Abstract

A terapia fotodinâmica (PDT) surgiu como um tratamento eficaz para vários tumores sólidos. A NRF2 fator de transcrição é conhecido por proteger contra o stress oxidativo e electrof�ico; No entanto, a sua actividade constitutiva de cancro confere resistência às drogas anti-cancro. No presente estudo, investigamos a sinalização NRF2 como um potencial determinante molecular de feoforbida um (PBA) à base de PDT usando

NRF2

carcinoma da mama -knockdown células MDA-MB-231. As células com estável

NRF2

knockdown se observado aumento na citotoxicidade e morte celular por apoptose /necrótica seguinte PDT, juntamente com o aumento dos níveis de oxigénio atómico e espécies reativas de oxigênio (ROS). A visualização microscópica confocal do PBA fluorogênico demonstrou que

NRF2

células -knockdown acumular mais Pba do que as células de controlo. Uma análise posterior da expressão de transportadores de fármacos membrana mostrou que a expressão basal de

BCRP

é dependente de NRF2. Entre os transportadores de drogas medidos, a expressão basal da proteína de resistência do cancro da mama (BCRP; ABCG2) só foi diminuída pela

NRF2

-knockdown. Além disso, após a incubação com o inibidor específico BCRP, diferencial acumulação celular ROS Pba e em duas linhas celulares foram abolidos. Além disso,

NRF2

células -knockdown expressar baixo nível de peroxiredoxina 3 em comparação com o controlo, o que implica que o sistema de defesa ROS mitocondrial diminuída pode estar a contribuir para PDT sensibilização. O papel da via do Nrf2-BCRP em resposta PBA-PDT foi também confirmado em células de carcinoma do cólon HT29. Especificamente,

NRF2

knockdown resultou na morte celular melhorada e aumentada oxigénio atómico e os níveis de ROS seguintes PDT através da expressão diminuída de BCRP. Do mesmo modo, a produção de ROS induzida por PDT foi substancialmente aumentada por tratamento com

NRF2

shRNA de carcinoma da mama em células MCF-7, células de carcinoma do cólon HCT116 Células de carcinoma A498, renais, células de glioblastoma e A172. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a manipulação de NRF2 podem aumentar a sensibilidade PBA-PDT em múltiplas células cancerosas

Citation:. Choi Bh, Ryoo Ig, Kang HC, Kwak MK (2014) a sensibilidade das células cancerosas para feoforbida a-Based Terapia fotodinâmica é reforçada pela

NRF2

silenciamento. PLoS ONE 9 (9): e107158. doi: 10.1371 /journal.pone.0107158

Autor: Michael Hamblin, MGH, MMS, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de maio de 2014; Aceito: 06 de agosto de 2014; Publicação: 16 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Choi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Pesquisa (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência, TIC e Planejamento Futuro (NRF-2013R1A2A2A01015497). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a terapia fotodinâmica (TFD) tem emergido como um tratamento eficaz para vários tumores sólidos [1] – [3]. PDT requer três elementos: i) um fotossensibilizador que pode ser selectivamente aos tecidos de tumor, ii) uma fonte de luz apropriada que emite de baixa energia e de luz-penetração no tecido, e iii) o oxigénio molecular [4]. O primeiro passo da TFD é a activação de um fotossensibilizador pela luz. Quando o fotossensibilizador activado no seu estado excitado retorna ao seu estado fundamental, ele transfere sua energia ao oxigênio e gera oxigénio atómico (

1O

2), um espécies reativas de oxigênio altamente reativas e de curta duração (ROS), como um tipo de reacção II. Ao mesmo tempo, o fotossensibilizador activado pode reagir directamente com os componentes celulares e as transferências um átomo de hidrogénio formar radicais, o que produz produtos de oxidação, eventualmente, através da reacção com oxigénio (reacção do tipo I) [5]. oxigénio atómico e ROS são altamente oxidantes moléculas; Por conseguinte, as células tratadas com PDT sofrer morte celular através de apoptose e necrose tanto [6]. Em adição ao seu efeito directo sobre as células tumorais, o PDT afecta o microambiente do tumor, destruindo a sua microvasculatura e por aumentar as respostas inflamatórias e as respostas imunitárias específicas do tumor [4], [7], [8].

feoforbida um (PBA) é um produto da degradação de clorofila, o qual é isolado a partir de excrementos de bicho da seda [9] e erva medicinal chinesa

Scutellaria barbarta

[10]. PBA absorve a luz em comprimentos de onda mais longos do que o photofrin fotossensibilizador de primeira geração. O comprimento de onda máximo de 666 nm é Pba, enquanto que é de Photofrin 630 nm [11]. Porque a penetração nos tecidos é reforçada por comprimentos de onda mais longos, Pba tem sido considerada como um fotossensibilizador para o tratamento de tumores grandes na cavidade peritoneal [12]. Semelhante ao Photofrin, Pba induz a apoptose e necrose no carcinoma pancreático, da leucemia, e as células de carcinoma hepatocelular [13] – [15]. Em células de carcinoma do útero, o mecanismo subjacente da apoptose é a acumulação Pba na mitocôndria, o que conduz à geração de ROS e libertação de citocromo c [16], [17]. Do mesmo modo, faz com que a apoptose Pba mitocôndrias dependentes de carcinoma da mama em células MCF-7 [18]. Vários

in vivo

estudos com animais têm apoiado a eficácia do PBA-PDT na prevenção tumorigênese. Por exemplo, uma preparação lipossómica de PBA-PDT retardou o crescimento do tumor em um xenoenxerto de carcinoma do cólon HT29 [19]. A administração intravenosa de 0,3 mg /kg Pba seguido de irradiação de luz inibiram o crescimento do tumor significativamente em ratinhos nus que albergam um xenoenxerto de hepatoma humano [11]

.

Um factor que determina a eficácia da TFD é a expressão da cassete de ligação a ATP ( ABC) transportadores no tecido alvo. Estes transportadores controlar a acumulação intracelular de produtos químicos estranhos, transportando-os activamente para fora da célula [20]. A proteína de resistência do cancro da mama (BCRP, ABCG2 ou) é um transportador ABC que foi originalmente identificada em células de cancro da mama resistentes à doxorrubicina-[21]. A sobre-expressão da BCRP em tumores confere resistência à quimioterapia [22]. Além das drogas anti-câncer, BCRP foi mostrado para o transporte de fotossensibilizadores de porfirina do tipo. Especificamente, as células HEK que sobre-expressam BCRP eram resistentes a citotoxicidade induzida por Pba [23]. Ao mesmo tempo,

BCRP

-knockout ratinhos foram altamente susceptíveis à fototoxicidade da pele induzida por dieta Pba [24].

O factor de transcrição NF-E2 relacionado com o factor 2 (NRF2) é um membro da família de factores de transcrição cap’n’collar-leucina zipper (CNC-bZIP) de base [25]. NRF2 actividade é principalmente regulada pela proteína citoplasmática-Kelch como proteína associada a uma ECH (KEAP1) [26], [27]. Através da ligação ao domínio de Neh2 NRF2, KEAP1 medeia a ubiquitinação e subsequente degradação de proteossómica NRF2. Sob condições de stress oxidativo e electrof, NRF2 é libertado a partir KEAP1 e transloca-se para o núcleo, resultando na transcrição de múltiplos genes alvo que codificam enzimas desintoxicantes, proteínas antioxidantes, proteínas de resposta ao estresse, e transportadores de drogas [28] – [30] . Porque os seus genes-alvo têm efeitos citoprotectores, NRF2 é considerado como um jogador crítico no sistema de defesa contra o stress oxidativo e electrof [31]. Assim, vários estudos têm mostrado que a deleção genética da

Nrf2

está associada com aumento da susceptibilidade a danos nos tecidos e lesões resultantes das agressões ambientais e endógenos [28], [31], [32]. Por outro lado, uma evidência crescente sugere que as células cancerosas explorar o sistema NRF2 para a sobrevivência, adaptando-se o microambiente do tumor estressante [33]. sinalização NRF2 é activada constitutivamente em diversos tipos de tumor e linhas celulares de cancro em cultura, que está associado com o crescimento do tumor aumentada e resistência aos agentes quimioterapêuticos. Em células de cancro, a sinalização é NRF2-reguladas após exposição a drogas quimioterapêuticas, que confere resistência à quimioterapia adquiridos [34] – [36]. Da mesma forma, a TFD com hipericina em células de carcinoma de bexiga humana resultou na expressão elevada de proteína NRF2 nuclear e heme oxigenase-1 (HO-1) através de p38

MAPK e PI3K [37]. O tratamento de células HepG2, com uma concentração não tóxica do PBA seguido pela activação foto durante 90 minutos resultou num aumento da expressão da BCRP e heme oxigenase-1 (HO-1) num modo dependente da NRF2 [38].

no presente estudo, investigamos NRF2 como um determinante molecular novela de eficácia PDT. Porque NRF2 regula a expressão de ROS-neutralizar componentes e várias drogas transportadores, a hipótese de que a manipulação de expressão NRF2 aumentaria a eficácia do PDT. Para testar esta hipótese, nós estabelecemos estável

NRF2

linhas celulares -knockdown usando carcinoma da mama humano MDA-MB-231 e células HT29 do carcinoma do cólon, e mediu a sensibilidade PDT. Os nossos resultados mostraram que

NRF2

knockdown aumenta a morte celular induzida por PDT, aumentando a produção de ROS. Como um mecanismo subjacente, expressão BCRP foi reprimido pela

NRF2

knockdown, levando ao aumento da acumulação celular do PBA e aumento da produção de oxigénio atómico.

Materiais e Métodos

Materiais

Pba era de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). NRF2 anticorpo foi obtido a partir de Abcam (Cambridge, MA, EUA). Os anticorpos que reconhecem e AKR1C1 BCRP foram adquiridos a Abnova (Taipei, Taiwan) e tecnologia de sinalização celular (Beverly, MA, EUA), respectivamente. anticorpos PRDX3 e β-tubulina foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology. Ko143, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT), e puromicina foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). 5 (6) -carboxi-2 ‘, diacetato (DCFDA), trans-1- (2’methoxyvinyl) pireno, e MitoGreen 7’-diclorofluoresceína foram adquiridos a Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). O sistema lentiviral contendo um pré-concebido humana

NRF2

shRNA e inespecífica mexidos RNA (pARNc) foi comprado na Sigma-Aldrich.

cultura celular

A célula de cancro da mama humano A linha MDA-MB-231 e MCF-7, linha celular de cancro do cólon HT29 e HCT116, e A498 carcinoma renal humano foram obtidos a partir de American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA). O A172 linha de células de glioblastoma humano foi comprado de coreano celular Linha Bank (Seoul, Coreia do Sul). MDA-MB-231, MCF7, A498, A172, HCT116 e foram mantidas num meio contendo Modified Eagle Médium da Dulbecco e mistura de nutriente F-12 (Hyclone, Utah, EUA), numa proporção de 01:01 suplementado com 10% de fetal de bovino soro (Hyclone) e penicilina /estreptomicina (WelGene Inc., Daegu, Coreia do Sul). HT29 foi mantida em meio RPMI-1640 (Hyclone) com FBS a 10% e penicilina /estreptomicina. As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera.

Produção de partículas lentivirais contendo

NRF2

shRNA plasmídeo de expressão

com partículas lentivirais shRNA foram produzidos em células 293T HEK após a transfecção de células com

NRF2

shRNA plasmídeo de expressão e a mistura de embalagens (Sigma-Aldrich) como descrito anteriormente [36]. Resumidamente, as células HEK 293T foram semeadas em placas de 60 mm a uma densidade de 7 x 10

5 células por poço. No dia seguinte, o meio foi substituído por OptiMEM (Life Technologies) e, subsequentemente, 1,5 ug pLKO.1-NRF2 shRNA, que contém o humano

NRF2

espec�ico shRNA (5′-CCGGGCTCCTACTGTGATGTGAAATCTCGAGATTTCACATCACAGTAGGA-3 ‘), e a mistura de embalagens foram transfectados para células utilizando Lipofectamina 2000 (Life Technologies). O plasmídeo pLKO.1-pARNc foi utilizado como um ARN de controlo não específico. No segundo dia, após a remoção de complexos de transfecção, o meio completo foi adicionado em cada poço. Meios contendo partículas lentivirais foram colhidas após 4 dias.

Estabelecimento de

NRF

linha de células knockdown

MDA-MB-231 na placa de 6 poços foram incubadas com partículas de lentivirais contendo quer pARNc ou NRF2 shRNA plasmídeo de expressão. Após uma incubação de 48 h-, as células foram recuperadas no meio completo e a puromicina (1 jag /ml) para selecção foi seguido até 4 semanas. O

NRF2

linha de células HT29 knockdown foi estabelecido como relatado anteriormente [39].

knockdown Transient de NRF2

MCF-7, HCT116, células A172 e A498 foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 1 × 10

5 células /poço e cultivadas durante a noite. No dia seguinte, as células foram incubadas com o colesterol durante 15 min e, em seguida, a partícula lentiviral contendo pARNc ou shNRF2 foram adicionados a cada poço. Após 48 h de incubação, meio contendo partículas virais foram removidos e as células foram recuperadas no meio fresco durante a noite.

PDT e análise de MTT

MDA-MB-231 e HT29 foram semeadas numa densidade de 7 × 10

3 placas de células /cavidade em 96 cavidades e incubou-se durante 20 h. As células foram tratadas com a PBA (0-2,5 ug /ml) durante 6 h e, em seguida, irradiada com 0,3 (HT29) ou cm

2 (MDA-MB-231) a laser /0,6 J na ausência do PBA. Para a irradiação a laser, a 670 nm da lâmpada LED sistema híbrido (Quantum Spectra vida, Barneveld, WI) foi utilizado. As células foram recuperadas em meio completo durante 18 h e foram incubadas com MTT durante 4 h. Após a remoção da solução de MTT, 100 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) foi adicionado a cada poço e a absorvância foi medida a 570 nm utilizando um Spectro-estrela Nano leitor de microplacas (BMG Lab Technologies, Offenburg, Alemanha).

A citotoxicidade medida

citotoxicidade por PDT foi avaliada usando o sistema de ensaio de CytoTox-Fluor (Promega, Madison, WI, EUA). Depois de PDT, as células foram mantidas durante 24 h e, em seguida, 50 ul de bis-AAF-R110 substrato foi adicionado a cada poço. Substrato que contém a solução foi incubada durante mais 2 h, com agitação orbital a 37 ° C. Intensidades de fluorescência foram medidos usando um SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a 485 nm Ex /520 nm Em.

extração de RNA total e PCR em tempo real análise

Total de RNAs foram isolados a partir de células utilizando um reagente de Trizol (Life Technologies). Para a síntese de ADNc, a transcriptase inversa (RT) as reacções foram realizadas por incubação de 200 ng de ARN total com uma mistura de reacção que contém 0,5 mg /mL de oligo dT

12-18 e 200 U /mL de vírus da Leucemia Murina de Moloney RT (Vida Technologies). Para a análise de reacção em cadeia da polimerase em tempo real (PCR), Roche LightCycler (Mannheim, Alemanha) foi utilizado com o sistema de pré-mistura de ExTaq Takara SYBR (Otsu, Japão). Os iniciadores foram sintetizados por Bioneer (Daejeon, Coreia do Sul) e as sequências dos iniciadores para os genes humanos são:

NRF2

, 5′-ATAGCTGAGCCCAGTATC-3 ‘e 5′-CATGCACGTGAGTGCTCT-3’;

HO-1,

5′-GCTGCTGACCCATGACACCAAGG-3 ‘e 5′-AAGGACCCATCGGAGAAGCG-GAG-3’; aldo-ceto redutase 1C1 (

AKR1C1),

5′-CGAGAAGAACCATGGGTGGA-3 ‘e 5′-GGCCACAAA-GGACTGGGTCC-3’; NAD (P) quinona oxidorredutase-1 (

NQO1

), 5′-CAGTGGTTTGGAGTCCCTGCC-3 ‘e 5′-TCCCCGTGGATCCCTTGCAG-3’; as subunidades catalíticas de cisteína ligase γ-glutamato (

GCLC

), 5′-TGAAGGGACACCAGGACAGCC-3 ‘e 5′-GCAGTGTGAACCCAGGACAGC-3’; epóxido hidrolase-1 (

EPHX1

), 5′-GCCTGCACTTGAACATGGCT-3 ‘e 5′-ATGTGCATGTAGCCGCTCTC-3’; superóxido dismutase 1 (

SOD1

), 5′-GATTCCATGTTCATGAGTTT-3 ‘e 5′-AGGATAACAGATGAGTTAAG-3’;

SOD2

, 5′-AACCTCACATCAACGCGCAGAT-3’and 5′-TCAGTGCAGGCTGAAGAGCTAT-3 ‘; catalase (

CAT

), 5′-GTGCATGCAGGACAATCAGG-3 ‘e 5′-GAATGCCCGCACCTGAGTAA-3’; peroxiredoxina 3 (

PRDX3

), 5′-GCCGTTGTCAATGGAGAGTTC-3 ‘e 5′-GCAAGATGGCTAAAGTGGGAA-3’;

PRDX5

, 5′- GGTGGCCTGTCTGAGTGTTA-3 ‘e 5’ACCACCATGGAGAACCTCTTG-3’; glutationa peroxidase de 1 (

GPX1

), 5′-TTCCCGTGCAACCAGTTTG-3 ‘e 5′-TTCACCTCGCACTTCTCGAA-3’;

GPx4

, 5′-TCACCAAGTTCCTCATCGACA-3 ‘e 5′-GCCACACACTTGTGGAGCTA-3’; glutationa redutase (

GSR), 5′-ACCCCGATGTATCACGCAGTTA-3 ‘e 5′-TGTCAAAGTCTGCCTTCGTTGC-3’; glutarredoxina 2 (

GLRX2

), 5′-GTATTGCTCTCCATCCTCCTCG-3 ‘e 5’CTGGGAGCCTTTATGAGCGT-3’. tiorredoxina-2 (

TXN2

), 5′-CACACCACTGTGCGTGGAAA-3 ‘e 5′-ACTGTAACACCCAACCCAGC-3’; proteína de resistência do cancro da mama (

BCRP /ABCG2

), 5’CACAACCATTGCATCTTGGCTG-3 ‘e 5’TGAGAGATCGATGCCCTGCTTT-3’; proteína de resistência a múltiplas drogas 1 (

MDR1 /ABCB1

), 5′-CTATGCTGGATGTTTCCGGT-3 ‘e 5′-TCTTCACCTGGCTCAGT-3’; associada a resistência a múltiplos fármacos de proteína 1 (

MRP1 /

ABCC1), 5′-AGCTTTATGCCTGGGAGCTGGC-3 ‘e 5′-CGGCAAATGTG- CACAAGGCCAC-3’;

MRP2 /ABCC2,

5′-GCTGCCACACTTCAGGCTCT-3 ‘e 5′-GGCAGCCAGCAGTGAAAAGC-3’;

MRP3 /ABCC3,

5′-ATACGCTCGCCACAGT-CCTT-3 ‘e 5′-GCTGGCCATGATGACCACAA-3’;

MRP4 /ABCC4

, 5′-CTTG- GATCGCAA-TACCCTTG-3 ‘e 5′-GACACCTCTCTTCTGCTTTG-3’;

MRP5 /ABCC5,

5′-CAGAGACCGTGAAGATTCCA-3 ‘e 5′-TTTGGAAGTAGTCCGGATGG-3’;

MRP6 /ABCC6,

5′-TGTGTGGCTCACCACGATG-3 ‘e 5′-CATAGGTAG- GTGGACAG-GTGG-3’; catião orgânico novo transportador 1 (

OCTN1;

SLC22A4), 5′-GCTGTATGTCTTCACTGCTG-3 ‘e 5′-GGTGAGGATTCCAATCAGGA-3’;

OCTN2

(

SLC22A5

), 5′-ATTGTTGTGCCTTCCACTATC-3 ‘e 5′-GGTCATCCACAGCATTATGG-3’; multidrogas e extrusão toxina transportador 2 (

Mate2

;

SLC47A2

), 5′-TTCATTCCAGGACTTCCGGTG-3 ‘e 5′-AGGTGTGAGTGAGATGGATGG-3′; hipoxantina fosforribosil-1 (HPRT1), 5’-TGGCGTCGTGATTAGTGATG-3 ‘e 5′-GCTACAATGTG-ATGGCCTCC-3’.

Medição da camisola

oxigênio

As células foram semeadas em uma tampa de vidro prato (ciências da vida SPL, Gyeonggi-do, Coreia do Sul) e cultivadas durante a noite. Após a irradiação de PBA-a laser, as células foram lavadas com PBS e incubadas com 50 uM 1–trans (2’methoxyvinyl) pireno (Life Technologies) durante 30 min. Para a coloração de núcleos, a Hoechst 33342 (H342) foi adicionado aos pratos acima e incubadas durante 10 min. fluorescência verde a partir de oxigénio singuleto foi detectada imediatamente usando um microscópio confocal LSM 710 (Carl Zeiss, Jena, Alemanha) e intensidades foram quantificados usando um software ZEN2011 (Carl Zeiss).

Medição de intracelular ROS

nível celular ROS foram examinados usando uma sonda fluorogênico célula-permeável, carboxi-H

2DCFDA. As células foram semeadas em um prato fundo tampa de vidro (SPL ciências da vida) e incubadas durante a noite. Após a terapia de PBA-a laser, as células foram lavadas com PBS e incubadas com 30 uM de carboxi-H

2DCFDA durante 30 min a 37 ° C. Para a coloração de núcleos, H342 foi incubada durante 10 min. Em seguida, imagens confocais foram obtidos e intensidades fluorescentes verdes foram quantificados utilizando um microscópio confocal e ZEN2011 software LSM 710

Medição do PBA acumulação

Pba é uma substância fluorogênico.; Por conseguinte, o nível de acumulação intracelular do PBA foi determinada medindo a fluorescência vermelha na célula. MDA-MB-231 e HT29 em lâminas de vidro de cobertura, foram incubadas com a PBA durante 6 h. Em seguida, Pba foi removido e lavagens com PBS foram seguidos. Intensidades do PBA fluorescência vermelha foram quantificados em imagens confocal usando ZEN2011 software. Como uma forma alternativa para a quantificação, as células foram semeadas em placas de 96 poços (BD Biosciences) e incubou-se com a PBA durante 6 h. Após a lavagem de células, Pba fluorescência vermelha foi detectada utilizando um gerador de imagens CellInsight celular pessoal (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e intensidades foram quantificados por um software CellInsight (Thermo Fisher Scientific).

determinação fluorimétrica de intracelular Pba

As células em placas de 96 poços foram incubadas com PBA durante 6 h e, em seguida, foram lisadas usando 1% de SDS após lavagem com PBS. DMSO foi adicionado a lisados ​​celulares para dissolver celular Pba e intensidade de fluorescência foi medida utilizando um SpectraMax M5 no Ex 415 nm /673 nm, Em.

análise Western blot

As células foram lisadas com tampão RIPA (Tris 50 mM [pH 7,4], NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, e 1% de nonil phenoxypolyethoxylethanol 40), contendo um cocktail inibidor da protease (Sigma-Aldrich). Para a extracção de proteínas BCRP, SDS a 0,1% foi adicionado ao tampão RIPA. A concentração de proteína foi determinada utilizando um kit de ensaio de proteína DC (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). As amostras de proteína foram separados por electroforese em 12% de gel de SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de nitrocelulose (Whatman, Dassel, Alemanha). Em seguida, a membrana foi bloqueada com 5% de leite desnatado ou 3% de albumina de soro bovino durante 1 h e incubou-se com anticorpos. As imagens de quimiluminescência foram capturados usando um Fujifilm LAS-4000 mini-imager (Fujifilm, Tóquio, Japão) e intensidades foram quantificados com o software correspondente.

A citometria de fluxo

As células NRFi-MDA foram semeadas em 60 cm

2 pratos a uma densidade de 1 × 10

5 células /poço e cultivadas durante a noite. Após a irradiação de PBA-a laser, as células foram tratadas com tripsina e centrifugadas a 15000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Em seguida, 2 × 10

5 as células foram transferidas para tubos de 1,5 ml por centrifugação a 8000

g

durante 5 min a 4 ° C. Em seguida, 5 pi de fluorocromo anexina V conjugada (BioLegend, San Diego, CA, EUA) e 10 ul de iodeto de propídio (PI, BioLegend) solução foram adicionados a cada tubo e incubou-se com vortex suave. As células foram incubadas durante 15 min à temperatura ambiente, no escuro e em seguida, 400 ul de tampão de ligação de Anexina V (BioLegend) foi adicionado a cada tubo. As células coradas foram analisadas utilizando um Becton-Dickinson FACS Canto (San Jose, CA, EUA), com e os dados foram analisados ​​com software FACSDiva (BD).

A análise estatística

A significância estatística foi determinada por um Student t-test seguidas ou um one-way análise de variância (one-way ANOVA), seguida pelo teste de Student Newman-Keuls para comparações múltiplas utilizando o software GraphPad Prism (La Jolla CA, EUA).

resultados

Pba citotoxicidade é reforçada pela

NRF2

knockdown no-231 MDA-MB células cancerosas da mama

a fim de investigar o envolvimento de NRF2 na eficácia do PBA-PDT para cancro da mama, estabelecemos um

NRF2

linha -knockdown de células de carcinoma da mama em MDA MB-231. linhas de células estáveis ​​que expressam RNA mexidos inespecífica (sc-MDA) ou

NRF2

espec�ico shRNA (NRF2i-MDA) foram obtidos a partir da seleção puromicina durante 4 semanas. Os níveis de NRF2 e seus genes alvo de expressão foram avaliados nestas linhas celulares. células NRF2i-MDA mostrou uma redução de 85% no

NRF2

mRNA e diminuições substanciais na expressão do NRF2 alvos

AKR1C1

e

HO-1 | (Fig. 1A). A análise Western blot mostrou que as proteínas níveis de NRF2 e AKR1C são substancialmente diminuídas em células de knockdown (Fig. 1B). Estes confirmar a inibição bem sucedida da NRF2 sinalização na linha de células estáveis ​​estabelecida. Em seguida, foi examinada a sensibilidade de

NRF2

-knockdown células MDA-MB-231 para a Pba e terapia de combinação de laser. Sem a irradiação a laser, a incubação de SC-MDA e células MDA-NRF2i com a PBA (0,025-2,5 ug /mL, 24 h) não afectou significativamente a viabilidade celular (Fig. 1C). Do mesmo modo, a irradiação com laser sem Pba incubação não afectou a viabilidade celular (Fig. 1D). Para avaliar a sensibilidade de PDT, as células foram irradiadas com um /cm

2 laser de 0,6-J após incubação com e análise Pba MTT foi realizada de acordo com 18 horas de recuperação. Inicialmente, o efeito de PDT foi avaliada com tempos de incubação variadas do PBA. A incubação do PBA (0,125 ug /mL) durante 2, 6, e 18 h mostrou citotoxicidade semelhante nas células de controlo SC (Fig. 1E). Com base nesse resultado, o h-incubação do PBA 6 foi mantida neste estudo.

(A) os níveis de transcrição da

NRF2

,

AKR1C1

, e

HO-1

foram medidos no controlo (SC-MDA) e

NRF2

células -knockdown (NRF2i-MDA) usando a quantificação relativa de PCR em tempo real. HPRT1 foi usado como um gene de controlo de arrumação. Os dados representam proporções em relação ao SC-MDA e são apresentados como média ± desvio padrão (DP) de 3 experiências. os níveis de (B) e de proteínas de NRF2 AKR1C1 foram determinados por análise Western blot nas células MDA-NRF2i controlo e SC. (C) As células SC-MDA e NRF2i-MDA foram incubadas com a PBA (0-2,5 ug /ml) durante 6 h, e as células viáveis ​​foram quantificadas utilizando um ensaio MTT após uma recuperação de 18 h. (D) As células foram irradiadas por um laser, na ausência de Pba, e as células viáveis ​​foram quantificadas utilizando um ensaio MTT após uma recuperação de 18 h. (E) O SC-MDA foi incubada com a PBA durante 2, 6, ou 18 h e o número de células viáveis ​​foi determinado após irradiação do laser. Os dados representam percentagens em relação ao grupo tratado com veículo, para cada linha de células e são relatados como a média ± SD de 8 poços.

Na análise do MTT, as células MDA-NRF2 eram relativamente mais sensíveis a Pba baseados em PDT: número de células viáveis ​​após a TFD foi menor nas células MDA-NRF2i do que nas células de controlo (Fig. 2a). Da mesma forma, quando a actividade de peptidase derivada de células mortas foi medida no meio utilizando um substrato CytoTox

NRF2

células knockdown mostrou uma citotoxicidade significativamente elevado em comparação com o controlo SC (Fig. 2B)

.

( A) As células MDA-NRF2i controlo SC e foram pré-incubadas com a PBA (0-2,5 ug /ml) durante 6 h e, em seguida, foram irradiadas por 0,6 J /cm

2 laser. Em seguida, a análise de MTT foi realizada de acordo com uma recuperação de 18 h. Os dados representam percentagens em relação ao grupo tratado com veículo, para cada linha de células e são relatados como a média ± SD de 8 poços.

AP 0,05 quando comparado com o controlo SC-MDA em cada concentração do PBA. citotoxicidade induzida por PDT (B) foi avaliada medindo a actividade de protease de células mortas em um meio de cultura de células. As células foram incubadas com a PBA (0,125 e 0,25 ug /ml) durante 6 horas, seguida pela irradiação a laser, e incubou-se durante 18 h. atividade de protease derivada de células mortas foi determinada utilizando substrato fluorogénico AAF-R110. Os dados representam a citotoxicidade relativa com respeito ao grupo de veículo para cada linha de células e são relatados como a média ± SD de 8 poços.

AP 0,05 em comparação com cada controle sc-MDA. A análise por citometria de (C) Um fluxo de células apoptóticas e necróticas foi realizada em células MDA-NRF2i após o tratamento PBA-a laser. As células foram incubadas com PI e Anexina V, e as populações de células foram avaliadas. (D) O gráfico de barras que representa a população de células em Anexina V (AV) + /PI +, AV + /PI-, ou AV- /PI + fase a partir de três experiências separadas.

AP 0,05 em comparação com nenhum controle laser. células (E) NRF2i-MDA foram co-incubadas com Z-VAD-FMK (10 uM) ou necrostatin (NEC-1, 50 uM) e Pba (0,125 ug /mL), durante 6 h; em seguida, as células foram lavadas com PBS e irradiadas com um laser. Após 18 h de incubação, as células viáveis ​​foram quantificadas utilizando um ensaio MTT. Os dados são percentagens em relação ao controlo (sem o PDT e o veículo de tratamento) e são relatados como a média ± SD de 8 poços.

AP . 0,05 em comparação com o controle

PDT induz a morte celular através de vias apoptóticas e necróticas [6], [40]. Em seguida, a fim de identificar o mecanismo de morte celular envolvidos na TFD-tratados

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células de cancro da mama knockdown, análise de FACS com Anexina V e PI coloração dupla foi realizada. células NRF2i-MDA foram tratados com PDT; Imediatamente a seguir, as células foram tripsinizadas e coradas com anexina V (marcador de apoptose precoce) e PI (apoptose tardia e marcador de necrose). Depois de tratamento de combinação PBA-laser, a população de células maioria deslocou-se para a fase apoptótica-necrótica (Fig. 2C). Quantificação de repetições experimentais mostraram que 16,7% das células estavam na fase precoce de apoptose (anexina V + /PI-) e 61,3% das células estavam no apoptótica /necrótico fase tardia (Anexina V + /PI +). Apenas 15,7% das células estavam em fase de não apoptóticas e necróticas não (Fig. 2D). Estes mostram claramente que a TFD induz a morte celular envolvendo o processo de apoptose e necrose. Como uma confirmação, quando as células foram co-incubadas com uma caspase pan-inibidor de Z-VAD-FMK (10 uM) e o PDT (PBA 0,125 ug /ml) Percentagem do número de células viáveis ​​aumentou de 63% para 80,1% (Fig. 2E ). Além disso, a incubação com necrostatin (50 uM), um inibidor potente da morte celular por necrose programado, o número de células viáveis ​​elevado para 78,2%. Tomados em conjunto, os resultados obtidos indicam que o

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células knockdown sensibilizados cancro da mama MDA-MB-231 a PDT baseada em Pba, resultando na morte celular aumentada.

geração de ROS PDT-estimulada é elevada em

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células MDA knockdown

terapia combinada PBA-a laser libera oxigênio singlete dentro da célula, eo ROS resultante é um dos principais contribuintes para a citotoxicidade do PDT [5]. Portanto, nós monitoramos os níveis de oxigénio atómico PDT-derivados em ambas as linhas celulares. As células pré-tratadas com a PBA (2,5 ug /ml durante 6 horas) foram irradiadas por um /cm

2 de laser de 0,6 J, e os níveis de oxigénio de singuleto foram determinados utilizando 1- trans-pireno (2’methoxyvinyl), um corante fluorescente, que é específico para o oxigénio singuleto. Em comparação com o tratamento com a PBA Só ou irradiação a laser, a trans-1- (2’methoxyvinyl) Método baseado em pireno mostrou que o grupo combinação PBA-a laser apresenta um sinal fluorescente melhorada dentro da célula (dados não mostrados), confirmando o aumento oxigénio atómico em cima PDT. Na nossa avaliação inicial, a incubação de pireno de trans-1- (2’methoxyvinyl) durante 5 min, 30 min e 50 min apresentaram níveis semelhantes de aumento de singleto de oxigénio derivados do fluorogénico intensidade pireno (Fig. 3A). Isto confirma que singlet derivados de oxigênio fluorescência pireno pode ser confiavelmente detectável durante estas incubações vezes; portanto, uma determinação confocal foi feita após 30 min de incubação de 1–trans (2’methoxyvinyl) pireno em nosso estudo. A medição comparativa de oxigénio singuleto demonstrado que

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-knockdown células MDA-MB-231 gerar níveis mais altos de oxigénio singuleto do que as células de controlo (Fig. 3B). Os sinais fluorescentes foram distribuídos no interior do citoplasma bem como no núcleo, e a intensidade total de fluorescência foi 1,5 vezes mais elevada nas células knockdown do que nas células de controlo. Por conseguinte, o nível total de ROS, que foi monitorizada usando DCFDA, foi substancialmente elevada depois do tratamento com a combinação de PBA-a laser em ambas as linhas celulares; No entanto, o aumento foi maior nas células MDA-NRF2i. Especificamente, após tratamento com 2,5 jig /ml e Pba irradiação laser, o aumento na ROS foi 4,6 vezes superior no

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linha celular -knockdown do que na linha celular de controlo (Fig. 3C). Do mesmo modo, após o tratamento com a baixa concentração do PBA (0,125 ug /mL) e a irradiação com laser, o aumento na ROS foi de 3,5 vezes mais elevada em células MDA-NRF2i (Fig. 3D). Estes resultados sugerem que a elevação em oxigénio atómico e ROS melhora a sensibilidade do

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células cancerosas da mama -knockdown para PDT.

(A) A sc células de controlo foram incubadas com a PBA por 6 horas e irradiada por um 0,6 J /cm

2 laser. Logo após PDT, foi adicionada uma pireno oxigénio singuleto sensível trans-1- (2’methoxyvinyl) e as células foram incubadas durante 5, 30 ou 50 min, na presença de 1–trans (2’methoxyvinyl) pireno. Em seguida, a observação confocal foi realizada para detectar a formação do corante fluorogénico, o qual foi formado através da reacção com oxigénio singuleto.