Abstract

O uso de linhas celulares ou modelos animais tem desvantagens significativas quando se lida com um conjunto de doenças heterogêneas tais como câncer epitelial de ovário. Isto tem relevância clínica em que os biomarcadores desenvolvido utilizando modelos da linha de células ou animais muitas vezes não são transferíveis para o ambiente clínico. Neste estudo, descrevemos o desenvolvimento de um protocolo robusto para o desenvolvimento de culturas primárias de cancro do ovário que irá ultrapassar algumas destas dificuldades. Mulheres submetidas a uma cirurgia para câncer de ovário foram recrutados e amostras de ascite e depósitos de tumores sólidos foram usados ​​para desenvolver culturas primárias. As células foram caracterizadas, utilizando um painel de anticorpos de imunofluorescência antes da utilização numa variedade de ensaios, incluindo a avaliação funcional das vias de reparação de ADN. Durante o período de estudo de quatro anos, culturas viáveis, confirmado para ser epitelial de origem foram gerados a partir de 156 de 172 (91%) casos recrutados. Caracterização foi realizado utilizando um painel de anticorpos, incluindo pancitoqueratina, CA125, EpCAM, MOC-31, D2-40 e vimentina. Senescência ocorreu entre o 2

º e 8

th passagens em todas as culturas, exceto aquele em que imortalização espontânea ocorreu. As células podem ser cultivadas com sucesso, mesmo após um período de armazenagem a 4 ° C e as células cultivadas foram capazes de ser usados ​​para uma variedade de aplicações, incluindo ensaios funcionais. Após a avaliação funcional foi mínimo heterogeneidade intra-tumoral. Por conseguinte, é possível derivar as culturas de células de cancro do ovário viáveis ​​na maioria dos pacientes submetidos a cirurgia. Células cultivadas diretamente de cancros paciente fornecer um modelo preciso e altamente diversificada

Citation:. O’Donnell RL, McCormick A, Mukhopadhyay A, Woodhouse LC, Moat M, Grundy A, et al. (2014) o uso de células do cancro do ovário de Cirurgia Pacientes Submetidos para gerar culturas primárias capazes de sofrer Análise Funcional. PLoS ONE 9 (3): e90604. doi: 10.1371 /journal.pone.0090604

editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 13 de novembro de 2013; Aceito: 02 de fevereiro de 2014; Publicação: 06 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 O’Donnell et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a principal causa de mortalidade por câncer ginecológico. em todo o mundo [1] e, apesar de muita investigação sobre o tratamento do cancro do ovário da mortalidade geral pouco mudou ao longo dos últimos 20 anos com a 5 anos de sobrevida global de 30-39% [2]. Tem sido desde há muito reconhecido pelos clínicos que o cancro do ovário é um conjunto de doenças heterogéneas, mas apesar disso o carcinoma do ovário continua a ser tratado clinicamente como uma única doença, usando uma combinação de cirurgia e quimioterapia citorredução à base de platina. A variação observada no comportamento clínico de câncer de ovário junto com os crescentes dados de relatórios heterogeneidade molecular sugere que um modelo heterogêneo para o estudo do câncer de ovário é muito atrasada. O conceito emergente da medicina personalizada baseada em biomarcadores de resposta a novos tratamentos visando defeitos específicos no reparo do DNA do tumor só é possível se os biomarcadores podem ser testados usando um modelo realista.

As linhas celulares fornecem uma ferramenta valiosa para o estudo biológico funções ao nível molecular e celular. Existentes linhas celulares de cancro do ovário humanos possuem a vantagem de alta capacidade proliferativa, clonogenecity e tempo de vida prolongado em cultura. No entanto, a maioria adquiriram alterações genéticas significativas de suas celas de origem, incluindo a exclusão de importantes genes reguladores do ciclo celular de apoio a imortalidade. Além disso, existe evidência para sugerir que muitas linhas celulares de conter erros de identificação significativa, a duplicação, e perda de integridade [3].

As células primárias são isoladas a partir de pacientes com frequência consideravelmente diferentes a partir de linhas celulares estabelecidas de origem semelhante. A capacidade de cultura e caracterizar OSE isolada de fresco (epitélio da superfície do ovário) e EOC (cancro do ovário epitelial) as células de pacientes proporciona um sistema experimental importante que tem o potencial para assemelhar-se à situação do paciente com mais precisão [4], [5].

Existem duas fontes de material clínico, que têm sido usados ​​para gerar culturas primárias em cancro do ovário: fluido ascítico e tecido de tumor sólido. estudos de expressão de genes têm indicado diferentes perfis biológicos nas células cancerígenas derivadas destas duas fontes do mesmo paciente em termos de metástase, invasão e angiogénese [6]. O fluido ascítico tem várias vantagens sobre o tecido de tumor sólido na geração de culturas primárias. O fluido ascítico é relativamente fácil de obter e de cultura das células em suspensão é tecnicamente simples. culturas ascítico foram mostrados para gerar uma população homogénea de células epiteliais rica em comparação com os obtidos a partir de tecidos sólidos. Uma parte significativa das pacientes com câncer de ovário, presentes em estágio avançado e tem grandes volumes de líquido ascítico que pode ser obtido durante a cirurgia ou paracentese. No entanto, como a maioria dos pacientes com grandes tumores ascite de volume têm de um subtipo seroso de alto grau histológico, ascite apenas a amostragem será sub-representar os outros subtipos histológicos. Cultura de tumor sólido, em particular na ausência de ascite é, por conseguinte, também necessária para capturar um grupo representativo de amostras.

Cultura de células primárias a partir de qualquer fonte pode fornecer um recurso para testar o perfil molecular e da realização dos estudos funcionais do indivíduo cancros. Nos últimos anos, a associação entre o tumor molecular heterogeneidade, sobrevivência e /ou resposta ao tratamento foi reconhecido [7] e tem alimentado a busca de biomarcadores para prever a resposta a novas terapias alvo vias de reparo de DNA desregulados no câncer de ovário.

Vários métodos para a cultura de células de cancro do ovário isolados primários a partir de ascites foram descritos [8]. Estes métodos, contudo, exigir procedimentos complexos de multi-passo. Dunfield

et al

e Pastor

et al

descrever um método de cultura mais simples e confiável envolvendo mistura ascite diretamente com o meio que resulta em cultura de células epiteliais [4], [9]. Esta técnica foi adaptada pelo nosso grupo para uso em pesquisas sobre o estado funcional dos mecanismos de reparo do DNA e aqui apresentamos a nossa experiência desta técnica.

Métodos

declaração Ética

O estudo foi aprovado pelo comitê de ética local (Reino Unido IRAS North West comissão de ética – 12 /NW /0202). e todos os pacientes assinaram consentimento informado

Reagentes

Rucaparib foi um presente de Clovis (EUA) e é um potente inibidor de PARP-1 e -2 (proteína com uma constante de inibição de 5 nM). Todos os outros produtos químicos e reagentes de cultura de tecidos foram da Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Reino Unido), salvo indicação em contrário.

Cultura de Células

coleta de amostras.

A ascite e sólida tecido foi coletada de pacientes consentiram submetidos à cirurgia para câncer de ovário no queen Elizabeth Hospital, Gateshead, Reino Unido. detalhes clínicos foram gravadas e amostras registradas e tratadas de acordo com a Human Tissue Act. As amostras foram atribuído um número de referência PCO (Cultura Primária Ovário) para manter o anonimato.

transporte de Amostras e preparação.

A ascite foi aspirado diretamente do paciente em um frasco de sucção estéril. tumor sólido foi colocado em um meio de cultura contendo universal estéril (RPMI 1640 meio suplementado com 20% FCS, 20 mM de L-glutamina e 1% de penicilina e estreptomicina) pré-aquecido a 37 ° C. As amostras foram transportadas do hospital para o laboratório imediatamente em conformidade com os regulamentos do Reino Unido Categoria B UN3373.

Cultura Primária de ascite.

A cultura celular foi realizada utilizando uma técnica asséptica numa laminar nível de contenção II fluir gabinete de segurança microbiológica. 20 ml de ascite foi adicionado a 20 ml de meio de cultura aquecido (RPMI com FCS a 20%, como acima), em frascos T75 (Corning, EUA) e incubou-se a 37 ° C, 5% de CO

2, 95% de ar humidificado . O meio foi aspirado e 13 ml de meio fresco foi aquecida substituído no dia 3 a 5. O meio foi substituído a cada 4 a 5 dias até que as células de confluência abordados. As células foram passadas, congeladas e descongeladas tal como previamente descrito [10]. As culturas celulares foram colocados em quarentena em uma incubadora primária para aguardar os resultados formais de exame patológico e para garantir que as amostras infectadas não foram introduzidos na cultura geral.

cultura primária do tumor sólido.

Uma vez no laboratório, o tumor sólido foi dissecado em ~ 3 mm

3 pedaços usando um bisturi estéril e transferido para frascos contendo solução de T25 (Roche, Reino Unido) suficiente colagenase /dispase (1 mg /1 mL em meio completo), para imergir completamente a amostra. As células foram incubadas durante 2 horas a 37 ° C num agitador orbital (IKA Vibrax-VKR-) em 2 × G. A suspensão de células foi transferida para um recipiente universal, centrifugado a 400 x g durante 5 minutos, lavou-se PBS, re-suspensas em meio completo e colocadas num frasco T25 durante 30 minutos para permitir a sementeira de fibroblastos. A suspensão de células epiteliais foi transferido para um frasco T25 para.

otimização on-going de cultura de células Cultura

cultivo direto em lamelas.

Hora da coleta à avaliação funcional pode ser até 14 dias. Para reduzir o comprimento da cultura e manipulação antes do uso, meios de comunicação e do líquido de ascite (01:01 v:v) foi adicionado diretamente na tampa estéril desliza para análise imediata.

Cytospinning.

ascítico foi fluido cytospun directamente em lâminas de microscópio, após optimização da velocidade de centrifugação, o volume da amostra e o enriquecimento de fluido ascítico usando a adição de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Seguindo cytospining, as lâminas foram secas ao ar, fixadas com 100% de metanol e armazenadas a -20 ° C para a caracterização mais tarde.

Caracterização

O câncer de ovário é um conjunto de doenças heterogêneas. Além disso, o fluido ascítico contém uma variedade de tipos de células e um marcador único é, por conseguinte, insufficent para diferenciar de forma fiável células epiteliais de cancro do ovário a partir de outros tipos de células. Um painel de caracterização que consiste em morfologia cultura de células, coloração de imunofluorescência de células fixas, bem como exame anatomopatológico e imuno-histoquímica padrão foi combinado para garantir caracterização epitelial precisas de cada cultura.

Morfologia.

características morfológicas foram estudadas sob um microscópio invertido Olympus CK40 a 20 × ampliação. As imagens foram capturadas usando software VisiCam (VWR, EUA).

imunofluorescência.

As técnicas padrão de imunofluorescência foram usadas para manchar para pancitoqueratina, molécula de adesão celular epitelial (EpCAM), o antígeno do câncer 125 (CA125 ), epiteliais antígeno relacionado (MOC-31), D2-40 e vimentina, Tabela 1. Nenhum dos marcadores positivos são uniformemente expresso em todas as células EOC mas interpretados em combinação permite a selecção de culturas apropriadas.

histopatologia formal

exame patológico e citológico formal de ascite e amostras de tumores sólidos de pacientes que doam amostras PCO foi realizado e usado para caracterizar ainda mais as culturas.

Quando todas as caracterizações foram em harmonia com epitelial origem ovariana, as amostras foram, em seguida, utilizado em experiências subsequentes. Quando os resultados foram inconsistentes com a origem epitelial, as culturas foram descartados.

ImageStream

X caracterização

culturas PCO estabelecidas e ascite frescas.

células PCO, cultivadas utilizando os métodos acima, foram tripsinizadas, fixadas com 0,4% de paraformaldeído durante 20 minutos a 4 ° C, e permeabilizadas com BD Phosflow Perm /lavagem I (BD Biosciences, EUA; 01:10 v:v água destilada).

para ascite frescos, dez ml de fluido ascítico foi filtrada para excluir detritos grandes (180 um filtro de nylon de poro, Millipore, Reino Unido). Medida que o fluido ascítico é frequentemente contaminado com sangue, a adição de um fixador contendo tampão de lise de glóbulos vermelhos (01:05 v:v BD Phosflow Lyse /Fix tampão de lise de glóbulos vermelhos, BD Biosciences, EUA) a depleção de células activado vermelhas do sangue. As células foram permeabilizadas com BD Phosflow Perm /lavagem I e a amostra enriquecida pela depleção de células brancas do sangue utilizando EasySep Humano CD45 Depleção Kit (StemCell tecnologias, França), de acordo com as instruções do fabricante.

Todas as amostras foram depois incubadas com anticorpos marcados com immunoflourescent durante 12 horas a 4 ° C, incluindo pancitoqueratina, EpCAM, CA125, corante nuclear e DRAQ5 antigénio comum leucicytoe (CD45) para identificar as células brancas do sangue. As amostras foram processadas usando ImageStream

X (Amnis, EUA) com software IDEIAS utilizada para quantificar a proporção de células que expressam os três marcadores epiteliais, bem como fornecendo uma avaliação da co-expressão.

Crescimento e citotoxicidade ensaios

SRB.

Um ensaio de rotina de sulforrodamina B (SRB) foi utilizado para avaliar a citotoxicidade e o crescimento celular, como descrito anteriormente [11]. Resumidamente, as células foram semeadas a uma concentração de 1000 células /poço e após a adesão, tratado com várias concentrações de rucaparib durante 10 dias antes da fixação, coloração e avaliação espectrofotómetro.

Ensaios clonogénicos.

clonogénicas os ensaios são considerados padrão-ouro para a avaliação da citotoxicidade. 50.000 células /poço foram semeadas numa placa de 6 poços por 24 horas. As células foram então incubadas durante 24 horas com várias concentrações do agente citotóxico antes reseeding em concentrações de 2.500, 5.000 e 10.000 células para cada tratamento medicamentoso. As células foram incubadas a 37 ° C durante 14 dias. O meio foi aspirado, as placas foram lavadas em PBS e em seguida fixadas com fixador de Carnoy o (ácido acético: metanol 1:3 v /v).., Seguido por coloração com violeta de cristal a 1%

clonogenics Agar

50.000 células foram semeadas em poços contendo meio e tratou-se como acima durante 24 horas em meio de agarose. As células foram então trysinised, lavadas e re-semeadas em agarose semi-sólida (Promega, Reino Unido) meios de comunicação, a uma variedade de concentrações, e incubou-se durante 14 dias. As colónias foram coradas utilizando 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT).

transfecção celular

luciferase plasmídeo expressando pGL2 (Promega, EUA ) foi transfectado usando dois métodos. Em primeiro lugar, o protocolo do fabricante (Invitrogen, EUA) para a transfecção de células com Lipofectamine TM LTX com o Plus reagente foi usada para transfectar culturas PCO com 1-6 ug de ADN por poço. Em segundo lugar, a 250 ul de suspensão de células PCO contendo 1 × 10

6 células /ml foi misturado com 1-5 ug de plasmídeo pGL2 em cuvetes de 4 mm de electroporação (Eurogentec, Bélgica). A electroporação foi realizada utilizando um electroporador EPI-2500 a 100-500 volts. Os transfectantes de ambos os métodos foram colhidas 48 horas após a transfecção e ensaiados quanto à actividade de luciferase.

Além disso, as culturas foram transfectadas utilizando PCO MISSÃO ™ shRNA partículas de transdução de lentivírus (Sigma-Aldrich, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante.

homóloga recombinação ensaio

As células foram semeadas em lamelas de vidro e tratou-se com 2 Gy de radiação ionizante e rucaparib na concentração de 10 uM durante 24 horas para induzir quebras na cadeia dupla (DSB). Todos os experimentos foram realizados juntamente com os controles não tratados com o equivalente de DMSO de 0,1%. As células foram depois fixadas e re-hidratadas antes da coloração com anticorpos com adequada 1:100 monoclonal de ratinho anti-γH2AX (Upstate, Millipore Corp., EUA) e anticorpos policlonais de cabra anti-1:100 Rad51 (Calbiochem, EMD Biosciences, Inc., EUA) anticorpos conjugados com fluorocromos secundárias, como descrito anteriormente [5].

software Image J. contagem [12], [13] foi usado para contar γH2AX e RAD51 focos nucleicos. As células foram classificados como recombinação homóloga (HR) competente se houver mais do que um aumento de 2 vezes na Rad51 focos após danos no DNA, confirmada por um aumento de 2 vezes na γH2AX.

Resultados

Geração de culturas primárias de ascite

a ascite foi coletada de 172 pacientes do cancro do ovário submetidos primária (67%) ou a cirurgia primária atrasada (após três a quatro ciclos de quimioterapia neo-adjuvante à base de platina; 33%) entre 2008 e 2013 . culturas viáveis ​​foram gerados em 166/172 (97%) casos. Eritrócitos e restos celulares de ascite não aderir ao frasco de cultura e foram removidos seguinte alteração de mídia. Em geral, a aparência de cada cultura era o de um padrão de calçada monocamada, Figura 1 (A), tal como descrito por Dunfield

et ai

[4]. O fluido ascítico é composto por vários componentes celulares e, a fim de confirmar o crescimento exclusiva de células do cancro caracterização de células em cultura é necessária. Immunoflourescent caracterização das culturas foi realizada utilizando o painel de anticorpos anti-CA125 detetct expressão de pancitoqueratina, EpCAM, MOC-31, D2-40 e vimentina, Figura 1 (B-F). 10/166 (6%) foram rejeitadas porque não conseguiram demonstrar maior do que 95% de positividade citoqueratina. A taxa de sucesso global, por conseguinte, para a criação de culturas primárias epiteliais ascítico de pacientes submetidos a cirurgia foi 156/172 (91%). exame histopatológico de rotina de tecido FFPE de cada paciente foi realizada, Tabela 2. O tipo histológico predominante foi o câncer seroso de alto grau

A:. Brightfield demonstrando paralelepípedos monocamada; imagens immunoflourescent com anticorpos direcionados contra: B: FITC-anti-pancitoqueratina; C: AlexaFluor 596 anti-CA125; D: Alexflour 488 anti-EpCAM; E: AlexaFluor 596 anti-MOC 31; F: Alexaflour 596 anti-vimentina

Em um subconjunto de amostras, avaliação immunoflourescent de expressão CA125 na amostra PCO foi comparada com a expressão CA125 na análise imuno-histoquímica do tecido FFPE do mesmo paciente , Figura 2. Correlação dos resultados das duas avaliações foi observada em 8/11 (72%) casos. Nos restantes três casos, dois apresentaram expressão IHC de CA125 única, enquanto que um mostrou IF expressão única

PCO 158 A:. Detecção imuno-histoquímica de CA125 no tecido FFPE; B: detecção Immunofluourescent de CA125 com Alexaflour596 da cultura primária correspondente

morfologia celular foi estudada ao longo do tempo e foi visto que a maioria das culturas eram da morfologia de paralelepípedos mas as células de passagem tardia (normalmente seguinte passagem 4 /5) desenvolveram um fenótipo mesenquimal mais, tornando-se alongado e apresentando uma taxa de crescimento significativamente reduzida. Senescência ocorreu entre as passagens 2 e 8, mais comumente entre os dias 4 e 5

th, tornando assim a caracterização adicional no fim da passagem impossível. As culturas foram considerados sem êxito quando nenhum crescimento foi observado após 28 dias. Uma cultura espontaneamente imortalizada e foi crescido para mais de 20 passagens. Não está claro por que a cultura da ascite é mal sucedido em uma proporção de casos, por senescência ocorre em passagens variáveis ​​ou por que só uma cultura imortalizou. É provável, contudo, que esta é uma consequência de uma falta de factores essenciais necessários para o crescimento, que são fornecidos

in vivo

pelas interações complexas dentro do microambiente do tumor e que faltam no ambiente de cultura artificial.

crescimento Cultura

As taxas de crescimento de 30 culturas PCO, cultivadas em meio RPMI suplementado com 20% FCS, foram medidos por ensaios SRB usando células passagem precoce para gerar tempos de duplicação. Tempos de duplicação entre culturas PCO foram altamente variáveis ​​com uma mediana de tempo de 100 horas (intervalo de 79 a 195 horas), na Figura 3. No entanto duplicação, as células da mesma cultura testado em passagem diferente mostraram variabilidade mínima no tempo de duplicação (diferença média de 0,9 hora ; SEM 4.8). Não houve correlação entre a taxa de crescimento, o subtipo histológico ou estágio da doença no momento da apresentação. A taxa de crescimento relativamente lento visto também pode ser uma consequência do ambiente culturee articiais ea falta de fatores do micronvironment tumor.

A média eo desvio padrão de 6 repetições para cada ponto de tempo é plotado, normalizados para o dia 1.

cultura primária do tumor sólido

Em paralelo com ascite, tecido sólido foi coletado de 11 pacientes e processados ​​como descrito. Estabelecimento de culturas de células a partir de explantes de tecidos foi conseguida em 100% dos casos. A morfologia explante foi perdido 72 horas pós-semeadura como células adquiriu uma aparência de paralelepípedos monocamada com o tempo e passaging. Culturas mostraram uma aparência morfológica semelhante aos derivados de cultura de células de ascite, Figura 4. Fibroblasto contaminação foi minimizada por plaqueamento das células durante 30 minutos de incubação antes de remover o sobrenadante rico epitelial e replating, Figura 5.

A: Passagem 0 a 48 horas; B: Passagem de 0 a 72 horas; C: Passagem 1 aos 14 dias

A: crescimento de células epiteliais do sobrenadante removido 30 minutos após o início do cultivo (20 × ampliação); B: Células aderentes durante a incubação inicial 30 minutos foram quase inteiramente de fibroblastos (× 10 ampliação)

transporte de amostras

otimização Transporte

Local de coleta de amostras.. é frequentemente distante de instalações laboratoriais. Para utilizar este modelo no trabalho translacional colaborativo estabelecimento com sucesso da sequência do transporte cultura precisa ser considerado. Por isso, comparado o sucesso de caracterização da cultura e ensaios funcionais a seguir vários métodos de transporte

Grupo 1 – ascite frescos (n = 10):. O transporte para o laboratório com o processamento dentro de 6 horas após a recolha, usando o método acima descrito .

Grupo 2 – amostras temperatura ambiente (n = 7):. ascite foi armazenada à temperatura ambiente num recipiente esterilizado durante 24 horas antes da mistura 1:01 com meio num balão como acima

Grupo 3 – refrigerado amostras (n = 10): ascite foi armazenado a 4 ° C durante 24 horas antes da mistura 1:01 com meio como acima

Grupo 4 – As amostras congeladas (n = 6):. emparelhados conjuntos de 50 ml alíquotas de fluido ascítico foi centrifugado a 400G durante 5 minutos. Os sedimentos celulares resultantes foram congelados, armazenados a -80 ° C e -120 ° C e descongeladas a 6 semanas e 6 meses.

culturas bem sucedidas foram obtidos a partir de todos os grupos de transporte no entanto, em casos com cultura retardada era preferível para manter as culturas a 4 ° C. Não houve diferença na morfologia das culturas crescidas a partir de cada grupo, a Tabela 3.

célula ascítico peletes (Grupo 4) armazenados a -80 ° C e -120 ° C, foram descongeladas a 6 semanas e 6 meses. As culturas foram cultivadas com sucesso de ambas as condições de armazenamento após 6 semanas sem diferença observada na morfologia, taxa de crescimento ou de avaliação funcional. No entanto, após 6 meses de armazenamento, foi observada uma diferença significativa no sucesso da cultura subsequente das duas condições. pelotas ascítico armazenadas a -120 ° C foram cultivadas com sucesso em casos de 83%. Não culturas armazenadas a -80 ° C poderiam ser cultivadas com sucesso.

culturas lamela

A aparência morfológica das culturas de células lamela era semelhante em paralelo culturas processadas utilizando o método padrão. caracterização Immunoflourescent foi consistente em todos os casos PCO entre lamela e culturas método tradicional. coloração immunoflourescent ideal para a caracterização foi obtido se realizaram mais de 24 horas após a semeadura.

Cytospinning

Os parâmetros ideais para equilibrar a aderência celular máxima com a preservação da morfologia nuclear foram 200 mL de líquido de ascite (concentração de 10 × 10

4 células por ml) cytospun a 80 x g durante 5 minutos. Apesar das medidas tomadas para esgotar a amostra de fluido ascítico de células não epiteliais indesejadas e detritos, lâminas permaneceram fortemente contaminado, confirmado por coloração com citoqueratina sub-óptima e expressão pobres CA125. Contaminação feita a avaliação da morfologia, caracterização immunoflourescent e avaliação funcional do estado HR sem êxito.

ImageStream

X avaliação das culturas PCO

A introdução de ImageStream

tecnologia X com sua capacidade de combinar a citometria de fluxo com microscopia immunoflourescent alta resolução permitiu a avaliação da expressão de um número de marcadores marcados com imunofluorescência dentro das células individuais simultaneamente a alta velocidade e alta resolução. detecção Immunoflourescent dos três marcadores de ovário (pancitoqueratina, EpCAM e CA125), avaliada através de imunofluorescência fixo padrão e ImageStream

tecnologia X foi consistente em 13/15 casos (87%), Tabela 4. Além disso ImageStream

X possibilitou a quantificação da expressão percentual e avaliação de co-expressão.

ImageStream

X avaliação de amostras de ascite frescos

Dez ml de ascite frescos foram recolhidos e analisados ​​a partir de sete de ovário pacientes com câncer usando ImageStream

X. As células foram classificados como epiteliais se eles foram nucleadas, negativo para CD45 e positivas para EpCAM, CK ou CA125. A população de células epiteliais em cada amostra ascítico pode ser dividido em um certo número de sub-populações com base no padrão de marcação com anticorpos, Figura 6a e b, e demonstraram uma grande heterogeneidade inter-tumoral. A proporção de células que coram positivo para EpCAM foi altamente variável com uma mediana de 52% (0-98%). Não houve correlação entre o ImageStream

X determinada expressão de marcadores epiteliais e do estado, conforme determinado por imunofluorescência fixo (curva ROC, não mostrado, AUC de 0,5). É possível que algumas destas subpopulações podem representar células não epiteliais (isto é, células mesoteliais), mas é também possível que eles estão em células epiteliais e de facto submeter-se a alteração fenotípica, como resultado do método de cultura; ou que o método de cultura seleciona positivamente a subpopulações. Separação de células com perfil molecular subsequente de cada uma das subpopulações iria esclarecer isso e permitir que outras diferenças moleculares em subconjuntos de EOC a serem exploradas

A:. Trama celular ImagestreamX de células representativas que demonstram os três principais sub-populações celulares dentro líquido de ascite,; i) CK positiva somente, ii) CK e CA125 positivo e iii) EpCAM, CK e CA125 positivo. B: Sub-populações identificadas na população de células epiteliais no líquido ascítico EOC (n = o número total de células epiteliais identificados em 10 ml de ascite)

transfecção celular

A. número de ensaios funcionais requerem transfecção de vectores em células [14], [15]. Apesar de optimização, ambos os métodos de transfecção lipofectAMINE e electroporação não produziu uma eficiência de transfecção elevada o suficiente para ensaios funcionais.

No entanto, as células continuaram a crescer nos meios de comunicação a seguir à transfecção de puromicina a utilizar as partículas de transdução ™ shRNA Lentivirus sugerindo transfecção bem sucedida. transfecção de longo prazo não pôde ser avaliado devido ao curto prazo tempo de vida das culturas PCO.

Funcionais ensaios e de recombinação homóloga citotoxicidade

O ensaio RAD51 para o status de reparo do DNA FC foi realizada com sucesso em todas as culturas primárias que foram cultivadas com sucesso de todos os grupos de transporte. estatuto de RH para as culturas do mesmo dador PCO utilizando plaqueamento direto em lamelas e culturas ascítico foram todos consistentes. Cultura diretamente sobre lamelas reduziu o tempo necessário da coleção para determinar o status HR de cerca de 14 a 5 dias.

Como esperado, a GI

50 valores após o tratamento com rucaparib para cada cultura PCO foram variáveis, no entanto, uma nítida diferenciação de amostras sensíveis e resistentes foi visto como previamente descrito [5]. Na maioria dos casos, como esperado, as amostras PCO com status de RH com defeito foram sensíveis a rucaparib, enquanto que aqueles com status de RH competente eram resistentes, Tabela 5.

Apesar da otimização de várias técnicas clonog�icas padrão, colônia formação não foi visto e ensaios, portanto, clonog�icas abandonado em culturas PCO. trabalho de linha celular já havia demonstrado uma relação linear entre os resultados obtidos a partir de SRB e clonogenics e, portanto, SRB foi adotado como a técnica padrão neste estudo [16].

Discussão

A capacidade de gerar e utilizar culturas primárias de cancro do ovário tem várias vantagens sobre outros modelos, incluindo linhas de células estabelecidas e modelos animais. Reconhece-se agora que muitas linhas celulares em cultura a longo prazo vai sofrer mais aberrações genéticas tornando-os muito diferente do seu tecido de origem. Além disso, mesmo um grande painel de linhas celulares não podem recapitular a tremenda heterogeneidade que é visto no cancro epitelial do ovário. Muitos modelos animais são meramente xenoenxertos utilizando estas linhas celulares e, portanto, manter o mesmo conjunto de problemas. modelos de camundongos transgênicos tendem a ter sido gerado pela integração de um pequeno número de mutações [17] e, portanto, não exibem a instabilidade cromossômica maciço que é uma característica reconhecida de câncer de ovário [18].

Aqui nós descrevemos a nossa achados próprios para gerar culturas primárias de cancro do ovário, usando células derivadas de ambas as ascites e os depósitos sólidos da doença. A capacidade de cultura a partir de ambos estes materiais é importante porque, dependendo da situação clínica, apenas um destes materiais podem estar disponíveis. Por exemplo, na doença recidivante, não é incomum para ver ascite na ausência de grandes depósitos de sólidos, em contraste com a configuração de apresentação inicial onde apenas doença sólido pode estar presente. Nós relatamos um conjunto sequencial de amostras para demonstrar a taxa de sucesso para a geração de culturas. 156/172 (91%) das amostras recolhidas resultou em uma cultura viável de células epiteliais. Este valor é suficientemente elevado para justificar o uso viável destas técnicas na prática clínica de rotina, caso os testes de diagnóstico foram desenvolvidos para uso com este material.

Muitas vezes, e na verdade em nosso próprio caso, pode haver separação geográfica significativa entre sala de operação e laboratório de diagnóstico. A capacidade para o transporte de amostras, sem perda de integridade e é, portanto, essencial que descrevemos técnicas que demonstram que estas amostras podem ser seguramente mantido em ambos os 4 ° C ou -20 ° C durante até 24 horas antes da cultura. Além disso, a capacidade de armazenar culturas de longa duração em azoto líquido permite a possibilidade de colaboração para a investigação ou

post hoc

análise de diagnóstico.

Particularmente em alto estágio quando os tumores são disseminados por toda a cavidade abdominal e além, muitos tumores irá demonstrar significativa heterogeneidade intra-tumor [19], [20] embora muitas vezes estas alterações estão mais relacionadas à reação estromal local do que com a presença ou ausência de mutações principal motor [21].