Sumário

subtipos moleculares de câncer de ovário seroso foram descritos recentemente. Usando dados de conjuntos de dados independentes, incluindo mais de 900 amostras de tumores primários, mostramos que a desregulamentação do

Deixe-7

via é especificamente relacionado com o subtipo molecular C5 de câncer de ovário seroso. número DNA de cópia e expressão do gene de

HMGA2

, alelos de

Deixe-7

,

LIN28

,

LIN28B

,

MYC

,

MYCN

,

DICER1

, e

RNASEN

foram medidos através de microarray e PCR transcriptase reversa quantitativa. A imuno-histoquímica foi realizada em 127 amostras utilizando microarrays de tecido e os anticorpos anti-HMGA2. Hibridização fluorescente in situ de cromossomas artificiais bacterianos hibridizaram para 239 tumores ovarianos foi utilizado para medir a translocação no

LIN28B

lócus. ARN interferente curto knockdown em linhas celulares de ovário foi utilizado para testar a funcionalidade de associações observadas. Quatro subtipos moleculares (C1, C2, C4, C5) de câncer de ovário seroso de alto grau foram robustamente representado em cada conjunto de dados e mostrou padrão semelhante de sobrevida do paciente. Encontramos activação altamente específico de uma via envolvendo

MYCN

,

LIN28B

,

Deixe-7

e

HMGA2

no subtipo molecular C5 definido por

MYCN

amplificação e sobre-expressão, a sobre-expressão de

alvos MYCN

incluindo o

Deixe-7

repressor

LIN28B

, perda de

Let -7

expressão e

HMGA2

amplificação e sobre-expressão.

DICER1

, um conhecido

Deixe-7

alvo, e

RNASEN

foram sobre-expressos em tumores C5. Nós não viu evidência de translocação no

LIN28B

lócus em tumores C5. A interação entre relatou

LIN28B

e

Deixe-7

foi recapitulada por siRNA knockdown em linhas celulares de cancro do ovário. Nossa desregulamentação resultados associado de

MYCN

ea jusante alvos, incluindo

Deixe-7 Comprar e genes oncofetais, com câncer de ovário seroso. Nós definimos pela primeira vez como os elementos de uma via oncogénica, envolvendo múltiplos genes que contribuem para a renovação das células estaminais, é especificamente alterada em um subtipo molecular de cancro do ovário seroso. Ao definir os drivers de um subtipo molecular de câncer de ovário seroso nós fornecemos uma nova estratégia para a intervenção terapêutica direcionada

Citation:. Helland Å, Anglesio MS, George J, Colin PA, Johnstone CN, Casa CM, et al . (2011) Desregulamentação do

MYCN,

LIN28B

e

LET7

em um subtipo molecular do agressivas de alto grau cancros do ovário serosas. PLoS ONE 6 (4): e18064. doi: 10.1371 /journal.pone.0018064

editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapura

Recebido: 18 de novembro de 2010; Aceito: 18 de fevereiro de 2011; Publicação: 13 de abril de 2011

Direitos de autor: © 2011 Helland et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. AOCS foi apoiado pelo Medical Research Estados Unidos Exército e Comando de Material sob DAMD17-01-1-0729, The Cancer Tasmânia Conselho, a Fundação do Câncer da Austrália Ocidental e do Nacional de Saúde e Pesquisa médica do Conselho da Austrália. Esta pesquisa foi apoiada por uma concessão Victorian Ciências da Vida Computation Initiative (VLSCI) em sua Facility Peak Computação na Universidade de Melbourne, uma iniciativa do Governo de Victoria, e também por doações da Fundação Hospitalar Radium e da Fundação Fredriksen para Pesquisa do Câncer de ovário . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A gestão do cancro do ovário está em transição. É cada vez mais evidente que o cancro do ovário é de uma série complexa de tipos de tumores distintos [1], que necessitam de terapias que visem características moleculares comuns para os subtipos da doença. cancros do ovário seroso de alto grau (HG-SOC) são responsáveis ​​por uma maioria das mortes relacionadas com a doença. Enquanto as taxas de resposta são elevados à quimioterapia adjuvante à base de platina-taxano, houve pouca melhoria na sobrevida do paciente ao longo da última década ou mais, apesar de extensa investigação clínica [2]. inibidores de PARP que exploram deficiências no reparo de recombinação homóloga [3], [4] mostraram a promessa considerável, particularmente em mulheres com linha germinal

BRCA1

ou

BRCA2

mutações. HG-SOC é actualmente tratadas como uma única entidade. Uma compreensão mais profunda dos motoristas moleculares da doença é essencial para que terapias mais eficazes estão a ser desenvolvidos [2]. Recentemente, expressão gênica profiling revelou diversidade desvalorizado dentro HG-SOC delineando quatro subtipos moleculares distintas. Um subgrupo (C1) foi definida por uma assinatura estroma reactivo, correlacionando-se com grande desmoplasia em tais amostras. Os tumores com o assinatura C2 foram caracterizadas por infiltração intra-tumoral de células imunitárias, enquanto que os tumores C4 tinha uma expressão relativamente baixos de genes estromais e elevados níveis de CA125 circulante. O subtipo C5 refletiu uma assinatura de expressão gênica das células mesenquimais, e estes tumores tinham infiltração de células imunes escassos e estavam associados a baixos níveis circulantes de CA125 [5]. Os eventos genéticos que dão origem a cada subtipo molecular de HG-SOC e controlar seu comportamento clínico da doença é desconhecida.

Deixe-7

s são uma família de doze micro relacionadas com a sequência (mi ) RNAs distribuídos em oito grupos genômicos que muitas vezes são sub-regulada no cancro [6], [7], [8].

let-7

emergiu como parte de uma rede reguladora complexo e importante no cancro, cuja expressão reduzida conduz a re-expressão de uma variedade de proteínas oncofetais [6], [9]. Tal como acontece com outros miRNAs,

Deixe-7

moléculas de reconhecer e ligar-se a suas sequências alvo, resultando em ambos repressão translacional e mRNA decadência [10], [11], [12]. Em um nível celular,

Deixe-7

tem efeitos generalizados sobre a diferenciação e auto-renovação [13]. O

HMGA2

gene é um alvo amplamente caracterizada do

Deixe-7

família de miRNAs [6], [9], [11], [14] e codifica uma ligação de DNA e da cromatina modificação da proteína que regula a diferenciação e a renovação das células estaminais [15]. expressão de alto nível de HMGA2 também tem sido associada a mau resultado numa gama de tumores sólidos, incluindo o cancro do ovário [16]. O equilíbrio entre a

HMGA2

e

Deixe-7

expressão tem sido amarrado a manutenção de um estado indiferenciado em células cancerosas [9], [14]. Um loop de feedback negativo que envolve a expressão de alto nível do

Deixe-7

repressores,

LIN28

e

LIN28B

, tem sido associada a várias doenças malignas [14], [17 ], [18]. Os oncogenes c-myc e N-Myc são reguladores positivos de

LIN28

e

LIN28B, respectivamente [19], [20]. Portanto, a desregulamentação dos diferentes aspectos de uma via envolvendo proteínas MYC,

Deixe-7

repressores

LIN28 Comprar e

LIN28B

, vários

let-7

alelos e alvos oncofetais tais como

HMGA2

têm sido relatados em uma variedade de doenças malignas.

Nós utilizamos conjuntos de dados genômicos de mais de 900 HG-SOC para decifrar os caminhos que controlam esta doença. Mostramos que o subtipo C5 de HG-SOC é definida por

Let7

e

MYCN

de-regulação, apresentando uma nova oportunidade para a intervenção terapêutica alvo de câncer de ovário.

métodos

declaração

Ética

Este estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética em Pesquisa com Humanos no Centro Peter MacCallum Cancer, Instituto Queensland de Pesquisa médica, Universidade de Melbourne e todos os hospitais participantes. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes neste estudo.

conjuntos de dados genômicos

Os dados de expressão gênica Microarray foi obtido de quatro coortes, referido como AOCS, TCGA, NCI e da Noruega. O conjunto de dados AOCS (n = 285) foi gerada usando Affymetrix U133 2,0 matrizes e está disponível em Gene Expression Omnibus (GEO). O conjunto de dados Cancer Genome Atlas (TCGA, n = 476) foi gerado usando matrizes Affymetrix HTHGU133a, e obtido através do portal de dados TCGA. O conjunto de dados NCI (n = 185) foi gerado em matrizes Affymetrix U133a e obtidos a partir de Michael Birrer, Massachusetts General Hospital. A Noruega conjunto de dados [21], [22] (n = 64) foi gerada usando arranjos de cDNA personalizado e obtido através do laboratório de um de nós (A. H.). detalhes clínicos para cada conjunto de dados estão resumidos na Tabela S1.

Pacientes e amostras

As amostras para estudos de imunohistoquímica e validação RNA foram obtidos a partir do Australian Ovarian Cancer Study (AOCS), uma coorte de base populacional das mulheres com câncer epitelial de ovário recrutados entre 2002-2006 [5]. Todos os pacientes assinaram uma informação e consentimento do paciente documento institucionalmente-aprovado. Detalhes dos processos de recrutamento de pacientes, coleta de acompanhamento clínico informações, avaliação patológica, o isolamento dos ácidos nucleicos, e preparação de microarrays de tecido são descritos anteriormente [5].

analisa Bioinformatic

A detalhada descrição da bioinformática múltiplas análises utilizado neste relatório é fornecido no suplementar Métodos S1.

quantitativo em tempo real reação em cadeia da polimerase (Q-RT-PCR)

a medição da expressão de genes que codificam foi realizada como descrito anteriormente [23], usando ensaios de expressão de gene de TaqMan (Applied Biosystems) ou verde SYBR (Applied Biosystems). A amplificação por PCR foi realizada em triplicado para cada amostra. controles endógena

HPRT1

e

ACTB

foram incluídos para todos os ensaios e quantificação relativa da expressão de mRNA foi calculada usando a 2

-ΔΔCt método [24]. A expressão de miARNs maduros para

let-7

alelos foi determinada utilizando um ensaio TaqMan miARN (Applied Biosystems) seguindo as instruções do fabricante. Dados adicionais, incluindo primários e tempos de ciclo, são fornecidos em Suplementar Métodos S1.

A imuno-histoquímica e fluorescência in situ hibridação

expressão da proteína HMGA2 foi medida em amostras de HG-SOC em um tissue microarray (n = 127) como descrito em Métodos suplementar S1. De pontuação foi a seguinte: 0 – nenhuma /expressão nuclear fraca ou moderada, 1 – menos de 10% de células tumorais com forte coloração nuclear, 2 – células tumorais com 10-50% de coloração nuclear forte, 3 – células de tumor mais de 50% com coloração nuclear forte. Hibridação in situ fluorescente (FISH) de bacterial artificial chromosome (BAC) sondas de metáfase núcleos foi como previamente descrito [17].

Os ensaios funcionais em linhas celulares

knockdown (KD) de mRNAs alvo foi conseguida usando Dharmacon On-Target Plus Smartpools (Dharmacon, Thermo-Científico) para todos os genes, exceto

MYCN

, que foi alvejado usando Qiagen siRNA Hs_MYCN_3 (Qiagen). Controles incluídos Dharmafect1 sozinho, Dharmacon silenciar non-pool controle,

GAPDH

SmartPool e controle de All-Stars negativo (Qiagen) para

Ensaios MYCN

. Os detalhes das condições de transfecção de cultura de células e KD são fornecidos em Suplementar Métodos S1.

Resultados

subtipos moleculares de HG-SOC

Foi desenvolvido um classificador com base nos subtipos moleculares (C1, C2, C4, C5) identificados em nosso estudo anterior de 215 tumores do Australian Study cancro do ovário (AOCS) [5]. Usando o classificador e um processo de aprendizagem supervisionada, as amostras foram divididas em um dos quatro subtipos moleculares em conjuntos de dados a partir do genoma do atlas do cancro (TCGA) (n = 476), Noruega (n = 64) [21], [22] e o National Cancer Institute (N = 185) [25] (Figura 1A, Tabela S1). padrões consistentes de expressão genética e evolução clínica foram observadas entre os conjuntos de dados. tumores C5 foram consistentemente associada a um mau prognóstico em comparação com o subtipo C2 (Figura 1B-D). Notamos que houve alguma variação na freqüência relativa dos subtipos moleculares nos diferentes conjuntos de dados, o que pode estar associado a diferenças nos critérios de inclusão utilizados em cada estudo.

(A) Heatmap de dados de expressão de genes tomadas da AOCS, TCGA, NCI e conjuntos de dados Noruega mostra que os tumores são classificados em 4 subtipos moleculares. Os genes são agrupadas por correlação de Pearson e as amostras são ordenados por subtipo molecular. Enquanto o K-means originais agrupamento de Tothill et al. é mostrado para a coorte AOCS, um processo de aprendizagem supervisionada foi usado para a classificação dos tumores em outros conjuntos de dados (ver Suplementar Métodos S1). As curvas de sobrevivência (B) de Kaplan-Meier de amostras são traçados. A sobrevivência global é utilizado como o ponto final em todos os quatro conjuntos de dados. Cox modelo de risco proporcional é usado para calcular a significância estatística da diferença na sobrevivência entre os quatro grupos. Teste log-rank p-valor é relatado. (C) As amostras a partir de todos os conjuntos de dados foram combinados para estimar as características de sobrevivência. Os subtipos foram comparados a C5 e o valor de p Log Rank Test dada na tabela. curvas (D) de Kaplan-Meier são traçados para descrever a função de sobrevivência de amostras nos quatro subtipos diferentes depois de combinar as amostras.

HMGA2 sobre-expressão e deixe-7 down regulation

Para identificar caminhos específicos do subtipo estamos focados em tumores C5, que são caracterizadas pela redução da imunorreatividade CA125 circulação, infiltração de células imunes limitado, um fenótipo indiferenciado [5], e pior sobrevida geral do paciente (Figura 1B).

HMGA2

é o mais fortemente sobre-expressa gene específico-C5 (AOCS p 0,0001; TCGA p 0,0001; NCI p 0,0001, dois lados teste de Mann-Whitney; Figura 2A, Tabela S2). Outros marcadores de um fenótipo indiferenciada que são específicos-C5 altamente incluem

DACH1

,

PAX2

,

LAMA1

,

MYCN

,

SOX11

, bem como os membros do grupo de alta mobilidade

TOX

e

TCF7L1

.

Deixe-7

genes-alvo, incluindo

HMGA2 Quais são especificamente desregulada no subtipo molecular C5 de cancros seroso de alto grau. (A), a expressão de ARNm de

HMGA2

é significativamente maior no subtipo molecular C5. (B) Análise imuno-histoquímica da expressão HMGA2 em amostras de cancro do ovário mostrando consistente sobre-expressão em tumores C5. Exemplo de (3+) coloração forte (superior) e sem coloração do painel (parte inferior). (C) Um conjunto básico de

Deixe-7

genes alvos regulados (genes oncofetais) identificadas por Boyerinas et al [6] estão sobre-representados na assinatura gene C5. (D)

Deixe-7

genes alvo obtidos a partir TargetScan5.0 são enriquecidas em tumores C5. O significado de sobreposição entre específica-C5 e

let-7

conjuntos de genes alvo foi determinada pelo teste exacto unilateral de Fisher. lote de barras que representa a associação é mostrada. (* Indica p 0,0001)

A análise imunohistoquímica também demonstrou que os tumores C5 consistentemente expressar altos níveis de proteína HMGA2 (-95% a 3+;. P = 0,02, frente e verso do teste exato de Fisher; Figura 2B e Tabela S3). Ao nível da proteína, os tumores que expressam fortemente também estavam presentes em outros subtipos, embora com uma menor frequência. Estes resultados sugerem que um mecanismo específico de regular

HMGA2

expressão de mRNA ou a estabilidade opera predominantemente em tumores C5, e que os mecanismos de pós-transcricional pode influenciar a expressão da proteína HMGA2 em outros subtipos.

HMGA2

amplificação foi mais comum em tumores C5 (p = 0,005, Mann-Whitney; Tabela S4). No entanto, isso não poderia ser responsável pela maioria das amostras mostrando específico-C5 sobre-expressão, como

HMGA2

é significativamente mais expressa em amostras C5 sem amplificação de

HMGA2

loco (Figura S1). Portanto, enquanto

HMGA2

amplificação é mais comum em tumores C5, mecanismo de amplificação independente (s) deve contabilizar-específica C5 sobre-expressão de mRNA e proteína.

HMGA2

é o alvo mais altamente previsto da

Deixe-7

família de microRNA (miRNA) no genoma [6], [9], [11], [14], sugerindo reduzida

Let -7

expressão como uma explicação alternativa para o padrão de

expressão HMGA2

em tumores C5. Coerente com isso, observou-se-específica C5 sobre-expressão de outro gene normalmente reprimida pela

Deixe-7

, incluindo um conjunto de doze genes oncofetais definidos pela Boyerinas

et al.

[6 ] (Figura 2C; p = 4,8 × 10

-8, frente e verso do teste exato de Fisher). Um conjunto de genes derivados de forma independente das 100 mais bem classificados

Deixe-7

genes alvo previsto utilizando um modelo de miRNA previsão alvo [26] também foi enriquecido de forma significativa no subtipo C5 (p 0,0001, de um lado exato de Fisher teste) (Figura 2D).

em seguida, medido diretamente a expressão do

Deixe-7

família em amostras AOCS usando um ensaio TaqMan e compararam os resultados com os dados de miRNA microarray do conjunto de dados TCGA. Descobrimos que

Deixe-7b

,

-7d

, e

-7i

foram significativamente sob expressa em tumores C5 em comparação com outros subtipos em ambos os AOCS e coortes TCGA ( Tabela 1).

Deixe-7c

,

-7e

e

-7f

também foram significativamente sob expressa em C5 em qualquer TCGA ou conjuntos de dados AOCS. A diferença entre as duas coortes com estes alelos podem dizer respeito a sensibilidade da plataforma de ensaio utilizado, microarrays miRNA para TCGA e TaqMan ensaios para as amostras AOCS.

A desregulamentação de let-7

Nós exploramos possíveis causas de expressão de baixo nível de

let-7

alelos. deleções genômicas, ensaiadas por matrizes à base de SNP no conjunto de dados TCGA, mostraram que a perda envolvendo região cromossómica 22q13.31, abrangendo

Deixe-7b

e

Deixe-7a3

, foi mais comum em tumores C5 (p = 0,018) (Tabela S5). Embora a perda de 22q13.31 pode contribuir para redução da expressão de

Deixe-7b

em alguns tumores, não seriam responsáveis ​​pelos efeitos observados com outros

Deixe-7

alelos, que são distribuídos ao longo 8 loci e são mais propensos a ser de-regulamentada em

trans. Defeitos de miRNA máquinas de processamento, incluindo redução dos níveis de Dicer (

DICER1

) e Drosha (

RNASEN

), têm sido associados a mau resultado em HG-SOC [27], no entanto, maior expressão de

DICER1

foi observada no subtipo C5 (Figura S2).

DICER1

níveis foram mostrados para ser regulamentado negativamente pela

Deixe-7b

[28], [29], potencialmente explicar o específico do C5 sobre-expressão de

DICER1

.

Lin28 e Lin28B regular negativamente

Deixe-7

níveis através da ligação aos laços terminais dos precursores do

Deixe-7

família miRNA, processamento bloqueando assim em miRNAs maduros [17], [30], [31], [32]. Descobrimos que a expressão de

LIN28B

, mas não

LIN28

, foi altamente enriquecido em tumores C5 (AOCS p 0,0001, TCGA p 0,0001, frente e verso Mann Whitney; Figura 3A e Figura S2). Translocação entre os

HACE1

e

LIN28B

tem sido sugerido para resultar em de-regulação da

LIN28B

e resultam em reduzidos

let-7

níveis [17 ]. FISH em uma TMA de 239 tumores de ovário, incluindo 73 do subtipo molecular conhecido encontrou evidências de rearranjo entre o

HACE1

e

LIN28B

em apenas um único núcleo de um tumor HG-SOC do subtipo molecular desconhecido (Tabela S6), sugerindo que este mecanismo para

LIN28B

-regulação é rara em carcinoma de ovário.

Boxplots (a) mostram expressão diferencial de

LIN28B

e

MYCN

em diferentes subtipos moleculares de serosa cancros do ovário AOCS conjunto de dados. (B) cópia de DNA níveis de número e níveis de expressão

MYCN

estão altamente correlacionados. amostras C5 (codificados em vermelho) estão predominantemente distribuídos no canto superior direito do gráfico. As amostras com razão de log número de cópias segmentada superior a 0,3 foram considerados como tendo um ganho de

MYCN Comprar e amostras com razão de log segmentada menos de -0.3 foram considerados como tendo uma perda. O teste exato de Fisher foi usado para calcular a significância estatística da associação. (C) Associação entre

MYCN

metas e conjuntos de genes C5.

MYCN

alvos foram extrapolados a partir da interseção de duas listas de genes, (1) genes ligados por N-myc no rato embrionárias linhas celulares e (2) genes com aumento de 2 vezes na expressão seguinte transfecção de N-myc em células embrionárias de rato (veja suplementar Métodos S1). Usando dados de AOCS ou a expressão do gene TCGA define genes foram classificados como de alta ou baixa em tumores C5 contra todos os outros tumores (C1-C4) a p 0,001 por-dois lados t-teste. O significado de sobreposição entre as séries e gene C5

MYCN

conjuntos de genes foi determinada pelo teste exato de Fisher unilateral. lote de barras que representa a associação é mostrada.

A desregulamentação dos

MYCN

Recentemente, tanto c-Myc e N-myc foram mostrados para regular

LIN28

e

LIN28B

expressão [19], [20], no entanto, não foi encontrada diferença na expressão de

MYC

entre C5 e tumores não-C5. Curiosamente, o ganho de

MYC

foi mais comum em tumores não-C5 (p 0,01) (Tabela S4). Por outro lado,

MYCN

foi significativamente sobre-expressa em tumores C5 (AOCS p 0,0001, TCGA p 0,0001, dois lados teste de Mann Whitney; Figura 3A). No conjunto de dados TCGA onde estavam disponíveis tanto no número de cópias e expressão de dados,

MYCN

copiar ganho número foi altamente enriquecido no subtipo C5 (p 0,0001, frente e verso teste de Mann-Whitney; Figura 3B). Enquanto houve uma correlação significativa entre o

MYCN

número de cópias e expressão gênica, algumas amostras C5 sobre expressas

MYCN

sem amplificação do gene, sugerindo outros mecanismos de regulamentação específica do subtipo. Outra evidência de actividade de N-myc foi obtida por análise de expressão de genes alvo conhecidos nas AOCS e TCGA coortes [33]. Em ambos os conjuntos de dados observou-se um enriquecimento significativo na expressão de genes-alvo N-Myc em tumores C5 (AOCS p 0,0001, TCGA p 0,0001, de um lado o teste exato de Fisher, Figura 3C), incluindo trans-ativação de

LIN28B

.

MYCN

e

HMGA2

expressão também foram altamente correlacionados significativamente (Figura S3). Observamos desregulamentação altamente específico de membros individuais da

MYCN-Lin28B-Let7

via em tumores C5, bem como um conjunto mais amplo de

MYCN Comprar e

Let7

transcrição alvos . Para entender a extensão em que o

Let7

via define tumores C5, foi utilizada uma análise de impacto percurso descrito recentemente sinalização (SPIA) [34] para sondar outras dependências via de sinalização. Entre 87 vias de sinalização testado,

Let7

era a via mais significativamente regulada em tumores C5 (Tabela S7). genes assinatura para todos os subtipos são apresentados na Tabela S8.

Análise funcional de associações via

Para explorar o significado funcional de nossas descobertas em tumores primários, buscamos dados genômicos de 40 linhas de células de ovário. A2780 e CH1 aproximada tumores C5 mais de perto, já que ambos expressaram baixos níveis de

Deixe-7

alelos, e altos níveis de

HMGA2

e

LIN28B

(Figura S4A, S4B ). No entanto, apenas CH1 expresso

MYCN

, nem linha mostrou amplificação do

MYCN

lugar, e ambos fortemente expresso

LIN28

, o parálogo de

LIN28B

(Figura S4B, S4C). Seguindo sistemática knock-down de

LIN28,

LIN28B

e

MYCN

acompanhámos expressão dos

let-7

alelos. Em ambas as células A2780 e CH1, siRNA combinada knock-down (KD) de ambos

LIN28

e

LIN28B

resultou em aumento da regulação de praticamente todos os membros let-7 família (Figura S5A-B ), consistente com relatórios anteriores [17], [31]. KD da

LIN28B

era geralmente não tão substancial como

LIN28

(máximo atingido 70% KD, em comparação com 90% KD) e foi associado com menor impacto sobre

Deixe-7

expressão. Da nota particular,

Deixe-7

-regulação seguinte

LIN28 /LIN28B

KD não foi imediata; apesar

LIN28

e

LIN28B

mRNA sendo suprimida dentro de 48 horas,

Deixe-7

-regulação não era detectável até 96 horas. KD de

MYCN

ARN foi difícil obter (métodos suplementares S1) na linha celular de CH1. Na melhor das hipóteses uma redução da expressão de mRNA de 60% foi alcançada (Figura S5B) e pouco efeito sobre

LIN28B

ou

Deixe-7 foi observada

expressão. Nem KD da

LIN28

,

LIN28B

, nem

MYCN

teve um efeito significativo na proteína HMGA2 ou expressão de mRNA (Figura S5C). No entanto, tal como observado em alguns tumores C5, CH1 células têm de amplificação

HMGA2

(Figura S4B), sugerindo que esta linha celular tem um mecanismo alternativo de HMGA2 sobre-expressão.

Discussão

uma série extensiva de experiências gain- e perda de função em linhas celulares demonstraram uma interacção funcional entre a N-myc e Lin28B [20]; Lin28B e deixe-7 [17], [30], [31], [32]; e deixe-7 e HMGA2 e outras proteínas oncofetais [6]. Aqui mostramos que cada elemento de via é especificamente expresso de uma forma que seria responsável pela profunda sobre-expressão de outras proteínas e HMGA2 oncofetais em uma grande proporção de tumores C5 (Figura 4, Tabela S9). Ganhar ou sobre-expressão de

MYCN

não foi anteriormente associado com câncer de ovário seroso. Embora um nível de amplificação não é tão elevada como geralmente descrito em neuroblastoma [35], encontramos significativa sobre-expressão de genes-alvo N-MYC em tumores C5 suportam a visão que é funcionalmente activa. Dados recentes mostram que mesmo baixo nível de ganho do número de cópias de

MYCN

pode influenciar significativamente o resultado do paciente em meduloblastoma [36].

MYCN

sobre-expressão foi altamente C5-específica e mecanismos, além de amplificação são susceptíveis de contribuir para este

Cada evento é significativamente enriquecido em C5 contra tumores seroso de alto grau não-C5.:

MYCN

amplificação p 0,0001;

MYCN

sobre-expressão p 0,0001; sobre-expressão

MYCN

como alvo p 0,0001;

LIN28B

sobre-expressão p 0,0001; sub-expressão

Deixe-7

alelos p ,01-,0001;

HMGA2

amplificação p 0,001,

HMGA2

sobre-expressão p 0,0001 (dados TCGA). Cumulativamente perda de let-7b, e /ou ganho de HMGA2, e /ou ganho de MYCN ocorrem em 77,8% das amostras em C5 subtipo (p 0,0001, teste exato de dois lados de Fisher; Tabela S4).

é provável que vários mecanismos levam à

HMGA2

expressão específica subtipo incluindo

MYCN

amplificação, perda de específico

Deixe-7

alelos incluindo

Let -7b

, e amplificação de

HMGA2

si. Por exemplo, em CH1 células

LIN28

e

LIN28B Quais são ambos mais expressa e reprimir

Deixe-7

expressão, no entanto, essas células também mostram

HMGA2

amplificação. Encontramos também uma associação significativa entre o fenótipo molecular C5 e perda de

Deixe-7b

. A expressão de

Deixe-7b

foi reduzida em ambos os AOCS e conjuntos de dados TCGA, e é de salientar que, entre

Deixe-7

alelos,

Deixe-7b

tenha sido previamente relatado como sendo sob expressa em HG-SOC [37]. Embora as diferentes alelos de

Deixe-7

parecem ter como alvo sequências muito semelhantes, a presença de múltiplos genes independentes, sua expressão diferencial durante o desenvolvimento [7] e os nossos dados implicam que desempenham papéis seletivos.

a sobre-expressão de

MYCN

e

let-7

alvos em tumores C5 acrescenta peso à importância funcional da amplificação e sobre-expressão de

MYCN

eo redução significativa na expressão de

let-7

alelos. Knockdown de

LIN28

e

LIN28B

expressão resultou na re-expressão de

Deixe-7 fabricante fornecendo evidências adicionais de uma cadeia de interações em tumores do ovário. No entanto, outras interacções estabelecidas não foram observados nas linhas celulares do cancro do ovário testadas aqui. Por exemplo, embora

HMGA2

é um alvo bem definido de

Deixe-7

[6], tanto no ganho e experiências de perda de função, restauração de

Deixe-7

expressão não se visivelmente influenciar

HMGA2

expressão. Estes resultados podem ser explicados pela supressão experimental limitada da

LIN28B

e

MYCN

, o fato de que nem CH1 nem celulares A2780 linhas fielmente fenocópia todos os defeitos moleculares observados tumores C5, ea ampliação da

HMGA2

em células CH1. Observamos também que

Deixe-7

expressão foi restaurado somente após um longo período (96 h) do knockdown mediado por siRNA de

LIN28

e

LIN28B

, sugerindo que é difícil para reiniciar a via, uma vez que foi regulada para baixo. Uma validação adicional das nossas descobertas exigirão linhas celulares derivadas de tumores C5 que compartilham mais de perto as características moleculares de suas contrapartes principais.

Enquanto elementos desta via tenham sido previamente demonstrado ser de-regulada no cancro do ovário [37 ], [38], o nosso relatório é o primeiro a mostrar perturbações caminho completo e sua associação com um subtipo específico de HG-SOC. Nossa análise indica que o

Deixe-7

percurso é exclusivamente de destaque entre os eventos de sinalização alterados nos tumores C5, e aparece para esculpir o seu perfil transcricional. A identificação de subtipos moleculares de cancro da mama [39], [40] e certos cancros hematológicos tais como linfoma difuso de células B grande [41], [42], [43] forneceram pontos de partida poderosos para descobrir controladores específicos do subtipo de doença. regulação concomitante baixo de

Deixe-7

e aumentada

HMGA2

expressão resulta em tumores menos diferenciados com características semelhantes a células-tronco [6], [9], [13], [14], [15]. Estas observações são consistentes com a baixa expressão de marcadores de diferenciação nos tumores C5 [5], incluindo

MUC16

, o alvo do anticorpo CA125 utilizado clinicamente para o diagnóstico do cancro do ovário e prognóstico. O nosso trabalho pela primeira vez, define um percurso em HG-SOC que está associado com e parece conduzir a um comportamento biológica e clínica de um subtipo moleculares distintos de cancro do ovário, o que sugere uma abordagem terapêutica alvo neste grupo de pacientes.

Informações de Apoio

Figura S1.

gene HMGA2 é significativamente sobre-regulada em tumores C5 de TCGA. (A) a expressão do mRNA de

HMGA2

com base em todas as amostras de TCGA (B) HMGA2 é sobre-expresso em amostras sem amplificação de locus de HMGA2

doi:. 10.1371 /journal.pone.0018064.s001

(TIF)

Figura S2.

expressão de um número de genes específicos C5 medidos utilizando qRT-PCR. Isto é feito para validar os dados expressão microarray da coorte AOCS. Boxplots que descrevem a relação entre os níveis destes genes e subtipo molecular (C5 ou não-C5) de expressão são mostrados, p-valores são calculados utilizando Wilcox no teste de classificação soma

doi:. 10.1371 /journal.pone.0018064.s002

(TIF)

Figura S3.

níveis HMGA2 e expressão MYCN. níveis (A) HMGA2 e expressão MYCN são correlacionados em amostras TCGA.