Abstract
Fundo
DNA metilado em fluidos pode ser um biomarcador adequado para pacientes com câncer.
XAF1
tem sido mostrado para ser frequentemente sub-regulada no cancro gástrico humano (CG). Aqui, nós investigamos se
XAF1
metilação no GC poderia ser um biomarcador útil.
Métodos
em tempo real RT-PCR foi utilizado para detectar
XAF1
expressão de mRNA; imuno-histoquímica e Western blot foram usadas para examinar a expressão de proteínas em tecidos XAF1 GC (n = 202) e as suas correspondentes tecidos normais histológicos para-canceroso (PCHNTs). Real-time metilação específicas de PCR foi utilizada para investigar
XAF1
metilação do promotor no mesmo painel de tecidos GC, seus PCHNTs e soros.
Resultados
Nós confirmamos frequente
XAF1
infra-regulação em ambos os mRNA e os níveis de proteína nos tecidos GC em comparação com controles normais e PCHNTs.
XAF1
hipermetilação foi evidenciado em 83,2% (168/202) dos tecidos GC e 27,2% (55/202) de PCHNTs, enquanto nenhum metilação foi detectada nos 88 controlos normais. O nível de metilação em tecidos GC foi significativamente maior do que em PCHNTs (
P 0,05
). A hipermetilação do
XAF1
significativamente correlacionada com a regulação da
XAF1
em tecidos GC em ambos os níveis de mRNA e proteína (
p Art 0,001 cada). Além disso, foi detectada alta freqüência de
XAF1
metilação (69,8%, 141 de 202) nos DNAs soros dos mesmos pacientes, enquanto os DNAs de soro de 88 controles não-tumorais foram negativos para
XAF1
metilação. O
XAF1
metilação em ambos os tecidos GC e no soro poderia ser um bom biomarcador para o diagnóstico de GC (AUC = 0,85 para o tecido e AUC = 0,91 para soros) e significativamente correlacionada com pior prognóstico (
p
0,001). Além disso, após a cirurgia negativo-se positiva transição de
XAF1
metilação em soros fortemente associada com a recorrência do tumor.
Conclusões
1) Disfunção de
XAF1
é frequente e é regulada através de
XAF1
hipermetilação do promotor; 2) Detecção de circular metilado
XAF1
DNAs no soro pode ser um biomarcador útil no diagnóstico, avaliação de resultados (prognóstico do paciente e reincidência) para pacientes GC
Citation:. Ling ZQ, Lv P , Lu XX, Yu JL, Han J, Ying LS, et al. (2013) Circulação metilado
XAF1
DNA Indica mau prognóstico para o cancro gástrico. PLoS ONE 8 (6): e67195. doi: 10.1371 /journal.pone.0067195
editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 12 Março, 2013; Aceito: 16 de maio de 2013; Publicação: 27 de junho de 2013
Direitos de autor: © 2013 Ling et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado por uma bolsa do Projeto Ciência e Tecnologia Geral da Província de Zhejiang (no. 2009C33143), e em parte por uma concessão do Talent Backbone de Zhejiang Provincial Medicina e Programas Plataforma de higiene (no. 2011RCA009). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer gástrico é um dos cancros mais comuns na China, com uma alta incidência e mortalidade, aproximadamente respondendo por 10% de todas as neoplasias [1]. tumorigénese gástrico é um complicado, processo de passos múltiplos envolvendo alterações de muitos genes [2]. Aberrante metilação do promotor é um dos principais mecanismos de silenciar alguns genes supressores de tumores e genes relacionados tumorais e desempenha um papel muito importante na patogénese e progressão de cancros humanos [3], [4] – [6], incluindo o cancro gástrico [7] , [8]. Enquanto isso, acumulando dados sugerem fortemente que a metilação do DNA poderia ser biomarcador útil e poderosa na avaliação do risco de câncer [5], [7], o diagnóstico precoce [7], predizer o prognóstico dos pacientes [7], [8], e avaliar a sensibilidade para fármacos quimioterapêuticos [9]. Nosso estudo recente e outras pesquisas demonstraram que a detecção de circulação DNA metilado no sangue é uma abordagem potente e prático para pacientes com câncer [7], [10], [11].
X-linked inibidor de apoptose (
XIAP
) -associated fator 1 (
XAF1
) é um romance regulador negativo da
XIAP
, que inverte papel de proteção de XIAP em células tumorais [12] – [14]. A perda de
XAF1
expressão irá tornar as células tumorais resistência à apoptose e promover a sobrevivência de células de tumor [14] – [17]. Disfunção do
XAF1
tem sido relatada em vários cancros humanos provavelmente através de metilação do promotor [15] – [19], o que sugere a sua importância na tumorigênese. No cancro gástrico humano,
XAF1
tem sido relatada a ser frequente e significativamente regulada para baixo e isso down-regulação da
XAF1
provavelmente através de hipermetilação do DNA de locais específicos CpG [15], [16 ], [18]. No entanto, nenhum relatório disponível sobre
XAF1
metilação no sangue e sua potencialidade como um biomarcador. No presente estudo, examinamos
XAF1
metilação do promotor em amostras de tecido e de soro pareadas de um grande painel de pacientes com câncer gástrico, e avaliados circulante metilado
XAF1
como um potencial biomarcador para o câncer gástrico .
material e Métodos
Declaração de Ética
amostras de tecido humano de-identificados e soros foram obtidos a partir província de Zhejiang Human Tissue Specimen Bank. A utilização de espécimes foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Zhejiang Hospital do Câncer Province. consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente de acordo com as exigências do conselho de ética da nossa instituição. 88 voluntários não-cancerosas desde consentimento informado por escrito. Parte das amostras eram de Hospital da Província de Zhejiang Pessoas e Hospital das primeiras pessoas da Chunan County. O Conselho de Revisão Institucional de Ética Médica do Hospital da Província de Zhejiang Pessoas e Hospital das primeiras pessoas da Chunan County aprovado o método de coleta de amostra com o consentimento informado por escrito de todos os pacientes, respectivamente.
Tissue Specimen
tumorais e para-canceroso tecidos normais histológicos emparelhados espécimes (PCHNT) foram coletadas no momento da cirurgia de 202 pacientes com adenocarcinoma gástrico primário em Zhejiang Hospital do Câncer Province, Hospital de Zhejiang província de Pessoas e Hospital das primeiras pessoas da Chunan County a partir de janeiro de 2008 a dezembro 2009. a PCHNT foi avaliada microscopicamente para a presença de células normais e ausência de células displásicas. Nenhum desses casos tinham sido submetidos a qualquer tratamento médico antes da cirurgia. parâmetros demográficos, clínicos e histopatológicos destes casos foram apresentados na Tabela 1. O padrão de crescimento de células tumorais foi determinada de acordo com a classificação de Ming [20]. Todos os pacientes recrutados tinham sido acompanhados periodicamente até a data de vencimento. Antrais espécimes mucosa biópsias de 88 voluntários não-cancerosas por gastroscopia foram coletadas aleatoriamente como controles dentro do mesmo período, incluindo 54 homens e 34 mulheres, com uma idade média de 52,9 anos de idade. Entre esses voluntários, 48 pacientes foram diagnosticados com gastrite não-atrófica crônica. Enquanto isso, amostras pareadas de soro foram coletadas antes da cirurgia ou a endoscopia.
Análise do Helicobacter Pylori (
H. Pylori
) Infecção
As biópsias foram obtidas de todos os pacientes que teve exame endoscópico.
H
.
Status pylori
foi determinada pelo teste rápido da urease e métodos de coloração Giemsa [21], [22]. Considerou-se como
H
.
pylori
quando ambos os testes foram positivos, e as amostras com único positiva foram excluídos por análise estatística [22].
em tempo real RT-PCR
A expressão de mRNA de
XAF1
foi analisada por em tempo real de RT-PCR [23]. Os ARNs totais foram extraídos utilizando o Trizol (Gibco). Um total de 3 ^ g de RNAs totais foi sujeito a transcrição reversa usando M-MLV de transcriptase reversa (Promega). A desidrogenase de fosfato de gliceraldeído (
GAPDH) foi selecionado como referência interna. As sequências de
XAF1
iniciadores foram como se segue: (F) 5′-TGGGTGTAGGATTCTCCAGG-3 ‘, (R) 5′-GGTTTGCCCAAG GACTACAA-3’.
GAPDH
sequências de iniciador foram como se segue: (F) 5′-CATGA GAAGTATGACAACAGCCT-3 ‘, (R) 5′-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT- 3’. O método 2
-ΔΔCt foi usada para calcular as mudanças relativas na expressão do gene.
A coloração imuno-histoquímica
A expressão de proteína XAF1 foi determinada por análise de imuno-histoquímica com o anticorpo monoclonal XAF1 (Santa Cruz Biotechnology ). coloração imuno-histoquímica para XAF1 foi realizado usando amostras representativas embebidos em parafina a partir de 202 pacientes GC. Após desparafinização, recuperação de antigénio em tampão de citrato 0,01 M, e a inactivação da actividade de peroxidase endógena em 3% H
2O
2 /metanol, incubámos as lâminas com anticorpo para XAF1 a 4 ° C durante a noite, e coloração imuno-histoquímica, seguindo uma técnica complexa avidinbiotin-peroxidase padrão, foi realizada utilizando 3,3′-diaminobenzidina (DAB) como o cromogénio. Os núcleos foram contrastadas com hematoxilina. A pontuação da coloração imunohistoquímica (ISS) é determinada por três patologistas independentes que combinam a frequência e a intensidade de coloração do seguinte modo [24], [25]: sem coloração é pontuada como 0, 1~10% de células coradas pontuado como 1, 11~50% como 2, 51~80% como 3 e 4. 81~100% como a intensidade da coloração é classificado numa escala de 0 a 3, com 0, negativo; 1, fraco; 2, moderada; e 3, forte. Quando há imunorreactividade multifocal e existem diferenças significativas na intensidade de coloração entre focos, a média do menos intenso e mais intensa coloração foi gravado. Os dados brutos foram convertidos para a ISS multiplicando a pontuação frequência ea pontuação intensidade de coloração. Teoricamente, o ISS pode variar de 0 a 12. Um ISS de 9~12 forte imunorreatividade foi considerado, 5~8 foi considerada moderada, 1~4 foi considerada fraca, e 0 foi marcado como negativo. Seções em que a coloração não puderam ser bem caracterizados foram considerados equívoco.
Análise Western Blot
tumorais emparelhados e PCHNT espécimes de 20 casos foram selecionados aleatoriamente a partir de 202 pacientes com câncer gástrico para análise de western blot. A proteína total foi extraído e depois quantificado usando o método de Lowry [26]. A análise Western blot foi efectuada utilizando anticorpos monoclonais anti-XAF1 (Santa Cruz, CA) de acordo com o relatório anterior [6]. β-tubulina foi servido como um controlo interno.
Extração de DNA, bissulfito de Reforma e em tempo real metilação específico-PCR (MSP)
As secções em série de 5 mm que continham carcinoma e não-neoplásica tecidos foram montadas em lâminas de vidro não revestido e seco a 37 ° C durante a noite. Após desparafinização e coloração com hematoxilina e eosina (H E), foram coletadas 5.000 núcleos dos 5 aos 10 cortes seriados usando uma agulha 27G. Os núcleos recolhidos foram tratados com 40 ml de 200 mg /ml de proteinase K (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) a 42 ° C, durante 72 h. A tecnologia conta paramagnética (kit AxyPrep Mag sangue ADNg, Axygen Scientific, Inc., Union City, CA) foi utilizado para isolar o ADN genómico a partir de sangue fresco de acordo com o protocolo do kit. O protocolo consiste no seguinte passo: lise, ligação, lavagem e eluição. Os contaminantes são removidos durante os passos de ligação e de lavagem. A qualidade do ADN foi avaliada pela razão A260 /280 no espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE), a integridade do ADN foi verificada por electroforese em gel desnaturante de agarose.
ADN foram modificados pela Bissulfito de sódio utilizando o kit EpiTect bissulfito (Qiagen Inc.) seguindo as instruções do fabris. DNAs modificados foram analisados por MSP em tempo real sobre o ABI7500 PCR (ABI) utilizando o Kit de SYBR Pré-mistura de Taq ExTaq (Takara Co. Ltd).
XAF1
primers específicos de metilação e unmethylation foram concebidos como segue:
XAF1
(MF) 5′-TTTGTAAGAAACG AAATTTAATCGA-3 ‘, (MR) 5’CCTACCCTTAAAACCCACGAT-3’;
XAF1
(UF) 5′-TTTGTAAGAAATGAAATTTAATTGA-3 ‘, (UR) 5′-CTCCTACCCTTAAAACC CACAAT-3’ [23]. O DNA genómico humano (NEB) tratado por SSSI metiltransferase in vitro foi usado como um controlo positivo. Um DNA do sangue periférico de um indivíduo saudável foi utilizado como um controlo negativo. A percentagem de ADN metiladas nas amostras foram calculados de acordo com as referências como descritos anterior [27], [28]. índice de ADN metilado foi pontuada de acordo com a percentagem de metilação de DNA; 0, 20%; 1, 20% -40%; 2, 40% -60%; 3, 60% -80%; e 4, 80%. O índice de 0 é considerado como unmethylation DNA e dezenas 1-4 foram considerados hypermethylated, respectivamente [7], [27]. O corte limiar de 20% para hipermetilação DNA foi baseado no controle normal de amostras e controlos de qualidade internos obtidos na análise MSP em tempo real.
cultura de células e Drogas Tratamento
linhas celulares de cancro gástrico humano (AGS e KATO-III) foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino, 100 U /mL de penicilina, e 100 U /mL de estreptomicina a 37 ° C e 5% de CO
2, respectivamente. As células em cultura foram tratadas com 5-aza-2′-desoxicitidina (5-Aza-CdR) (Sigma-Aldrich) a uma concentração final de 1,0 umol /L. Tricostatina A (TSA) (Sigma-Aldrich) a uma concentração final de 20 ng /ml foi administrada após o tratamento 5-Aza ou sozinho durante 24 h. As células foram recolhidas e submetidas a ADN, ARN e purificação de proteínas e subsequente análise.
Análise estatística
17,0 software estatístico SPSS foi adoptada para a análise de dados. Contando comparações de dados entre os grupos foram submetidos ao
χ
2 e teste exato de Fisher. A análise de sobrevida foi computered por meio do método de Kaplan-Meier e níveis significativos foram avaliadas por meio do teste de log-rank. A análise univariada com o modelo de regressão de Cox foi utilizada para determinar os fatores prognósticos identificados, e análise multivariada com o modelo de regressão de Cox foi utilizado para explorar os efeitos combinados. Para todas as análises estatísticas,
p
valores . 0,05 foram considerados significância estatística
Resultados
Down-regulação da
XAF1
na Primária gástrica tumores
Para investigar
XAF1
perfil de expressão gênica, examinamos a expressão do mRNA de
XAF1
em 88 voluntários não-cancerosas, e 202 tecidos com cancro gástrico primários e suas PCHNTs correspondentes. Como mostrado na Figura 1A, o
XAF1
expressão foi significativamente reduzida em amostras de cancro gástrico em comparação com o que em controlos normais e PCHNTs (
P 0,001
). No entanto, não houve diferença significativa no
expressão XAF1
em PCHNTs, em comparação com controles não-cancerosas.
A,
XAF1
nível de expressão de mRNA em tecidos GC, PCHNTs ( para-canceroso de tecido normal histológico) e não-cancerosas controlos foram determinadas por em tempo real de RT-PCR e foi normalizada para
GAPDH. B-F, a expressão da proteína XAF1 foi regulada para baixo em tecidos com câncer gástrico. B, uma elevada expressão representativo positivo, proteína de XAF1 em um PCHNT tecidos; C, na ausência de expressão XAF1 em um GC pouco diferenciado; ampliação original × 200. D, um resumo das XAF1 coloração imuno-histoquímica resulta em 202 cânceres gástricos. E, análise de western blot Representante de expressão XAF1 no câncer gástrico e espécimes PCHNT correspondente com diferentes
XAF1
níveis de metilação. tecidos PCHNT no processo 59 (XAF1 pontuação metilação: 0); tecidos GC no processo 59 (metilado
XAF1
Placar: 4); tecidos PCHNT no processo 20 (pontuação metilado: 0); tecidos GC no processo 20 (metilado
XAF1
pontuação: 1). Beta-tubulina foi utilizada como controlo interno. F, Síntese dos resultados de transferência Western de 20 GCs e PCHNTs correspondentes apresentados como bandas relativos densidade normalizada para a beta-tubulina das mesmas amostras.
Além disso,
XAF1
expressão era significativamente menor nos tumores avançados (fase III /IV) do que em tumores fase inicial (fase I /II) (
p
0,0001, Figura S1A), e foi significativamente menor nos tumores pouco diferenciados do que no bem /tumores moderadamente diferenciados (
p 0,0001
, Figura S1B)
Para verificar o nível de proteína XAF1 em tecidos com câncer gástrico, foi realizada análise imuno-histoquímica nos 202 tecidos de câncer gástrico e suas PCHNTs correspondentes.. expressão XAF1 Nuclear foi consistentemente presentes no epitélio gástrico normal, mostrando pontuações imunoreativos elevados. A expressão da proteína foi detectada em XAF1 nível elevado em 97,5% (197/202) dos PCHNTs (Figura 1B). No entanto, de expressão elevada de proteína XAF1 foi apenas detectada em 16,8% (34/202) de tecidos de cancro gástrico; maioria dos tecidos com cancro gástrico estavam ausentes ou em um nível baixo de proteína XAF1 (Figura 1C). Os achados imuno-histoquímicos são resumidos na Tabela 1. A pontuação coloração imuno-histoquímica em tecidos de cancro gástrico foi significativamente mais baixa do que em PCHNTs ou em controlos normais (
P 0,0001
, Figura 1D). A perda de proteína XAF1 significativamente correlacionada com
H. pylori
infecção, tamanho do tumor, diferenciação histológica, invasão linfática, invasão venosa, profundidade invasiva, metástase linfonodal, metástases à distância e estágio clínico (Tabela 1) (todo o
p
0,05)
.
A imunofenotipagem de 20 tecidos de câncer gástrico foram também confirmadas por meio de análise de western blot. O representante resultados de transferência Western em dois casos foram mostrados na Figura 1E. A quantidade relativa de expressão de proteína XAF1 foi normalizado ao β-tubulina das mesmas amostras. O nível médio de proteína XAF1 em 20 tecidos de câncer gástrico foi significativamente menor do que em PCHNTs (
p Art 0,05). (Figura 1F)
hipermetilação do promotor de
XAF1
na Primária gástrica tumores
para investigar os mecanismos moleculares para a
XAF1
silêncio em cancros gástricos, aplicamos uma tecnologia MSP em tempo real para estudar o estado de metilação do DNA de
XAF1
promotor. A frequência de
XAF1
hipermetilação em tecidos com câncer gástrico, PCHNTs correspondentes e controles não-cancerosas foram de 83,2% (168/202), 24,8% (50/202) e 5,7% (5/88), respectivamente. A frequência hipermetilação do
XAF1
em cânceres é significativamente maior do que em PCHNTs e controles não-cancerosas (todo o
p Art 0,0001, Figura 2)
apresenta dados. a frequência de
XAF1
(nível de metilação do DNA ≥20%) hipermetilação em cada grupo.
de nota, o estado desnaturado da
XAF1
significativamente correlacionada com algum parâmetros clínico-patológicos em câncer gástrico, tais como metástases em linfonodos, T-estágio,
H
.
pylori
, etc (todos
p
0,05, Tabela 2). Nenhuma correlação significativa entre a hipermetilação do
XAF1 Comprar e sexo, idade no momento do diagnóstico, local do tumor e metástases à distância foi evidenciado (todo o
p Art 0,05). (Tabela 2)
XAF1
hipermetilação do promotor está associada à sua transcrição silenciamento em células de câncer gástrico
Para examinar as relações entre
XAF1
metilação e
XAF1
expressão, comparou-se a
XAF1
nível de metilação com
XAF1
níveis nível de proteína e mRNA determinados por análise imuno-histoquímica (Figura 3A) ou western blot (Figura 3B) pela análise de correlação de Spearman. Como mostrado na Figura 3A-, a expressão da proteína XAF1 (determinado por análise de imuno-histoquímica) em 202 tecidos GC foi estreitamente correlacionada com
XAF1
nível de ARNm [LG (T /N)] (determinado por RT-PCR) (
γ
= 0,841,
p
0,0001). Mais importante,
XAF1
nível de metilação foi significativamente associada com
XAF1
nível de mRNA (
γ
= – 0,846,
p
0,0001) e proteína XAF1 nível (
γ
= -0,969,
p
0,0001). Foram obtidos resultados semelhantes quando se analisa a correlação de
XAF1
metilação do promotor e a expressão da proteína XAF1 determinado por análise de Western blot (Figura 3B). Estes resultados fortemente indiciados que
XAF1
expressão é regulada pelo
XAF1
metilação do promotor.
A, Correlação de
XAF1
metilação com
XAF1
nível de mRNA determinado por análise de RT-PCR e a expressão da proteína XAF1 determinada por análise imuno-histoquímica em tecidos de cancro gástrico 202. B, Correlação de
XAF1
metilação com
XAF1
nível do mRNA determinado por análise de RT-PCR e a expressão da proteína XAF1 determinado por análise de transferência de Western em 20 congelados tecidos de cancro gástrico. Em ambos A e B,
XAF1
pontuações de metilação inversamente correlacionada com a expressão do gene
XAF1
em ambos os níveis de mRNA e proteína.
5-Aza-CdR Administração Restaura expressão da
XAF1
Para confirmar ainda mais a regulação epigenética da
XAF1
expressão, células AGS e KATO-III foram tratados com 5-Aza-CdR e /ou TSA .
XAF1
expressão de ARNm foi reactivada em ambas as linhas celulares de cancro gástrico, acompanhada por desmetilação de
XAF1
promotor (Figura 4), indicando que
XAF1
é transcricionalmente silenciados nestas células por hipermetilação do ADN. Curiosamente, o tratamento TSA só foi eficaz em restaurar
expressão XAF1
em AGS e KATO-III, sem alteração significativa da
XAF1
nível de metilação, sugerindo que as modificações de histonas também podem estar envolvidos na regulação da
expressão XAF1
. No entanto, a administração de TSA seguinte 5-Aza-CdR teve um efeito aditivo na restauração da expressão do gene com uma diminuição adicional no nível de metilação
XAF1
. Estes resultados estão de acordo com estudos recentes que sugerem que o TSA pode ter um efeito desmetilação de um modo específico do gene de [5]. A análise por Western blot utilizando células AGS, como um modelo, confirmou a regulação positiva de proteínas XAF1 sequência da 5-Aza-CdR tratamentos /TSA (Figura 4) 5-Aza-CdR e.
Dois cancro gástrico linhas celulares (AGS e KATO-III) foram tratadas com 1,0 mmol /L 5-Aza-CdR, durante 72 horas e /ou 100 nM TSA durante 24 horas. Os níveis de metilação foram determinados por MSP em tempo real. Foi realizada análise em tempo real de RT-PCR em triplicado para cada amostra de ADNc e utilizados valores médios de três experiências. A relativa
XAF1
expressão de mRNA foi normolized ao
GAPDH
das mesmas amostras utilizando a fórmula 2
-ΔΔCT. Os resultados foram multiplicados por 100 para uma melhor visualização. A percentagem de
XAF1
metilação do DNA é mostrada do lado esquerdo; Considerando que a expressão de mRNA relativa de
XAF1
é mostrada no lado direito. B: Expressão de XAF1 ao nível da proteína seguinte tratamentos 5-Aza-CdR e TSA. A análise de transferência de Western de células AGS a seguir ao tratamento com DMSO (controlo), 5-Aza-CdR, ou 5-Aza-CdR /TSA durante 72 horas demonstrar-se-regulação das proteínas XAF1 em células tratadas, em comparação com o controlo (DMSO). O beta-tubulina é mostrado como um controlo de carga.
Detecção de circulação
XAF1
metilação
Detectamos alta frequência de
XAF1
metilação no cancro gástrico primário (83,2%), sugerindo que pode ser um bom biomarcador se
XAF1
metilação pode ser detectável no soro. Portanto, nós examinamos
XAF1
metilação nos DNAs soro correspondentes em 202 pacientes do GC.
XAF1
metilação foi detectada em 141 (69,8%) Os DNAs de soro de 202 pacientes com cancro gástrico (Figura 5). Em contraste,
XAF1
metilação não foi detectada em DNAs de soro de controles não-cancerosas 88.
Em seguida, confirmaram a consistência no
XAF1
metilação entre tecidos tumorais e no soro correspondente. Em 168 casos que apresentaram
XAF1
metilação em tecidos tumorais, 141 exibida
XAF1
metilação no seu soro emparelhado, dando uma consistência de 83,9% entre eles. E nos 34 pacientes com câncer gástrico sem
XAF1
metilação em seus tecidos com câncer gástrico, não metilação foi encontrado em todos os DNAs de soro (Figura S2).
XAF1
metilação como um biomarcador para o diagnóstico de câncer gástrico
Para avaliar o valor de
XAF1
metilação como um biomarcador para o diagnóstico de GC, nós traçamos receiver operating characteristic (ROC) curvas e área calculada sob a curva (AUC), utilizando dados de metilação do DNA de ambos os tecidos de GC e soros. Tanto o ROC análises de
XAF1
metilação em tecidos e soros revelaram capacidade discriminativa significativa (Figura 6); o valor AUC dos tecidos
XAF1
metilação foi 0,849 (intervalo de confiança de 95%, 0,806-0,892;
p Art 0,0001), o valor AUC do soro
metilação AXF1
foi 0,909 (intervalo de confiança de 95%, 0,875-0,942;
p Art 0,0001).
Receiver análise característica (ROC) a operar foi utilizado para avaliar a possibilidade de
XAF1
metilação em tecidos de cancro gástrico ou no soro, como um biomarcador para diagnosticar o cancro gástrico. Para
XAF1
metilação em tecidos com câncer gástrico, uma área sob a curva ROC (AUC) é 0,849 (intervalo de confiança de 95%, 0,806-0,892;
P
0,0001). Para
XAF1
metilação no soro, a AUC é 0,909 (intervalo de confiança de 95%, 0,875-0,942;
P
0,0001).
Além disso, como
XAF1
estado de metilação em tecidos com câncer gástrico e os soros significativamente correlacionada com metástases em linfonodos, T-estágio, estágio clínico, e outros parâmetros clínico-patológicos (tudo
p
0,05, Tabela 2 ).
XAF1
metilação relação com o prognóstico de pacientes com câncer gástrico
A correlação significativa de
XAF1
metilação com muitos parâmetros clínico-patológicos (Tabela 2 ) sugeriu que pode associar-se com o prognóstico dos pacientes com câncer gástrico. Até a data de vencimento de Acompanhamento, 113 de 168 pacientes com
XAF1
hipermetilação em tecidos com câncer gástrico foi rápida progressão da doença ou morte. A sobrevida livre de doença Mediana (DFS) foi de apenas 23,4 meses. Em contraste, nos 34 pacientes sem
XAF1
hipermetilação em seus tecidos com câncer gástrico, apenas 5 pacientes estavam se deteriorando, ea mediana DFS foi de 39,6 meses. A análise de Kaplan-Meier demonstrou que pacientes com
XAF1
hipermetilação em seus tecidos com cancro gástrico apresentaram uma pior sobrevida óbvio do que isso, sem
XAF1
hipermetilação (
p
0,0001) (Figura 7A). Da mesma forma, a análise de Kaplan-Meier mostrou que os pacientes com soro positivo
XAF1
metilação teve DFS significativamente menor do que nos pacientes sem soro
XAF1
metilação (
p Art 0,0001 ) (Figura 7B), indicando que
XAF1
metilação do promotor no soro foi um preditor desfavorável para os pacientes com câncer gástrico.
agains sobrevida livre de doença cumulativa (Cum DFS) curvas são plotadas
nível de metilação t XAF1
DNA em tecidos com câncer gástrico (a) e no soro (B). Em ambos A e B, a análise de Kaplan-Meier foram usados e
P .
0,0001, respectivamente
A análise de regressão de Cox revelou que
XAF1
metilação no soro é um fator independente na sobrevida dos pacientes: pacientes com
XAF1
metilação tiveram pior prognóstico (
p
0,0001; hazard ratio, 5,710; 95% CI, 3.474~9.383). Além disso, estágios TNM e idade no momento do diagnóstico pode ser considerado como o factor de influência do prognóstico no câncer gástrico, somente quando o efeito de
XAF1
metilação foi eliminado. Além disso, circulando metilado
XAF1
no sangue tiveram um impacto maior sobre o prognóstico do que em estágios TNM (Tabela S1).
Transição positiva de circulação
XAF1
metilação prevê Tumor recorrência e prognóstico ruim
Entre os 202 pacientes que foram avaliadas para pré-operatória circulando
XAF1
metilação, 72 pacientes receberam exames de acompanhamento de circular
XAF1
metilação 2~5 vezes em intervalos de 1~6 meses após a cirurgia. Entre 12 pacientes recorrentes, 10 pacientes apresentaram negativos-se positiva transição em
XAF1
estado de metilação nos seus soros, os outros dois mostraram sempre positivo para o
XAF1
metilação, o que sugere que o monitoramento da
XAF1
metilação no soro pode ser um bom marcador para prever a recorrência do tumor (Tabela 3).
Discussão
XAF1
(
XIAP
fator -associated 1) é um romance
XIAP
proteína que poderia perturbar a combinação de ligação de
XIAP
com caspases, suprime a sua protecção em células de tumor e resulta em apoptose de células de tumor [12 ] – [14]. A função anti-apoptose de
XIAP
é determinado pela relação dos níveis de
XIAP
expressão contra o
XAF1
[15]. expressão ou silêncio do
reduzida XAF1
é um evento freqüente em tumores humanos [16] – [19]. No presente estudo, primeiro confirmou que
XAF1
expressão do gene foi significativamente regulada para baixo nos dois níveis de mRNA e nível de proteína em um grande painel de tecidos de câncer gástrico primários, e a regulação da
XAF1
expressão foi significativamente associada com os estágios de tumores, metástases e assim por diante, implicando perda de
função XAF1
na progressão tumoral. Isto é consistente com outros relatórios de investigação [17] – [19]. Para explorar os mecanismos moleculares responsáveis pela
XAF1
silêncio, examinamos
XAF1
metilação do promotor em um grande painel tecidos de câncer gástrico (
n
= 202) e controles normais (
N
= 88) utilizando uma tecnologia de MSP em tempo real. Foi detectada uma alta frequência (83,2%) de hipermetilação DNA de
XAF1
em tecidos com câncer gástrico. A hipermetilação DNA de
XAF1
correlacionada significativa com a infra-regulação da
XAF1
em ambos os mRNA e os níveis de proteína em tecidos de câncer gástrico (Figura 3). Além disso, o tratamento com 5-Aza-CdR significativamente restaurado
expressão XAF1
em
XAF1
silenciados linhas celulares de cancro gástrico (Figura 4). Estes dados sugerem fortemente que frequente down-regulação da
XAF1
em células de câncer gástrico é regulada pelo seu hipermetilação do promotor. Curiosamente, o tratamento de células de cancro gástrico com TSA, um inibidor da histona desacetilase também restaurou
XAF1
expressão, sozinho ou combinado com o tratamento com 5-Aza-CdR, indicando que a modificação da histona pode também ser envolvido em
XAF1
regulação
metilação de ADN pode ser utilizada como um biomarcador potencial de tumor em vários cancros humanos [3] – [11], [23]. A presença de ADN isento de células em circulação no sangue periférico tem sido descrita em pacientes com processos malignos, e libertação activa de ADN do tumor para a circulação tem sido relatada [29] – [31].