Abstract

Fundo

A amplificação sistema de mutação refractária tetra-iniciador de PCR (T-ARMS-PCR) é um meio rápido e econômico de ensaiar SNP de, necessitando apenas de amplificação por PCR e eletroforese subsequente para a determinação dos genótipos. Para melhorar o rendimento e eficiência do T-ARMS-PCR, combinamos T-ARMS-PCR com uma estratégia interruptor de temperatura baseado em iniciador quimérico PCR (TSP), e utilizado a eletroforese capilar (CE) para a separação amplicon e identificação. Avaliamos este processo na genotipagem simultânea de dois SNPs relacionados com o risco de câncer cervical câncer e quatro de mama.

Métodos

Um total de 24 primers T-ARMS-PCR, cada 5′- marcado com uma sequência universal e um par de iniciadores universais, foram reunidas para amplificar o alvo de 12 alelos 6 SNPs em amostras de sangue 186 do sexo feminino de controlo. A sequenciação directa de todas as amostras também foi realizada para avaliar a precisão deste método.

Resultados

Das 186 amostras, como muitos como 11 amplicons podem ser produzidos em um único PCR e separados por CE . resultados de genotipagem do multiplex T-ARMS-PCR estavam em completo acordo com a sequenciação directa de todas as amostras.

Conclusões

Este novo método multiplex T-ARMS-PCR é o primeiro método relatado permitindo que um para genotipar SNPs seis numa única reacção sem tratamento de pós-PCR, excepto electroforese. Este método é confiável, rápido e fácil de executar

Citation:. Zhang C, Liu Y, Anel BZ, Nie K, Yang M, Wang M, et al. (2013) A Novel Multiplex Tetra-Primer ARMS-PCR para a simultânea Genotipagem do Seis Single Nucleotide polimorfismos associados com cânceres femininos. PLoS ONE 8 (4): e62126. doi: 10.1371 /journal.pone.0062126

editor: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de julho de 2012; Aceito: 19 de março de 2013; Publicação: 17 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela mega-Projeto China de Doenças Infecciosas (2011ZX10004-001, 2012ZX10004-215 e 2013ZX10004-202). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o papel de polimorfismos de um único nucleótido (SNP), contribuindo para a variabilidade entre indivíduos na susceptibilidade a cancro [1], crescimento tumoral e metástase taxa de [2] – [4], bem como no tratamento e eficácia respostas adversas a medicamentos, tem sido bem reconhecido [5], [6]. Entre os vários métodos que têm sido desenvolvidos para a genotipagem de SNPs, a amplificação de mutação refractário de tetra-iniciador de PCR (T-ARMS-PCR) demonstrou ser rápido, simples e económico [7] – [11]. Através da combinação de dois iniciadores externos e dois iniciadores internos específicos de alelo, a genotipagem requer apenas um único PCR seguido de electroforese separação [8]. Multiplex PCR foi incorporado no T-ARMS-PCR, utilizando iniciadores de oito numa PCR, e é capaz de detectar simultaneamente duas mutações [9]. Separadamente, baseado no quimérica-iniciador de PCR multiplex, o que adiciona um ‘etiqueta universal 5 para a sequência de iniciadores específicos para vários objectivos, tem sido relatado para melhorar o rendimento e eficiência da reacção em cadeia da polimerase [12]. Com a sua elevada eficiência na detecção de dezenas de diferentes produtos de PCR em uma reacção, a utilização de iniciador de PCR quimérico tem sido frequentemente relatado para uso em ARNm quantificação [13] -. [15] e detecção de agentes patogénicos [16], [17]

o cancro da mama e cancro do colo do útero tornaram-se os cancros mais frequentemente diagnosticado e as principais causas de morte por câncer entre as mulheres [18]. Estudos recentes mostram que as variantes somáticas em regiões de suscetibilidade estão associados com a probabilidade de ocorrência de câncer de mama e ginecológico [19] – [23]. Os SNPs foram escolhidas para este estudo com base em associações relatadas com estes cancros e que tem uma prevalência relativamente elevada na população Asiática. Foram selecionadas quatro variantes de baixa penetrância para a predição de risco de câncer de mama. rs4784227 SNPs [24] e [25 rs3803662] estão localizados no factor de transcrição TOX3; rs1219648 se encontra dentro de FGFR2, o que contribui para o crescimento celular, capacidade de invasão, motilidade, angiogénese e [26]; rs889312 [27] está dentro MAP3K1, que está ligada a resposta celular a mitogénios. Foram selecionadas duas variantes associadas ao risco de câncer do colo do útero ou ovário. rs750749 SNP [21] é um polimorfismo no CD83, que está envolvida no reconhecimento imunológico e a apresentação de antigénios; rs749292 no CYP19A1, que desempenha um papel-chave nos níveis de estrogênio biossíntese [22], [23].

Neste artigo, descreve um romance multiplex T-ARMS-PCR que permite a genotipagem simultânea de 6 SNPs (rs4784227 , rs3803662, rs1219648, rs889312, rs750749 e rs749292) associado a cânceres de mama e ginecológicos em um único tubo utilizando 24 primers quiméricos e um par de primers universais O uso de primers quiméricos e uma estratégia interruptor de temperatura PCR (TSP) foram combinados com T- ARMS-PCR para otimizar os parâmetros de amplificação e melhorar o rendimento do SNP genotipagem. A combinação dessas técnicas de genotipagem diferentes demonstra pela primeira vez a capacidade de tetra-iniciador ARMS-PCR para detectar de forma fiável e eficiente seis SNPs numa única reacção. Uma vez que mais de 10 produtos de PCR com diferentes comprimentos precisa ser identificado, electroforese capilar (CE) é utilizada em vez de electroforese em gel de agarose.

Materiais e Métodos

Um total de 186 amostras de sangue a partir de saudável voluntários do sexo feminino chineses que estavam sendo monitorados para hipertensão potencial foram coletados em centros de saúde comunitários em Wuhan, China em 2011 para este estudo. Todos os aspectos do estudo foram realizados de acordo com os regulamentos nacionais de ética e aprovado pelos Conselhos de Revisão Institucional do Centro de Controle e Prevenção de Doenças 70 da China, bem como o Comité de Huazhong Universidade de Ciência e Tecnologia de Ética. Os participantes receberam “consentimento informado” do propósito do estudo e do seu direito de manter a informação confidencial. consentimento por escrito foi obtido de todos os participantes ou seus responsáveis.

DNA genômico foi extraído de 0,2 ml amostras de sangue periférico fresco pelo uso do Assistente

® Genomic DNA Purification Kit (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. Amostras de DNA tinha uma concentração final variando de 55-365 ng /mL.

Para superar as limitações do multiplex padrão métodos T ARMS-PCR, o método proposto foi otimizado em termos de design primer, condições dos ciclos de PCR e na utilização de iniciadores quiméricos e estratégia de TSP, como descrito nos relatórios anteriores na detecção de vírus influenza e mão-pé humano e boca associada patógenos [16], [28]. Foram utilizados um total de 24 iniciadores quiméricos cada um consistindo de uma sequência específica do gene com uma sequência de etiqueta universal na extremidade 5 ‘. As porções específicas do gene de os iniciadores foram concebidos de acordo com os requisitos de t-ARMS-PCR. A especificidade dos iniciadores específicos dos alelos é conferida pela identidade do nucleótido do terminal 3 ‘quer com a de tipo selvagem ou o alelo mutante, a especificidade é aumentada pela introdução de uma incompatibilidade deliberada na posição -1 do 3’-terminal. Um par de primers universais e seis conjuntos de T-ARMS-PCR primers quiméricos foram utilizados para a amplificação. sequências iniciadoras detalhadas e as concentrações de trabalho para cada SNP estão listados na Tabela 1.

A genotipagem dos polimorfismos testados foi realizada por multiplex PCR e análise de fragmentos. Seis conjuntos de t-ARMS-PCR iniciadores para a amplificação de fragmentos de doze tamanhos diferentes foram reunidas numa única de 20 ul de volume de reacção, que também continha 10 ul de mistura mestre Qiagen PCR multiplex, 50-100 ng de ADN genómico, e concentrações de cada iniciador optimizado (ver Tabela 1). Multiplex PCR foi realizada utilizando Bioer LifePro Thermal Cycler. Um PCR protocolo de comutação temperatura optimizada (TSP), o qual utiliza quatro temperatura de recozimento diferentes foi realizada como se segue: passo de desnaturação inicial de 95 ° C durante 10 minutos, 3 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 45 s, 10 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 58 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 45 s, 20 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 68 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 45 s, 15 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 45 s, seguido de um ciclo de extensão final a 72 ° C durante 10 min, e depois arrefecida até à 4 ° C.

Os produtos de PCR foram separados por multiplex QIAxcel

® cartucho de gel de DNA de alta-resolução (Qiagen) no sistema QIAxcel (Qiagen). ADN tamanho do marcador de 25-450 pb (Qiagen) e alinhamento do marcador 15 pb 500 pb /(Qiagen), foram usadas em cada QIAxcel é executado e o tamanho dos produtos foi determinada utilizando o software ScreenGel (Qiagen). Porque cada um dos produtos de amplificação foi de um comprimento diferente, os alelos foram detectados na base dos padrões de tamanhos de pico.

Um total de 186 amostras também foram sequenciados em paralelo com um ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems , EUA), de acordo com a Big Dye Termination versão 3.1 do protocolo em Invitrogen Corporation (Xangai, China) para confirmar os resultados multiplex T-ARMS-PCR utilizando os iniciadores externos listados na tabela 1 para cada SNP.

resultados

um total de 186 amostras foram digitados com um ensaio T-ARMS-PCR multiplex e também digitado em paralelo com sequenciação directa para avaliar a precisão e eficiência do ensaio. Todos os produtos de PCR foram bem resolvidos e dimensionado pela CE e ScreenGel, permitindo a fácil identificação de diferentes genótipos. Duas das 186 amostras tinham onze amplicons únicas, o que significa que os pacientes têm apenas um homogênea SNP entre os seis loci testados. imagem do gel das duas amostras (Fig. 1) electrofograma e mostrar que CE em QIAXEL pode claramente separada até 11 fragmentos em uma amostra. A precisão da análise por PCR múltipla de uma amostra foi confirmada por sequenciação directa (Fig. 2). O tamanho dos fragmentos determinada por CE com base QIAXEL estão listados na Tabela 2. Ler comprimentos eram de 2 a 10 pb maiores do que as esperadas mas isso não interferem com a determinação do alelo. Heterozigotos e homozigotos foram inequivocamente atribuído a partir dos perfis CE. Não se observou qualquer reacção cruzada. Os genótipos marcados a partir do ensaio multiplex estavam em conformidade% 100 com sequenciação directa

A:. Image gel das 4 amostras. imagem B. Gel e electrofograma da amostra no lane1. Foram observados 11 bandas que vão 202-356 pb, indicando 5 heterogénea e 1 SNPs homogêneos foram identificados C: imagem Gel e electrofograma da amostra no lane2. Foram observadas uma outra combinação de 5 heterogénea e 1 SNPs homogêneos.

A distribuição e alélicas freqüências genotípicas de cada SNP estão listados na tabela 3. O alelo relatado para ser associado com o risco de ocorrência de câncer é realçado. A frequência observada de genótipos neste estudo foi em geral semelhante ao medido pelo HapMap para uma população chinesa Han (HCB). Se as frequências HapMap foram utilizados para prever a contagem de genótipos esperados neste estudo, em seguida, uma comparação desta população para a população HapMap HCB mostrou divergência significativa para rs4784227 em Tox3 e rs749292 no CYP19A1, em que o risco e alelos não-risco, respectivamente, estão presentes numa proporção significativamente mais elevada do que o previamente relatado para uma população chinesa. É provável que haja diversidade dentro da população Han que ainda não é capturado pelos estudos HapMap. Um quadro suplementar (Tabela S1) é fornecido para mostrar os conjuntos de exatas de alelos para todos os 6 SNPs encontrados em cada amostra individual para referência futura.

Discussão

Métodos permitindo baixo custo , determinação SNP rápido e confiável estão atraindo crescente interesse na era da medicina personalizada. É amplamente reconhecido que o uso de informações de vários genótipos SNP fornece uma avaliação de risco mais precisos do que o previsto por um alelo de risco único [29], portanto, métodos capazes de identificar vários genótipos, tais como espectrometria de massa MALDI-TOF [30], [31 ] e à base de hibridização [32] – [34] ou com base em enzima [35] métodos têm sido utilizados. No entanto, estes métodos tanto requerem equipamento especial caro, como o espectrômetro de massa, ou demorado operação pós-PCR.

Tetra-iniciador ARMS-PCR método tornou-se um dos métodos mais utilizados para SNP genotipagem. Isto requer apenas equipamento normal biologia molecular e elimina a necessidade de hibridização ou reacções enzimáticas adicionais. Embora os métodos de PCR triplex e quadruplex têm sido relatados, não é de uso limitado multiplex T-ARMS-PCR em genotipagem devido a duas limitações principais. Em primeiro lugar, a probabilidade de encontrar iniciadores com temperaturas de fusão correspondentes cai drasticamente quando se tenta combinar a detecção de vários SNPs numa única reacção. Em segundo lugar, o conjunto resultante de amplicões requer intervalos de comprimento suficiente entre bandas vizinhos na electroforese para facilitar a separação. Ao combinar T-ARMS-PCR com um interruptor estratégia quimérico à base de primer temperatura PCR estamos bastante de contornar essas limitações. O nosso método demonstra pela primeira vez a capacidade de tetra-iniciador ARMS-PCR para detectar facilmente seis SNPs numa única reacção.

A fiabilidade do método foi ilustrado digitando 186 amostras de sangue clínicos em paralelo com a sequenciação directa , e foi obtida uma consistência de 100% entre os dois métodos. Este estudo prova-de-conceito define, assim, um reprodutível, e custo método rápido e eficaz para a detecção de SNPs multiplex, uma vez CE por QIAXCEL é capaz de resolver os amplicões com tão pouco como 5 diferença de tamanho pb, a menor diferença de tamanho neste teste foi de 10 pb. Como os comprimentos de leitura neste ensaio tem um desvio padrão de 0,8 a 1,3 (Tabela 2), a determinação do alelo é assim não interferiu.

O uso de iniciadores quiméricos e interruptor de temperatura bifásico no processo de recozimento diminui a diferença na eficiência da amplificação entre os amplicons. Durante os primeiros ciclos de PCR, a amplificação é realizada por iniciadores quiméricos específicos de alelo. Nas fases posteriores de PCR, amplificação é predominantemente realizada por iniciadores universais, de modo que todos os objectivos mencionados no presente sistema de PCR multiplex são amplificados de forma imparcial por um único par de iniciadores universais. Isto reduz a ocorrência de amplificação enviesada e parcial, minimiza as reacções não específicas, e reduz a necessidade de optimização de cada ensaio de PCR individuais.

Para avaliar os erros resultantes da utilização de electrophoregrams multi-banda para distinguir amplicões , o comprimento de leitura de cada banda foi comparado com os comprimentos teóricos calculados a partir de iniciador-alinhamento (Tabela 2). Não se observou a sobreposição na faixa de comprimento de leitura entre quaisquer dois dos amplicões, além disso, não existe qualquer sobreposição dos intervalos de confiança de 99% do comprimento médio de leitura observada. É notável que intensidades de banda pode ser sujeita a vários fatores, incluindo a qualidade do DNA genômico e PCR qualidade reagentes; verificou-se que 50-100 ng /mL de ADN é ideal para proporcionar bandas suficientemente clara e brilhantes com fundo mínima (dados não mostrados). Além disso, ao contrário da maior parte dos outros métodos relatados t-ARMS-PCR, uma incompatibilidade deliberadas na posição -1 do terminal 3 ‘foi incorporado em ambos os primários interiores e era suficientemente específico para a detecção diferencial de dois alelos para cada SNP. Devido à limitação de discriminação de tamanho entre os produtos de PCR, o desenho de primers de PCR pode ser restringida, até certo ponto, fazer várias T-ARMS-PCR difícil digitar esses SNPs que estão localizados mais perto do que 20 bp para o outro.

duas vantagens distintas do método braços múltiplos-PCR são o tempo de ensaio curto e os custos baixos, mesmo para ensaiar um grande número de amostras. O método proposto, envolvendo apenas PCR convencional com um CE, pode ser realizada dentro de 3,5 horas com o mínimo esforço hands-on. Depois da extracção do ADN genómico, as etapas subsequentes podem ser concluídas num único tubo de reacção, permitindo a análise de amostras múltiplas pronto num único ensaio para rastreio de alto rendimento. Este ensaio consome os reagentes de PCR único padrão e cartuchos de electroforese; os custos neste estudo foram apenas 2 US $ para a detecção simultânea de seis SNPs por amostra.

Para o nosso conhecimento, o método proposto é o primeiro a detectar seis SNPs em uma única reação usando tetra-primário ARMS- PCR. O novo método multiplex tetra-iniciador ARMS-PCR desenvolvida neste estudo tem um potencial significativo para ser amplamente aplicável em ambos os ambientes comerciais e clínicos para a seleção de múltiplos SNPs.

Informações de Apoio

Tabela S1.

alelos de 6 SNPs de cada amostra individual neste estudo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0062126.s001

(DOCX)