Abstract

A activação constitutiva de quinases pró-sobrevivência tornou-se um alvo promissor de pequenas moléculas com um interesse crescente no desenvolvimento de multi agentes -targeted. Os mecanismos subjacentes a capacidade de resposta para a maioria dos agentes de direccionamento câncer específica vias de sobrevivência ainda são pouco conhecidos, mas fundamental para a sua aplicação clínica. Neste estudo, verificou-se que o sunitinib, um inibidor de molécula pequena de várias tirosina-quinases, incluindo VEGFR e PDGFRs induz apoptose e inibe o crescimento celular em células de cancro do cólon em cultura de células e modelos de xenoenxerto através do BH3-PUMA única proteína. o tratamento com sunitinib induzida

PUMA

transcrição através do eixo AKT /FOXO3a. PUMA, miméticos de BH3, ou 5-Flurourical sensibilizados células de cancro do cólon para a apoptose induzida por sunitinib. Além disso, a PUMA foi induzida por tratamento com sunitinib em tumores de xenoenxerto, e deficiência em

PUMA

suprimiu significativamente os efeitos anti-tumorais de sunitinib. O nosso estudo sugere que a apoptose mediada por PUMA é importante para as respostas terapêuticas ao sunitinib, e a activação da via mitocondrial por miméticos de BH3 ou manipulação PUMA pode ser útil para melhorar a actividade anti-tumoral de sunitinib. Modulação da PUMA e os membros seletivos da família Bcl-2 pode ser potenciais biomarcadores para prever respostas sunitinib

Citation:. Sun J, Sun Q, Brown MF, Dudgeon C, Chandler J, Xu X, et al. (2012) O multi-alvo Kinase Inhibitor sunitinib induz a apoptose em células cancerígenas do cólon através do PUMA. PLoS ONE 7 (8): e43158. doi: 10.1371 /journal.pone.0043158

editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de março de 2012; Aceito: 17 de julho de 2012; Publicação: 17 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Sun et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) CA129829 da concessão, da American Cancer Society RGS-10-124-01-CCE e FAMRI (J. Yu), e pelo NIH concede CA106348, CA121105 e da American Cancer Society concessão RSG-07- 156-01-CNE (L. Zhang). Este projecto utilizado as instalações UPCI compartilhados que foram apoiados em parte pela concessão P30CA047904. J. Sun e Y. Shu são suportados em parte pela National Science Foundation Natural da China concede 30772549. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Conflito de interesses: os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CCR) é a terceira principal causa de morte relacionada ao câncer em os EUA ea incidência está ligado. o aumento nos países em desenvolvimento [1]. Mesmo com a combinação de uma melhor quimioterapia e radiação em décadas passadas, a sobrevida em 5 anos de pacientes com doença avançada CRC permanece inaceitavelmente baixo. activação aberrante de várias vias de cinase é comum na maioria dos tumores sólidos, o que pode levar a um aumento da proliferação, sobrevivência, angiogénese ou invasão [2], [3]. Nos últimos anos, a esperança considerável foi colocado em agentes desenvolvidos para atingir quinases oncogênicas, cujo uso em combinação com quimioterapia ou radioterapia pode melhorar a sobrevivência e evolução dos doentes [4] CRC. A abordagem específica é esperado para, finalmente, entregar mais seguras e mais eficazes terapêuticas do cancro [5]. Um dos maiores desafios no uso clínico destes agentes é a prevalência da resistência intrínseca e adquirida, cujos mecanismos subjacentes permanecem largamente desconhecidos e um assunto de intensa investigação [4], [5].

O sunitinib (também conhecido como SU11248) foi desenvolvido como um inibidor de multi-alvo do receptor tirosina cinase (RTK), e aprovado pela FDA em 2006 para o tratamento de carcinoma de células renais (RCC) e resistente a imatinib tumor do estroma gastrointestinal (GIST) [6], [7] . ensaios clínicos em curso estão a ser conduzidos para avaliar a sua eficácia em outros tipos de tumores, incluindo o câncer de cólon metastático [7], [8] (https://clinicaltrials.gov/). Sunitinib inibe uma variedade de tirosina-quinases receptoras (RTKs), que são ou mutadas ou activados em cancro. Estes incluem os receptores para o factor de crescimento derivado de plaquetas (α PDGF-R e p) e receptores do factor de crescimento endotelial vascular (VEGFR1, 2 e 3), bem como KIT (CD117), RET, CSF-1R, e FLT3 [6] [7]. Sunitinib tem sido recomendada como um tratamento de segunda linha em GIST que desenvolveram resistência a imatinib devido a mutações secundárias no

c-KIT

. A inibição da angiogénese, a modulação imune e indução de apoptose tem sido sugerido para mediar os efeitos anti-tumorais de sunitinib [7]. Os mecanismos subjacentes ao efeito autónoma de célula de sunitinib, tais como a morte celular não é bem compreendido.

apoptose mediada por mitocôndrias desempenham um papel importante nas actividades antitumorais de uma ampla variedade de agentes quimioterapêuticos convencionais, bem como terapias específicas [9], [10]. A família Bcl-2 de proteínas são os reguladores centrais de apoptose mediada por mitocôndrias, que é engatada pela activação selectiva ou indução do proximal BH3-somente os membros em resposta a distintos, bem como sinais de sobreposição [11], [12]. O BH3-only proteína PUMA desempenha um papel essencial na p53-dependente e independente de apoptose em células cancerosas humanas e ratos [13], e ativa a via mitocondrial através do membro da família Bcl-2 Bax /Bak seguinte neutralizar todos os membros da Bcl antiapoptótico -2 moléculas como [14], [15], [16], [17]. danos no ADN induzidos por radiação gama ou vulgarmente utilizados agentes quimioterapêuticos, tais como 5-fluorouracilo (5-FU), adriamicina e etoposido, produzir uma indução dependente de p53 de PUMA e apoptose [15], [18]. tensões não genotóxicos, tais como factor de crescimento de privação, venenos do retículo endoplasmático e de uma série de inibidores de cinase induzir PUMA através de um número de outros factores de transcrição, incluindo p73, NF-kB e FOXO3a [13], [19], [20], [21], [22], [23].

no presente estudo, demonstramos que sunitinib induz a expressão PUMA independente da p53 em células de câncer de cólon. A indução de PUMA foi mediada pelo factor de transcrição FOXO3a mediante inibição de AKT.

deficiência PUMA

levou à resistência a apoptose induzida por sunitinib em células bem como em xenoenxertos. Nosso estudo fornece um mecanismo molecular da apoptose induzida por este inibidor da quinase não selectiva em células de câncer de cólon, e tem implicações importantes para a descoberta de biomarcadores e possíveis estratégias para superar a resistência.

Materiais e Métodos

Cultura Celular and Drug Treatment

linhas celulares de cancro do cólon foram obtidas de ATCC. Todas as linhas celulares foram mantidas a 37 ° C em 5% de CO

2 e cultivadas em meio 5A de Mycoy (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de FBS (Hyclone, Logan, UT), 100 unidades /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os somáticas células knockout linhas HCT 116

p53

KO [24], HCT 116

PUMA

KO [15], DLD1

PUMA

KO [18], HCT 116

FOXO3a

knockdown estável (KD) e células pequeno ARN interferente (siRNA) [19] foram descritos anteriormente. agentes anti-cancro ou produtos químicos utilizados no estudo incluem sunitinib (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), 5-fluorouracilo (5-FU), Gossipol (Sigma, St. Louis, MO), HA14-1 (Axxora LLC, San Diego , CA), ABT-737 (Selleck Chemicals LLC, Houston, TX). As soluções de reserva de todos os compostos foram preparadas em DMSO e diluiu-se por meio de cultura para as concentrações de trabalho antes da utilização. As células foram infectadas com adenovírus que expressam PUMA, Ad-PUMA [15] (20 MOI) sozinho ou com a adição de sunitinib. Transfecção de construções de Flag-Mcl-1 [16], Bcl-2 e AKT constitutiva (Millipore) de expressão foi realizada como descrito [20].

Western Blotting e subcelular Fraccionamento

anticorpos utilizados por transferência de Western incluídos aqueles contra a caspase-3, Myc (9B11), FOXO3a (total), p-FOXO3a, AKT (total), p-AKT (S473) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), citocromo c, α- tubulina, Bcl-xL, Mcl-1 (BD Biosciences), caspase-9 (StressGen Bioreagents, Ann Arbor, MI), citocromo subunidade oxidase IV (Cox IV, Invitrogen), Bcl-2 (Dako, Carpinteria, CA, EUA) , Flag (Sigma), PUMA [15], p53, p21, Bim, Bid, Noxa, Smac e β-actina (EMD Biosciences, Gibbstown, NJ). Western blot foi realizada tal como anteriormente descrito [25].

A libertação de cytochorme C e Smac foi detectado no citossol seguinte fraccionamento subcelluar como descrito [20], [26]. Em resumo, as células foram tratadas, em frascos T75 para os tempos indicados e sujeita a centrifugação diferencial para obter fracções citoplasmática e mitocondrial. As concentrações de fracções citosólicas obtidos foram normalizados utilizando um reagente de ensaio de proteína de corante (Bio-Rad, Hercules, CA). As fracções foram misturadas com volumes iguais de 2X tampão de amostra de Laemmli e sujeitas a análise de transferência de Western.

Cromatina imunoprecipitação

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) foi feito utilizando o kit de Ensaio de Imunoprecipitação da Cromatina (Millipore, Billerica , MA) com anticorpo FOXO3a para a precipitação da cromatina, tal como descrito [18]. Os precipitados foram analisados ​​por PCR utilizando os iniciadores 5-GCGCACAGGTGCCTCGGC-3 e 5-TGGGTGTGGCCGCCCCT-3, como descrito [22].

luciferase Ensaios

As células foram transfectadas com os repórteres PUMA contendo quer WT ou mutante ligação FOXO3a locais [19], com o pCMVp repórter de controlo transfecção β-galactosidase (Promega), e tratou-se com 12 uM de sunitinib durante 24 horas. Os lisados ​​celulares foram recolhidos e as actividades da luciferase foram medidas como anteriormente descrito [23]. Todas as experiências foram realizadas repórter em triplicado e repetidas três vezes.

As linhas celulares de cancro do cólon indicada (a) foram tratadas com 15? M de sunitinib durante 24 horas. Os níveis de PUMA foram analisados ​​por transferência de Western. (B) O HCT parental 116 (WT) ou

p53

células KO foram tratadas como em (A) com doses crescentes de sunitinib e analisadas para PUMA, p53 e p21 expressão. (C) e (D), células HCT 116 foram tratados com 15? M de sunitinib durante os tempos indicados.

PUM

um ARNm e os níveis de proteína foram analisados ​​por em tempo real de RT-PCR e Western blotting, respectivamente.

GAPDH

ARNm foi utilizado como um controlo para a normalização em RT-PCR, e β-actina foi utilizado como um controlo para o carregamento em Western blotting.

reversa em tempo real Transcription- PCR

o ARN total foi isolado a partir de células usando o mini kit de isolamento de ARN II (Zymo Research, Irvine, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. O ARN total (1 ug) foi utilizado para gerar ADNc, utilizando transcriptase inversa Superscript II (Invitrogen). PCR em tempo real foi efectuada para GAPDH PUMA e como descrito [22].

(A), HCT 116 e WT

PUMA

células KO foram tratados com doses crescentes de sunitinib durante 48 horas. A apoptose foi analisada por ensaio de fragmentação nuclear. Os dados foram obtidos a partir de 3 experiências independentes. **,

P Art 0,01, KO

vs

WT.. (B) As células HCT 116 com os genótipos foram indicados tratamento com 15 uM de sunitinib durante 48 horas.

Alta

, os produtos de clivagem de caspase-3 e 9 foram analisados ​​por transferência de Western.

Baixa

, a libertação de citocromo c e Smac no citosol foi analisada por Western blotting. β-actina e CoxIV são controles para o carregamento e citosólica e fraccionamentos mitocondrial, respectivamente. (C) A formação de colónias no HCT 116 WT e

PUMA

células KO tratados com sunitinib. As células foram tratadas por tratamento com sunitinib 12 uM durante 48 horas, em seguida, colocadas em placas a diluição 1:200 ou 1:400 (~600 ou 300 células por poço) em placas de 12 poços e deixou-se formar colónias durante 14 dias.

Alta,

imagens representativas das colônias.

Baixa

, as colónias contendo 50 células foram contadas e sobrevivência relativa foi calculada com células não tratadas colocadas em 100%. Os dados foram obtidos a partir de 3 experiências independentes. **,

P Art 0,005, KO

vs

WT.. (D) DLD1 WT e

PUMA

células KO eram tratamento com 30 uM de sunitinib durante 48 horas.

Esquerda

, PUMA e os produtos de clivagem de caspase-3 foram analisados ​​por transferência de Western.

Right

, a apoptose foi analisada pelo ensaio de fragmentação nuclear. **,

P

. 0,01, KO

vs

WT

apoptose Ensaios

aderente e células flutuantes foram colhidas, coradas. com Hoechst 33258 (Invitrogen) e analisados ​​para a apoptose por ensaio de coloração nuclear. Um mínimo de 300 células foram analisadas para cada tratamento [25], [27]. Para os ensaios de formação de colónias, igual número de células foram submetidas a vários tratamentos e plaqueadas em placas de 12 poços em diluições diferentes. As colónias foram visualizadas por coloração com violeta de cristal 11 a 14 dias após o plaqueamento tal como descrito anteriormente [25], [28]. Cada experiência foi efectuada em triplicado e repetidos pelo menos duas vezes.

(A), HCT 116 e HT 29 células foram tratadas com 15? M de sunitinib para tempos indicados. Os níveis totais de FOXO3a, fosforilado (p) – FOXO3a-total e AKT fosforilado (p) -Akt (S473) foram analisados ​​por transferência de Western. (B) HCT 116

p53

células ko e 29 células HT foram transfectadas com vector vazio ou uma expressão de AKT-constitutivamente activa constrói durante 16 horas, em seguida tratada com 15 uM de sunitinib durante 24 horas. Os níveis de p-AKT e PUMA foram analisados ​​por transferência de Western. (C) HCT 116

p53 KO

células foram transfectadas com um ARNsi mexidos ou um

FOXO3a

siRNA específico durante 24 horas, e depois tratou-se com 15 uM de sunitinib durante 24 horas. Os níveis de proteínas indicados foram analisados ​​por transferência de Western. (D)

FOXO3a

knockdown células estável (Kd) foram tratadas com 15? M de sunitinib durante 24 horas. Os níveis de proteínas indicados foram analisados ​​por transferência de Western. A banda específica do total-FOXO3a é indicado por uma seta. p-actina foi usado como um controle para o carregamento.

Xenoenxerto Tumores

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Pittsburgh. HCT 116 WT e

PUMA

KO xenoenxertos foram estabelecidas e medido como descrito [25]. Em resumo, 5-6 semana ratos atímicos fêmeas mais velhas nuas (Harlan, Indianapolis, IN) foram inoculados com 5 × 10

6 células por sítio em ambos os flancos. Os tumores foram autorizados a estabelecer durante 7 dias. Os ratinhos foram tratadas por gavage oral durante 10 dias consecutivos com 80 mg /kg /dia de sunitinib diluída em tampão de citrato de sódio (pH 4,7, veículo), ou veículo [29]. Os volumes dos tumores foram medidos em duas dimensões, utilizando um paquímetro. Os ratinhos foram divididos aleatoriamente em grupos, de tal modo que o volume médio do tumor entre os grupos foi o mesmo antes do tratamento. Por tudo

in vivo

experimentos, os volumes dos tumores foram medidos a cada dois dias em 2 dimensões e volumes foram determinados em mm

3 usando a fórmula l × b

2 × 0,52 (onde l é o maior diâmetro e b representa o diâmetro menor do tumor). Os ratinhos foram injectados i.p. 2 h antes do sacrifício com uma dose única de bromodesoxiuridina (BrdU) a 150 mg /kg de modo a marcar células em fase S. BrdU foi dissolvido em PBS para uma concentração final de 30 mg /mL. A análise histológica e de imunofluorescência para a apoptose e a proliferação foram realizados em secções congeladas 5 mícrons, como descrito [25]. Os ratinhos foram sacrificados 21 dias após o tratamento, ou 24 horas após o terceiro tratamento (dia 4). Os tumores foram dissecados e congelados rapidamente para western blot ou fixados em formalina a 10% antes da inclusão em parafina.

(A) cromatina imunoprecipitação (CHIP) foi realizada em HCT 116

p53

células KO seguinte 15 mM o tratamento com sunitinib durante 8 e 12 horas. IgG foi usada como um controlo para o anticorpo específico para o FOXO3a. (B) As células HCT 116 foram transfectadas com o repórter PUMA contendo o WT ou mutantes FOXO3a locais de ligação durante 16 horas, e depois tratou-se com 15 uM de sunitinib durante 24 horas. As actividades repórter foram medidos por ensaio de luciferase tal como descrito nos métodos. (C)

FOXO3a

knockdown células estável (Kd) foram tratados com doses crescentes de sunitinib durante 48 horas. A apoptose foi analisada por ensaio de fragmentação nuclear. Os dados foram obtidos a partir de 3 experiências independentes. **,

P Art 0,01, KD

vs

WT.. (D) Expressão de Mcl-1 de apoptose induzida por sunitinib suprimida em células HCT 116. As células foram transfectadas com Mcl-1 Flag-etiquetada durante 16 horas, em seguida tratada com 15 sunitinib uM durante 48 horas. A apoptose foi analisada por ensaio de fragmentação nuclear. Os dados foram obtidos a partir de 3 experiências independentes. **,

P Art 0,01, KO

vs

WT..

direito, Mcl-1 expressão foi confirmada por transferência Western. β-actina foi usado como um controle para o carregamento.

TUNEL e imunocoloração

A análise histológica foi realizada por hematoxilina e eosina. transferase terminal deoxyribonucleotidyl mediada por marcação terminal dUTP nick (TUNEL) coloração em secções congeladas foi feito com transferase recombinante terminal (Roche) e uUTP-Alexa 594 (Invitrogen) de acordo com a instruções dos fabricantes, e contrastadas com 4 ‘, 6-diamidino- 2-phenylindole (DAPI), com pequena modificação feita para as amostras de parafina [25], [30], [31]. As células apoptóticas foram contadas sob um microscópio de fluorescência em campos escolhidos aleatoriamente, e o índice de apoptose foi calculada como uma percentagem de células positivas TUNEL-em, pelo menos, 1000 células marcados. incorporação de BrdU foi visualizada com anti-BrdU- Alexa 594 anticorpo (Invitrogen) e os núcleos foram visualizados com DAPI. O índice de proliferação foi calculada pela células sob microscópio de fluorescência contando em vários campos escolhidos aleatoriamente. O índice de BrdU foi calculada como uma percentagem de células positivas para BrdU em pelo menos 1.000 células marcados. A fosfo-AKT, fosfo-FOXO3a e activo caspase-3 imuno-histoquímica foi realizada como descrito [19].

A apoptose foi determinada pelo ensaio de fragmentação nuclear e activação de caspases. Todos os dados sobre a apoptose foram obtidos a partir de 3 experiências independentes, enquanto western blots representativos são mostrados. (A) células HCT 116 foram tratadas com 10? M de sunitinib, 5 uM HA14-1, 5 uM Gossipol, 1 uM de ABT-737, 20 MOI Ad-PUMA (0,2 uL /​​mL) sozinha, ou a sua combinação, durante 48 horas. *,

P Art 0,05, combinação

vs

agente único..

direito, caspase-3 processada foi detectada por transferência Western. (B) HCT 116

PUMA

células KO foram tratadas com 12 mM sunitinib, 5 mM HA14-1, 5 mM Gossypol, 1 PM ABT-737, 20 MOI Ad-PUMA (0,2 ul /ml) sozinha, ou a sua combinação, durante 48 horas. *,

P Art 0,05, combinação

vs

agente único..

direito, caspase-3 processada foi detectada por transferência Western. (C) HCT 116 e WT

PUMA

KO células foram tratadas com 10? M de sunitinib, 30 ug /mL de 5-FU sozinho ou em combinação, durante 48 horas. *,

P Art 0,05, KO

vs

WT..

Right

, caspase-3 processada foi detectada por Western Blotting.

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada utilizando o software GraphPad Prism IV. Todos os valores de P foram calculados pelo teste t do estudante, e P 0,05 foi considerado significativo. Significa ± um desvio padrão (SD) foram exibidos em números quando aplicável.

Resultados

PUMA é induzida por sunitinib em células cancerígenas do cólon

A expressão da PUMA é baixa em A maioria das células não esforçados, e é induzida por vários stresses genotóxicos e não genotóxicos [23]. Para determinar um papel potencial de PUMA em resposta induzida por sunitinib, foram analisados ​​os níveis de PUMA, p21 e p53 antes e após o tratamento em cinco linhas celulares de cancro do cólon. Três destas linhas, HCT 116, RKO e SW 48 contêm WT

p53

enquanto duas linhas HT 29 e SW 480 contêm mutante

p53

. PUMA foi induzida por sunitinib em todas as cinco linhas de células (Fig. 1a). indução PUMA foi dependente da dose e ocorreram em ambos HCT 116 WT e células

p53

knockout (KO) (Fig. 1B). níveis basais de PUMA foram menores em

células knockout p53

em comparação com células WT conforme relatado anteriormente (Fig. 1B) [15]. p53 e p21, também foram induzidos por tratamento com sunitinib.

PUMA

mRNA foi rapidamente induzida por sunitinib, precedendo a indução de proteínas (Fig. 1C e 1D). Estes dados sugerem que PUMA é transcrição induzida por sunitinib independente da p53 em células de câncer de cólon.

(A)

esquerda, curva de crescimento de HCT 116 WT e

PUMA

KO Os tumores tratados com sunitinib (Suni, gavagem oral, 80 mg /kg /rato, por dia durante 10 dias) ou veículo (ve, pH4.7 tampão de citrato) durante 21 dias. O volume de tumor foi medido todos os dias. N = 7 por grupo. **,

P Art 0,01, WT + Ve

vs

WT + Suni: *,

P Art 0,05, WT + Suni

vs.. PUMA

KO + Suni.

Righ t, uma imagem representativa da WT e

PUMA

KO tumores tratados como indicado no dia 21. induzida (B) sunitinib PUMA em tumores de xenoenxerto. Os níveis de proteínas indicadas em quatro tumores WT KO seleccionados aleatoriamente foram detectados por Western blotting. (C) Os níveis de p-AKT e p-FOXO3a no WT tumores de 24 horas após a terceira dose foram analisados ​​por IHC. imagens representativas são mostrados. (D)

deficiência PUMA

inibiu a apoptose e crescimento supressão induzida por sunitinib em tumores de xenoenxerto. As secções de parafina de tumores HCT 116 24 horas após a terceira injecção foram sujeitas a coloração BrdU e TUNEL para quantificar a apoptose e a proliferação, respectivamente. Foi calculado o Índice de células positivas TUNEL ou marcadas com BrdU. **,

P Art 0,01, WT + Ve

vs

WT + Suni: *,

P Art 0,05, WT + Suni

vs.. PUMA

KO + Suni.

PUMA medeia sunitinib induzida por apoptose

Para examinar um papel potencial da PUMA na apoptose induzida por sunitinib, foram comparadas as respostas de células HCT 116 com células isogênico

PUMA

knockout (KO) [15]. apoptose

PUMA

células KO foram altamente resistentes a sunibinib induzida (Fig. 2A). Como esperado, a activação de caspase-3 e -9, ou a liberação citosólica do citocromo c ou Smac foi prejudicada em células

PUMA

KO, mas não no

p53

células KO (Fig. 2B) . Em ensaios de formação de colónia de longo prazo,

PUMA

células KO gerou mais de 4 vezes mais colónias do que as células WT (Fig. 2C). PUMA também foi induzida significativamente por sunitinib em

células mutante DLD 1 p53

enquanto

deficiência PUMA

significativamente bloqueada apoptose e ativação caspase nestas células induzida por sunitinib (Fig. 2D). Também examinamos os níveis de várias proteínas BH3-somente e membros anti-apoptóticos da família Bcl-2, após o tratamento com sunitinib. Nenhuma mudança foi observada consistente na maior parte deles, excepto para uma rápida Mcl-1 e uma regulação negativa indução retardada do BIM após 24 horas, em células HCT 116 (Fig. S1A). No entanto, observou-se pouca ou nenhuma Mcl-1 infra-regulação ou indução Bim em células DLD1 (Fig. S1B). Interessantemente, os níveis de vários membros da família Bcl-2 aumentada em

PUMA

células KO, em comparação com células wt, reflectindo talvez a sua degradação por proteases activadas durante o tratamento e a apoptose (Fig. S1B). Estes resultados sugerem que PUMA desempenha um papel fundamental nas respostas apoptóticas ao sunitinib em células de câncer de cólon.

O Mecanismo de PUMA Indução por sunitinib

A via PI3K /AKT é um efector comum a jusante da várias quinases alvo de sunitinib. Estudámos, portanto, a activação AKT em uma experiência ao longo do tempo após o tratamento com sunitinib, e encontrou AKT de-fosforilação em poucos minutos (Fig. 3A). FOXO3a é um factor de transcrição e de destino bem estabelecido de AKT, e a sua fosforilação pela AKT conduz à inactivação e exclusão nuclear. sunitinib tratamento levou a uma rápida fosforilação da de-FOXO3a, ainda não teve qualquer efeito óbvio nos níveis de FOXO3a totais (Fig. 3a). Note-se que as alterações na fosforilação FOXO3a e AKT, ou

PUMA

ARNm são dinâmicos e transiente; enquanto que a indução de proteína PUMA é persistente e uniforme em diferentes linhas celulares (Fig. 1 e 3A). expressão exógena de AKT ativa suprimida indução PUMA por sunitinib (Fig. 3B). A indução da PUMA foi significativamente inibida pelo

FOXO3a

knockdown por qualquer expressão transitória de siRNA ou expressão estável de shRNA tanto WT e

células p53

KO HCT 116 (Fig. 3C e 3D).

p53

células KO foram utilizados para reduzir a p53-depedent indução PUMA por transfecção.

A seguir, determinou se FOXO3a ativa diretamente

PUMA

transcrição por cromatina ensaio de imunoprecipitação (CHIP). Dois locais de ligação FOXO3a está localizado no primeiro intrão do

PUMA

[19]. O recrutamento de FOXO3a ao

PUMA

promotor contendo esses sites aumentou tão cedo quanto 8 horas após o tratamento com sunitinib (Fig. 4A). Utilizando ensaios de repórter, verificou-se que mutações nos locais de ligação FOXO3a reduziu significativamente a actividade do repórter após o tratamento PUMA sunitinib (Fig. 4B). Além disso,

FOXO3a

knockdown células estáveis ​​foram encontrados para serem resistentes à apoptose induzida por sunitinib (Fig. 4C). níveis de Mcl-1 foram restauradas por

FOXO3a

ARNsi nas células tratadas com sunitinib (Fig. 1D e 3C, S1), sugerindo a sua degradação pode ser um mecanismo adicional de apoptose induzida por sunitinib em células HCT 116. A apoptose induzida por sunitinib ocorreu em outras linhas de CRC incluindo HT29, e foi suprimida por sobre-expressão de Mcl-1 ou Bcl-2 (Fig. 4D e S2). Estes dados indicam que FOXO3a regula indução PUMA e da via mitocondrial na apoptose induzida por sunitinib.

BH3 miméticos ou elevada PUMA Níveis sensibilizar células do cancro do cólon para sunitinib

As observações acima prever níveis elevados de PUMA , BH3-somente proteínas, ou pequenas moléculas miméticos BH3 sensibilizar células cancerosas à apoptose induzida por sunitinib. Vários miméticos BH3 incluindo HA14-1, gossipol e ABT-737, e adenovírus PUMA (Ad-PUMA [15]), foram capazes de sensibilizar HCT 116 células para sunitinib. Estes agentes sozinho induziu pouca ou limitada a apoptose (Fig. 5A). Curiosamente, miméticos de BH3 induziu apoptose significativa e a activação da caspase em células

PUMA

KO quando combinado com sunitinib (Fig. 5A e 5B). DNA agentes prejudiciais, tais como 5-FU induz PUMA e Noxa em células p53 WT [14], [32], [33], [34]. 5-FU também em sinergia com sunitinib para induzir apoptose em células HCT 116 (Fig. 5C), o que está associado com a indução de PUMA melhorado (Fig. S3). Esta sinergia foi atenuada, mas não bloqueado no

PUMA

células KO (Fig. 5C) talvez devido a modulações de outros membros da família Bcl-2 por meio de ambos os mecanismos de p53 dependentes e independentes. Estes dados demonstram que níveis elevados de PUMA ou BH3 miméticos podem aumentar as respostas apoptóticos para sunitinib, mesmo em células resistentes à apoptose.

PUMA medeia a respostas terapêuticas ao sunitinib em xenoenxertos Models

Para avaliar se PUMA modula respostas terapêuticas

in vivo

, WT e

PUMA

KO HCT 116 células foram injetadas subcutaneamente nos flancos de BALB /c (nu /nu) ratinhos nus para estabelecer xenotransplantes. Em comparação com o veículo, o tratamento com sunitinib resultou em 62% e 38% de inibição de crescimento em HCT 116 e WT

PUMA

tumores KO, respectivamente (Fig. 6A). Diferenças entre

PUMA

genótipos foram estatisticamente significativos no braço sunitinib (P 0,01)., Mas não no braço do veículo sobre a eficiência ou a taxa de crescimento no estabelecimento do tumor (Fig. 6A)

PUMA foi significativamente induzida em tumores WT a partir de ratinhos tratados com sunitinib (Fig. 6B). Modulações de Mcl-1, AKT fosforilado FOXO3a e também foram observadas (Fig. 6B e 6C). Analisando secções de tumores de camundongos um dia após a terceira administração sunitinib (dia 4), encontramos uma taxa significativamente menor de apoptose e maior taxa de proliferação celular em

PUMA

KO tumores quando comparados aos tumores WT (Fig. 6D e S4A). Ativa a caspase-3 coloração confirmados reduziu significativamente a apoptose em

PUMA

KO tumores (~ 80%), em comparação com tumores WT tratados de forma idêntica (Fig. S4B). Estes resultados demonstram que a resposta terapêutica a sunitinib

in vivo

é mediada por apoptose PUMA-dependente.

Discussão

evidências

emergentes sugerem que a indução de apoptose é um importante mecanismo de uma ampla variedade de agentes anticancerosos [2], [10], [35]. Evasão da morte celular é uma indicação de cancro e um contribuinte importante para a resistência à terapêutica [2], [3]. Além dos efeitos bem documentados de sunitinib na inibição da angiogénese tumoral [6], [7], [36], [37], o nosso trabalho demonstra que o sunitinib exibe uma forte actividade pro-apoptótica em células de cancro de cólon por meio de indução PUMA através de transcrição fator FOXO3a, mas não p53, p65 NF-kB ou p53 homólogo p73 e p63. A apoptose induzida por sunitinib está associada com a indução do BIM ou regulação para baixo de Mcl-l em algumas linhas celulares de cancro do cólon testadas. Trabalhos anteriores demonstraram o envolvimento de Bim e STAT3 durante a apoptose induzida por sunitinib em outros tipos de células [38], [39], [40]. Em conjunto, estes dados sugerem que a indução de BH3-somente proteínas pode ser um mecanismo comum subjacente a morte celular induzida por câncer sunitinib que possam ser afectados pelo estado das várias cinases, e diferentes BH3-somente proteínas pode ser importante em diferentes tipos de células.

um certo número de inibidores mais selectivos VEGFR também foram encontrados para induzir PUMA e apoptose em células cancerígenas do cólon (dados não mostrados), suportando um papel não-angiogénico de terapias anti-VEGFR. Será importante para determinar se a apoptose induzida por sunitinib é mediada pela PUMA ou outras proteínas de BH3-somente em outros tumores sólidos tais como o cancro e os GISTs renal, e o seu potencial papel nas respostas apoptóticas a outros inibidores de VEGFR e PDGFR. Sensibilidade reduzida ao sunitinib foi sugerida para ser ligada a mutações em

KIT

ou

VEGFR /FDGFR

ou em outras RTKs, bem como a diminuição da expressão de receptores de VEGF solúveis (sVEGFs) [6], [7], que pode suprimir a morte celular ou promover a sobrevivência [2], [5]. Além disso, a inibição da angiogénese de tumores ou outros componentes no microambiente pode indirectamente activam as vias de morte celular [2]. A utilização de linhas celulares isogénicas como fizemos aqui poderia ser particularmente útil na compreensão de alvos e mecanismos de drogas [41].

Apesar da excitação no desenvolvimento de agentes de direccionamento quinases oncogénicas, dados clínicos demonstram que a maior parte destes agentes são geralmente eficaz somente em uma fracção menor de pacientes [4], [5]. Uma mudança importante é identificar biomarcadores para ajudar a seleção dos pacientes e estratificação. Nossos dados mostraram que PUMA persiste 24-48 horas após o tratamento com sunitinib. Em contraste, a inibição de AKT /FOXO3a é mais transitórios e recupera em horas, provavelmente reflectindo tentativas secundárias e sobrevivência em células tumorais a seguir a activação da sinalização apoptótica. Estes resultados potencialmente explicar por que as moléculas de sinalização a montante são menos adequados como biomarcadores, e sugerem a modulação da via de morte mitocondrial pode ser uma leitura mais útil para a actividade terapêutica global de agentes anticancerígenos.