, mas esta não atingiu significância estatística.

contagem de CTCs correlacionam com CEA

A marcadores tumorais CEA, Cyfra21- 1, CA19-9, CA-125, e SCC-Ag foram também analisadas em doentes com NSCLC. Cada marcador sérico foi comparado com o CTC independentemente conta para identificar potenciais relações. O único marcador encontrado para ser associado com CTC foi CEA no soro. CEA sérico elevado foi associado positivamente com o CTC conta nas soleiras ≥ 1, 2 e 5 CTCs /7,5 mL de sangue, em comparação com os níveis de CEA normais (Tabela 5).

Além disso análise estatística foi realizada para investigar se havia alguma correlação entre a presença de CTCs, estadiamento TNM, e concentração sérica de CEA. Após o ajuste para o estadiamento TNM (I-III e IV IIIB-), CEA no soro ainda estava positivamente associado com a presença de CTC (OR IC95% = 4.263 [1,194-15,226], p = 0,026.

Serum CEA aumenta o poder de predição de CTCs no tumor agressividade

a detecção de CTCs em nossos pacientes com NSCLC foi relativamente baixa, com apenas 23,7% dos pacientes que apresentam . 1 CTC por 7,5 mL de sangue Nós, portanto, propôs a examinar se disso de uma variável clínica barata aumentaria seu poder de previsão de doença. para isso, utilizou-se análise de regressão logística para analisar a capacidade de CTCs em combinação com CEA sérico na previsão NSCLC agressividade, incluindo o estadiamento TNM (I-IIIA e IIIB- IV), Ki-67 de nível, e o grau do tumor. como pode ser visto na Tabela 6, verificou-se que a capacidade de predição de estadiamento tarde e Ki-67 foram aumentados no grupo com o modelo CTC e CEA combinada em comparação com o modelo CTC.

Discussão

células tumorais circulantes (CTCs) têm sido estudadas como potenciais biomarcadores para melhorar o diagnóstico NSCLC, prognóstico, tratamento e vigilância. No entanto, a nosso conhecimento, nosso estudo é o primeiro a utilizar o sistema de CellSearch para avaliar CTCs em uma grande coorte de pacientes com NSCLC chinesa.

Na análise univariada, descobrimos que CTC conta em pacientes com NSCLC foram associados com fase tardia, adenocarcinomas, o grau do tumor pouco diferenciado, e níveis elevados de CEA. Usando análise de regressão logística, descobrimos que o modelo de CTCs e CEA combinados tiveram uma melhor previsão para a agressividade do NSCLC (estadiamento tarde e Ki-67). Os nossos dados sugerem que as variáveis ​​clínicas, particularmente CEA no soro, pode melhorar o poder de previsão CTC em doentes com NSCLC

Estudos anteriores relataram que 30% dos pacientes apresentam . 1 CTC por 7,5 ml de sangue, conforme medido por CellSearch, e que 15% têm cinco ou mais CTCs [15,21-22]. Em nosso estudo, 23,7, 11,8 e 7,7% dos pacientes demonstraram, pelo menos, 1, 2 e 5 CTCs /7,5 ml de sangue, respectivamente. Enquanto estes níveis são um pouco menores do que aqueles em estudos previamente relatados, diferentes populações de pacientes pode explicar essas discrepâncias. Em particular, estudos anteriores incluíram populações heterogéneas de metastático e operável NSCLC.

fatores prognósticos comuns em NSCLC incluem Ki-67 positividade e grau do tumor. [25-28]. o grau do tumor está correlacionada com os níveis de apoptose e a proliferação celular em adenocarcinomas do pulmão, com uma troca mais rápida de células tumorais em tumores pouco diferenciados [29]. Consistente com este conceito, descobrimos que as contagens elevadas CTC foram associados com tumores pouco diferenciados. Em particular, um grau do tumor pouco diferenciado foi significativamente associada com contagens de CTC de ≥ 1 ou 2 CTC /7,5 mL de sangue. Além disso, elevada coloração Ki-67 no tumor primário também foi associado com alta CTC conta a todos os limiares, embora estes dados não foram estatisticamente significativas, devido ao pequeno tamanho da coorte. A relação entre proliferação e CTCs em NSCLC vai exigir um estudo mais aprofundado com base numa coorte maior.

Estudos anteriores avaliaram a relação entre CTCs e marcadores tumorais em tumores sólidos [30-32]. No entanto, os dados de pacientes com câncer de pulmão ainda faltam, principalmente na população chinesa. Foi investigada a relação entre o CTC e marcadores tumorais NSCLC comumente usados, incluindo o CEA, CA19-9, CA-125, SCC, e CYFRA21-1. Curiosamente, os nossos dados mostram que os níveis de soro de CEA estão correlacionados com o CTC conta em doentes com NSCLC. CEA, uma glicoproteína produzida normalmente durante o desenvolvimento fetal, está presente a um nível muito baixo no soro de adultos saudáveis. Níveis séricos elevados de ACE estão associados com o desenvolvimento, curso, fase e prognóstico do NSCLC [4-5, 12]. Os dados do presente estudo sugerem que a combinação do CTC e as contagens de soro de CEA foi associada com NSCLC mais agressiva. No entanto, não está claro por que outros biomarcadores séricos não têm associações semelhantes com CTCs em pacientes com NSCLC. Estudos futuros, com amostras maiores são necessários para determinar se era útil incluir estes marcadores no modelo de previsão.

Apesar dos progressos em anos recentes, a tecnologia CellSearch ainda tem muitas limitações. Detecção dos CTC pelo sistema CellSearch depende de marcadores de superfície celular, tais como EpCAM. Deste modo, pode potencialmente perca CTC que não expressam o antigénio alvo [33-34]. Do mesmo modo, as células de tumores agressivos perder marcadores epiteliais devido à epitelial-mesenquimal transição (EMT) e não será detectado por CellSearch. Deve notar-se que o campo é afastando-se do CTC conta a caracterização molecular e funcional do CTC e CTC utilização de líquidos como biópsias para testar se certos pacientes têm maior probabilidade de beneficiar do centro terapias biológicas [35-36]. Por exemplo, a caracterização fenotípica dos CTC pela inclusão de um gene marcador “específico de tumores”, como o CEA por RT-PCR, tem uma vantagem de aumentar a sensibilidade.

O ensaio CellSearch é muito dispendiosa na China. O achado do nosso estudo pode sugerir um método de baixo custo para pacientes com NSCLC de decidir quem deve executar para este ensaio caro. marcadores tumorais são sempre utilizados como biomarcadores para o diagnóstico precoce, a eficácia do tratamento e prognóstico em NSCLC [4-5, 12, 37-38]. Como CEA no soro é associado com CTC, pode ser possível determinar a CellSearch ensaio para os doentes com NSCLC, que são CEA-positivas. Alternativamente, podemos explorar se os pacientes com NSCLC com tanto CTC positivo e elevado CEA são diferentes de outros subtipos em resposta terapêutica.

Deve-se ressaltar que este estudo incluiu apenas 169 pacientes com NSCLC na análise de correlação. Além disso, devido ao limite de amostras de soro, não foi possível completar todos os ensaios de biomarcadores para cada paciente, levando a baixo poder estatístico para algumas variáveis ​​em subgrupos estratificados. Esperamos que recolha contínua de biópsias de tumores a partir deste projecto em curso vai de força nossos achados.

Em resumo, um método simples e confiável para a identificação de pacientes com NSCLC com CTCs teria grande valor prognóstico. Descobrimos que a presença de CTC é associado com a fase tardia e tumores pouco diferenciados, adenocarcinomas, e elevados níveis de CEA. A combinação do CTC conta com valores séricos de CEA foi associada com mais agressividade do tumor em doentes com NSCLC. A longo prazo de seguimento serão necessários para determinar o significado ainda maior de CTCs no NSCLC.