Abstract

Para investigar o significado prognóstico da

expressão e quimioterapia TGFβR2

em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) chinês,

TGFβR2

expressão NSCLC foi analisada

in silico

usando o banco de dados Oncomine e, posteriormente, analisados ​​com RT-PCR quantitativo em 308 biópsias NSCLC, 42 dos quais foram emparelhados com os tecidos não neoplásicas adjacentes. Nossos resultados mostram que

TGFβR2

expressão foi também aumentou em biópsias NSCLC relativos a amostras de tecido normal e correlacionados com mau prognóstico.

TGFβR2

expressão também foi significativamente correlacionada com outros parâmetros clínicos tais como a diferenciação do tumor, invasão da membrana do pulmão, e quimioterapia. Além disso, a sobrevida global (OS) e sobrevida livre de doença (DFS) foi aumentada em pacientes com baixa

TGFβR2

expressar NSCLC e que tinham sido submetidos a quimioterapia. Assim, alta expressão de

TGFβR2

é um fator de risco significativo para a diminuição OS e DFS em pacientes com NSCLC. Assim,

TGFβR2

é um potencial biomarcador tumor de prognóstico para a quimioterapia

Citation:. Han Y, Jia C, Cong X, Yu F, Cai H, Fang S, et al. (2015) a expressão aumentada de

TGFβR2

está associada com a evolução clínica de células não pequenas do pulmão pacientes com câncer tratados com quimioterapia. PLoS ONE 10 (8): e0134682. doi: 10.1371 /journal.pone.0134682

editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, Estados Unidos

Recebido: 13 de maio de 2015; Aceito: 24 de junho de 2015; Publicação: 07 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Han et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte por doações do National Science Foundation Natural da China (81371595, 81372175, 81301993, 81472501, 81201535, 81472202 e 81302065), Nature Science Foundation de Shanghai ( 12ZR1436000), Xangai Municipal de Ciência e Tecnologia da Comissão (14441901300, 14DZ1940606), Shanghai Comissão Municipal de Saúde e Planejamento Familiar (XBR2013112, 2013SY036) e Juventude Innovation Promotion Association, Academia chinesa de Ciências (Y219J11311).

Conflito de interesses os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Lung carcinoma é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo, respondendo por 1,37 milhões de mortes por ano [1-3].. cancros do pulmão de células não pequenas (NSCLC) são o tipo mais comum de câncer de pulmão primário, respondendo por quase 80% do carcinoma do pulmão [4]. Apesar de avanços significativos têm ocorrido em nossa compreensão do processo da doença durante as últimas décadas [5,6], a estratégia de tratamento principal ainda é a ressecção cirúrgica, quimioterapia e radioterapia [7-9]. No entanto, mesmo no caso de ressecção completa, efeito curativo não é satisfatória e pacientes com NSCLC ainda enfrentam o risco de recorrência e metástase [10,11].

A esperança para a análise molecular completa de cânceres humanos é, finalmente, a melhorar a gestão dos pacientes. Avanços em genômica e proteômica têm gerado muitos marcadores candidatos com potencial valor clínico [12]. Portanto, se existem biomarcadores que funcionariam como fatores preditivos para o carcinoma de pulmão ou ser usado no processo de tomada de decisão para o manejo clínico de pacientes está atualmente sob investigação como opções para o avanço do tratamento. Além disso, a compreensão das características moleculares dos cancros do pulmão iria ajudar no desenvolvimento de terapia direcionada.

Componentes do factor de crescimento transformante-beta (TGF-β) da família são frequentemente alterados no desenvolvimento de vários cancros humanos. TGF-β é uma citoquina pleiotrópica, que actua como um promotor de supressor de tumor ou um tumor dependendo do microambiente celular [13]. TGF-beta tipo-2 receptor (TGFβR2) é o receptor de ligação a ligando para todos os membros da família TGF-β [14-16]. sinais de TGF-p são mediados por um complexo activado de TGFβR1 TGFβR2 e [17]. O ligando a TGF-β liga-se principalmente ao TGFβR2 na membrana do plasma, resultando na formação de um complexo entre TGFβR1 e TGFβR2. TGFβR2 fosforila TGFβR1, e ativado TGFβR1 fosforila alvos a jusante, Smad2 e Smad3. Fosforilada Smad2 e Smad3 formar um complexo com Smad4, que transloca para o núcleo e regula a expressão do gene alvo [18,19]. Portanto, anormalidades em qualquer membro do TGF-β ou familiar Smad muitas vezes profundamente perturbar a via de sinalização TGF-beta [20,21].

Se uma assinatura genética pode prever o resultado clínico de NSCLC, incluindo prognóstico e resposta à quimioterapia, permanece obscura. Aqui, a base de dados Oncomine foi usado para revelar a expressão diferencial de TGFβR2 especificamente em NSCLC. A expressão de TGFβR2 foi posteriormente validada por PCR em tempo real em biópsias NSCLC de uma coorte de pacientes chineses e significado prognóstico foi avaliada.

Materiais e Métodos

Ética declaração

o estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Jilin (Jilin, China). Cada participante desde que o seu consentimento informado por escrito para participar neste estudo e os comitês de ética aprovar o processo de aprovação.

Set-up do servidor para a sobrevivência on-line cálculo

TGFβR2

mRNA foi investigada a expressão em amostras de tecido de NSCLC (N = 187) na base de dados através da Plataforma TCGA Oncomine (https://www.oncomine.org). Os dados foram recuperadas usando termos de pesquisa “

TGFβR2

” e “NSCLC” e “mRNA”.

O valor prognóstico da

gene TGFβR2

foi avaliada com a Kaplan Meier plotter, uma ferramenta de meta-análise com base na avaliação biomarcador silico, que avalia o efeito dos genes sobre a sobrevivência em pacientes com câncer (https://www.kmplot.com/lung) [22,23]. Cada média foi calculada eo melhor limiar de realização foi usado como o corte final em uma análise de regressão uni e Cox. Histologia, grau, estágio, sexo e tabagismo história foram usados ​​na análise multivariada. Um gráfico de sobrevida de Kaplan-Meier e as taxas de risco com intervalo de confiança de 95% eo log rank

P valor

foram calculados. Significância foi estabelecido em

P Art 0,05.

Aquisição de amostras clínicas

amostras frescas de tecido de pacientes com NSCLC submetidos a ressecção cirúrgica entre 2008 e 2012 foram obtidos a partir do banco de tecidos, Universidade de Jilin (Jilin, China). As amostras incluíram tumor e tecidos emparelhados não cancerosos adjacentes (n = 42), bem como um grande grupo de biópsias NSCLC individuais (n = 266). Todos os tumores foram estadiados segundo a 7ª edição do sistema de estadiamento AJCC TNM para NSCLC, e dados de pacientes coletados até 30 de abril de 2014 foram incluídos para todos os pacientes. Os dados clínicos gravados incluídos as características do paciente (por exemplo, sexo, idade), as características do tumor (por exemplo, o diâmetro, a metástase do nó de linfa, subtipos histológicos, invasão vascular, e diferenciação do tumor), a sobrevida global (OS) e sobrevida livre de doença (DFS) ,

TGFβR2

status de expressão, e quimioterapia

para a análise, os pacientes foram estratificados de acordo com idade, ≥ 60 ou 60 anos. O tamanho do tumor foi definido como o diâmetro médio do tumor (DMT, definido como a média geométrica dos quatro diâmetros na tomografia computadorizada), e os tumores foram agrupados de acordo com o tamanho, ≥ 5 cm, e 5 cm. O acompanhamento foi realizado por telefone ou correspondência direta. O tempo para a reincidência do tumor ou morte foi confirmada pelo doente ou da família, por gravação médica, ou pela ficha de segurança social. A sobrevida global (OS) foi calculado em meses a partir da data do diagnóstico para a hora da morte, independentemente da causa. Sobrevida livre de doença (DFS) foi definido como o período a partir da data inicial de diagnóstico com o tempo de progressão do tumor por tomografia computadorizada, ou para a hora da morte devido à doença.

RNA Extração

o ARN total foi extraído a partir de NSCLC e tecido normal com o reagente de Trizol, de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de RNA foi medida num espectrofotómetro e a qualidade de todas as amostras de ARN foi avaliada por electroforese em 1,5% gel de agarose desnaturante.

RT-PCR quantitativo

Para quantitativa PCR em tempo real (qRT -PCR), foi sintetizado ADNc a partir de ARN total (10 ng), e reacções quantitativas de PCR foram realizadas com o kit de PCR Taqman Universal. GAPDH foi usada como um controlo interno. O 2 método

-δδCT foi utilizado para quantificar os níveis de expressão

TGFβR2

.

A análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas com estatísticas IBM SPSS para Windows, versão 19.0. A expressão de

TGFβR2

foi apresentada como a média ± desvio padrão. Um teste T independente foi utilizado para examinar as diferenças entre dois grupos, e um teste do qui-quadrado foi utilizado para avaliar as diferenças nas taxas entre os grupos. As curvas de Kaplan-Meier foram utilizadas para determinar a sobrevida global dos vários grupos, e os resultados foram comparados com um teste de log-rank. As análises de sobrevivência uni e multivariada foram baseados em um modelo de regressão de Cox, e este modelo foi usado para identificar quais os fatores independentes tinham conjuntamente efeitos significativos sobre a sobrevivência.

P Art 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

Expressão da TGFβR2 usando a plataforma de análise de sobrevivência on-line

TGFβR2

expressão de mRNA em câncer vs. tecidos normais foi investigada utilizando o banco de dados Oncomine (Fig 1A). Esta análise revelou que

TGFβR2

foi sobre-expresso em tecidos de tumor, em comparação com o tecido normal correspondente (dobre mudança = 1,99;

P

0,001).

A , os níveis de expressão de

TGFβR2

no câncer vs. tecidos normais derivados do banco de dados Oncomine. B, análise de sobrevida realizada com gráficos de Kaplan-Meier com base em

TGFβR2

expressão.

O valor prognóstico da expressão do

TGFβR2

foi avaliada com a Kaplan Meier plataforma de plotter. Os resultados demonstraram que o prognóstico era pior para os pacientes com adenocarcinoma de pulmão em que

TGFβR2

expressão era 1,99 vezes maior do que em tecidos normais (HR = 1,28 IC (95%, 1,01-1,63),

P

= 0,038). Estes resultados indicam que a alta expressão de

TGFβR2

( 1,99 vezes) foi associado a um mau prognóstico em adenocarcinoma de pulmão (Fig 1B)

expressão TGFβR2 em NSCLC e tecido pulmonar normal

Para validar esses achados,

TGFβR2

níveis de mRNA foram examinados no tumor (n = 308) e os tecidos não cancerosos adjacentes (n = 42) de uma coorte de pacientes com NSCLC chinesa por qRT-PCR. Os resultados demonstraram que os

TGFβR2

níveis de expressão foram significativamente maiores em biópsias de tumores NSCLC (2,46 ± 0,42) em relação aos tecidos adjacentes não neoplásicas (1,01 ± 0,06). Essa diferença entre os tecidos tumorais e normais foi estatisticamente significativa (

P

= 0,001; Tabela 1).

As relações entre expressão TGFβR2 e as características clínicas

As associações entre

TGFβR2

expressão e características clínicas individuais foram investigados. Os resultados demonstraram que nestes 308 casos de NSCLC,

TGFβR2

níveis de expressão foram positivamente correlacionados com diferenciação tumoral (

P

= 0,029) ea invasão da membrana do pulmão (

P

= 0,045), bem como quimioterapia (

P Art 0,001; Tabela 2) .No entanto, não houve associação entre o

TGFβR2

expressão e paciente sexo, idade, história de tabagismo, lymph- metástase, histologia, invasão vascular, estágio TNM, ou o diâmetro do tumor (

P Art 0,05).

curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram plotados de modo a avaliar o valor prognóstico destas características clínicas /biológicos para OS. O acompanhamento médio foi de 34,3 meses (intervalo de 14,3 a 79,3 meses). Os resultados das análises univariadas são apresentados na Tabela 2. Como esperado, houve uma associação significativa entre o menor OS e fatores prognósticos clássicos, como linfonodo metástases (

P

= 0,026), invasão da membrana do pulmão (

P

= 0,034), e o tamanho do tumor (≥ 5 cm;

P

= 0,033). Além disso, os pacientes tratados com quimioterapia apresentado um aumento significativo do OS (

P

0,001). Assim, diminuiu significativamente OS foi associado com pacientes que não haviam sido submetidos a quimioterapia ou tinham metástase linfática, invasão da membrana do pulmão, ou aumento do tamanho do tumor (≥ 5 cm).

High expressão de TGFβR2 era um marcador de prognóstico para NSCLC sobrevida do paciente

Para determinar se outros factores clínicos podem afetar o prognóstico de NSCLC, análise de sobrevida univariada, estratificada por cada um dos fatores clínicos (incluindo sexo, idade, invasão vascular, tamanho do tumor, invasão da membrana do pulmão, linfonodo metástase, estadiamento TNM, a diferenciação do tumor, a história de fumar, e expressão

TGFβR2

), foi realizada com Kaplan-Meier. Os resultados da análise de sobrevivência de Kaplan-Meier demonstrou que o prognóstico era pior em pacientes com alta expressão de

TGFβR2

. Expressão de

TGFβR2

foi significativamente associada com a diminuição OS (

P

= 0,009; Fig 2A) e DFS (

P

= 0,003; Fig 2B) em pacientes com NSCLC. análise de classificação para avaliar a influência de metástases do nó de linfa e tamanho do tumor no prognóstico de pacientes com NSCLC, curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram plotados e log foi executada. Linfonodo metástases foi significativamente associada com menor OS (

P

= 0,026; Fig 2C) e DFS (

P

= 0,002; Fig 2D) em NSCLC. Resultados semelhantes foram obtidos para o tamanho do tumor (OS,

P Art 0,001, Fig 2C e DFS,

P Art 0,001, Fig 2D).

análise de sobrevida univariada de SO e DFS no carcinoma do pulmão, tal como determinado pelo método de Kaplan-Meier com base em terrenos

expressão TGFβR2

em (a) e (B); metástase de nódulo linfático em (C) e (D); eo tamanho do tumor carcinoma pulmonar em (E) e (F), respectivamente.

A análise univariada com um modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox revelou que a invasão da membrana do pulmão (

P = 0,04

), o tamanho do tumor (

P Art 0,001), e metástase ganglionar (

P

= 0,02) também foram correlacionados positivamente com mau prognóstico (Tabela 3). Mais importante, a quimioterapia foi encontrado para aumentar significativamente OS (

P

= 0,033, HR = 1.489 [1.032, 2.418], Fig 3A) e tempo de DFS (

P

= 0,048, HR = 1.444 [1.004, 2.078], Figura 3B). Além disso, a baixa expressão de

TGFβR2

em tumores NSCLC de pacientes tratados com quimioterapia foi fator de proteção crítico para OS (

P

= 0,003, HR = 2,24 [1. 32, 3,79], Fig 3C) e DFS (

P Art 0,001, HR = 9,40 [4,92, 17,98], Fig 3D). Nenhuma correlação foi observada com o sexo, idade, invasão vascular, invasão da membrana do pulmão, estadiamento TNM, a diferenciação do tumor, ou história de tabagismo. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a expressão de

TGFβR2

pode desempenhar um papel potencial na progressão NSCLC e correlacionar com o resultado de pacientes com NSCLC.

A análise univariada de OS (A) e DFS (B ) com um modelo de risco proporcional de Cox em carcinoma do pulmão baseada em quimioterapia, tal como determinado por estimativas de regressão de Cox. A análise multivariada de OS (C) e DFS (D) com um modelo de riscos proporcionais de Cox no carcinoma de pulmão baseado em quimioterapia e

TGFβR2

expressão, como determinado pelas estimativas de regressão de Cox.

a análise de regressão de riscos proporcionais de Cox multivariada foi realizada para estabelecer se a expressão de

TGFβR2

era um marcador de prognóstico em pacientes com NSCLC. O modelo inicialmente incluídos todos os parâmetros que foram preditivos de OS na análise univariada de todo o grupo de estudo, tal como apresentado na Tabela 3 (idade, sexo, história de tabagismo, metástases do nó de linfa, a diferenciação do tumor, histologia, invasão vascular e diâmetro, e invasão da membrana do pulmão). Um procedimento passo a passo para a frente foi adotado para obter o modelo final de preditores significativos para OS consistindo dos fatores metástases do nó de linfa, diâmetro, invasão da membrana do pulmão, e expressão de

TGFβR2

. De acordo com multivariada Cox análise do modelo de regressão, alta expressão de

TGFβR2

foi identificada como um preditor de menor OS em pacientes com NSCLC.

Quimioterapia associada à baixa expressão de TGFβR2 altamente melhora OS e DFS de NSCLC pacientes

quimioterapia serve como tratamento primário, na maioria dos casos de NSCLC. O OS e DFS dos pacientes foram, portanto, analisados ​​com base na situação de tratamento. A quimioterapia foi encontrada para prolongar significativamente a OS (33,5 ± 1,05 vs. 24,37 ± 1,22,

P

= 0,025) e DFS (32,47 ± 0,84 vs. 24,37 ± 1,22,

P

= 0,037) de os pacientes nesta coorte (Tabela 4). Quando os dados foram analisados ​​com base em

TGFβR2

expressão, bem como o estado do tratamento, OS e tempo de DFS foi encontrado para ser significativamente maior em pacientes com NSCLC tratados com baixa expressão de

TGFβR2

em oposição a não tratada pacientes com expressão elevada (40,70 ± 2,07 vs. 24,23 ± 1,25,

P

= 0,002 e 36,53 ± 2,97 vs. 21,33 ± 1,34,

P Art 0,001). (Tabela 4)

Os resultados demonstraram que

TGFβR2

foi altamente expresso em pacientes com um prognóstico ruim, mesmo quando tratados com quimioterapia. análise de sobrevivência uni e multivariada foi realizado com Kaplan-Meier para continuar a determinar se a quimioterapia e /ou

TGFβR2

expressão foi associada com OS e DFS. Os resultados da análise univariada demonstrou que OS prolongada e DFS foi associada ao tratamento (Fig 3A (HR = 1.489 [1.032, 2.418],

P

= 0,033) e Fig 3B (HR = 1.444 [1.004, 2.078] ,

P

= 0,048), respectivamente). Quando os dados do paciente foi estratificado com base em

TGFβR2

expressão, bem como o estado do tratamento, análise de regressão de riscos proporcionais de Cox multivariada revelou um aumento do OS (HR = 2,24 [1,32, 3,79],

P

= 0,003, Fig 3C) e DFS (HR = 9,40 [4,92, 17,98],

P

. 0,001, Fig 3D) em pacientes tratados com baixa

TGFβR2

tumores que expressam

Discussão

os componentes moleculares da família TGF-β têm sido os estudos de foco molecular elucidando mutações somáticas em muitos cancros humanos. Aqui, as biópsias NSCLC e tecidos não cancerosos adjacentes foram examinados para a expressão de

TGFβR2

. A sobrevida global em pacientes com alta expressão ( 1,99 vezes) de

TGFβR2

foi diminuída em relação aos pacientes com baixa expressão de

TGFβR2

. Além disso, os parâmetros clínicos tais como metástases em linfonodos e tamanho do tumor foram associados a um pior prognóstico neste grupo. Finalmente, uma associação entre

TGFβR2

expressão e quimioterapia emergiu da nossa análise, sugerindo um possível papel para este biomarcador na resposta à quimioterapia.

Resistência à quimioterapia é um grande desafio no tratamento de câncer [24]. recorrência do câncer é um problema em pacientes não só sob tratamento com quimioterapias tradicionais, mas também com as terapias moleculares mais contemporâneas alvejados. A inibição da via de sinalização de TGF-β com compostos de moléculas pequenas, no entanto, provou ser um modo de reverter a resistência em NSCLC de terapia direcionada [25]. Vários estudos revelaram que anti-

TGFβR2

anticorpo, tal como um inibidor da terapêutica em combinação com quimioterapia bloqueou a ligação de

TGF-p1, a activação 2, e 3. A inibição de TGF-β interrompido de Smad2, que foi mostrado para controlar metástases, crescimento tumoral e a invasão de células cancerosas [26]. O tratamento com anticorpos específicos em outros estudos também inibiu o crescimento do tumor primário e de metástases [27,28]. O tratamento com o agente citotóxico ciclofosfamida em combinação com a inibição da via de TGF-β foi particularmente eficaz na atenuação do crescimento do tumor primário e de metástases [26]. Portanto, uma abordagem terapêutica que inibe a

TGF-β

transdução de sinal pode vir a ser especificamente eficaz para pacientes com NSCLC com expressão detectável de

TGFβR2

. De facto, o bloqueio do sinal de TGF-β com solúvel do receptor de tipo TGF-β proteína II inibiu a ligação a endógeno

TGF-β

receptores e reduzida motilidade de células tumorais, intravasamento, e metástases distantes num modelo de ratinho de TGF-β [ ,,,0],29].

os médicos examinaram a utilidade da quimioterapia e radioterapia em ambos os contextos pré-operatório e pós-operatório, a fim de avaliar a sobrevida global ea sobrevida livre de doença em pacientes com NSCLC resectable [30]. No entanto, com uma compreensão molecular cada vez mais detalhada do desenvolvimento do câncer, as estratégias de tratamento individualizado tornaram-se o foco para a melhoria da terapia do cancro. biomarcadores moleculares, assim, começaram a desempenhar um papel de destaque no manejo clínico de pacientes com câncer, em que indicam a probabilidade de uma resposta à intervenção quimioterápico em pacientes individuais. Biomarcadores actualmente relevantes para terapia-alvo em NSCLC são EGFR, HER2, e estado mutacional KRAS, ALK rearranjo do gene, e expressão da proteína de c-Met [31]. Estes biomarcadores têm estimulado o co-desenvolvimento de novas drogas com diagnósticos do companheiro [32].

esforço significativo para identificar uma assinatura molecular que poderia prever a resposta à terapia adjuvante do câncer está em curso, a fim de realizar e melhorar o padrão atual dos cuidados clínicos [33-35]. No entanto, o verdadeiro potencial de biomarcadores reside na sua eventual desenvolvimento como uma terapia alvo molecular no tratamento de subconjuntos específicos de doentes com NSCLC [36]. Muitas vias de sinalização são cruciais envolvidas no desenvolvimento de NSCLC, e sensibilidade a quimioterapia ou a resistência a vários anticorpo ou inibidor de agentes que têm como alvo esses caminhos podem ser especificamente administrada de acordo com o aparecimento de marcadores específicos em pacientes individuais [26,37,38].

Em resumo, os nossos dados demonstraram que com o tratamento quimioterápico do oS mediana e DFS de pacientes foram aumentadas. Além disso, os pacientes estratificados por quimioterapia em conjunto com baixa expressão de

TGFβR2

exibiu o sistema operacional mais longa e DFS nesta coorte. Em contraste, os pacientes não tratados com alta expressão de

TGFβR2

exibiu o sistema operacional mais curto e DFS. As análises demonstraram, portanto, que, no caso de baixa expressão

TGFβR2

, quimioterapia melhora muito a sobrevida global ea sobrevida livre de doença em pacientes com NSCLC. Portanto,

TGFβR2

é um potencial biomarcador tumor de quimio-sensibilidade em NSCLC. No entanto, mais estudos com coortes maiores é necessário para confirmar estes resultados.

Conclusão

expressão TGFβR2

em tecidos NSCLC foi significativamente maior do que em tecidos não-neoplásicas. As análises revelaram que a alta expressão de

TGFβR2

( 1,99) foi um fator de risco crítico para OS reduzida e DFS em pacientes com NSCLC. Portanto, as nossas constatações indicam que

TGFβR2

níveis de transcrição podem ter um papel importante na progressão do NSCLC e pode desenvolver-se como um biomarcador prognóstico promissor para pacientes com NSCLC quimioterapia.