Abstract

Gancho proteína microtubule-tethering 3 (HOOK3) é uma proteína adaptador para intracelular dependente de microtúbulos vesículas e tráfico de proteína. De modo a avaliar o papel de HOOK3 no cancro da próstata foram analisados ​​por imuno-histoquímica HOOK3 expressão em um TMA contendo mais de 12.400 cancros da próstata. Os resultados foram comparados com fenótipo tumoral e recorrência PSA, bem como aberrações possivelmente definir subtipos moleculares relevantes, tais como status de ERG e deleções de 3p13, 5q21, 6q15 e PTEN. HOOK3 imunocoloração foi negativo em células luminais normais do epitélio da próstata, enquanto que 53,3% dos 10.572 cancros interpretáveis ​​mostraram expressão HOOK3, que foi considerada baixa em 36,4% e alto em 16,9% dos casos. expressão HOOK3 de alto nível estava ligado ao estágio avançado do tumor, alta pontuação de Gleason, alto índice de proliferação, estágio de linfonodo positivo, e recorrência PSA (p 0,0001 cada). O papel prognóstico da expressão HOOK3 era independente de parâmetros clínico-patológicos estabelecidos, tanto em configurações pré-operatórios e pós-operatórios. Comparações com características moleculares foram realizadas para tirar conclusões sobre a função potencial de HOOK3 na próstata. A forte associação com todas as deleções examinados é consistente com um papel de HOOK3 para a manutenção da integridade genómica, contribuindo para a montagem correcta do centrossoma. Encontrar expressão HOOK3 em 74% dos ERG positivo, mas em apenas 38% dos cancros negativos ERG (p 0,0001) sugere ainda interacções funcionais entre esses genes. Em conclusão, os resultados do nosso estudo identificar HOOK3 como um marcador de prognóstico forte candidato com um possível papel na manutenção da integridade genômica no cancro da próstata, o que pode ter potencial para inclusão em ensaios clínicos de rotina

Citation:. Melling N, Harutyunyan L, Hube-Magg C, Kluth M, Simon R, Lebok P, et al. (2015) de Alto Nível HOOK3 Expression é um preditor independente de mau prognóstico associado à instabilidade genômica no câncer de próstata. PLoS ONE 10 (7): e0134614. doi: 10.1371 /journal.pone.0134614

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ÁUSTRIA

Recebido: 28 Abril 2015; Aceito: 10 de julho de 2015; Publicação: 31 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Melling et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

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financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o câncer mais prevalente em homens nas sociedades ocidentais [1]. Enquanto a maioria dos tumores têm um curso clínico em vez indolente, o câncer de próstata ainda representa a terceira causa mais comum de morte relacionada com cancro nos homens. parâmetros prognósticos estabelecidos são Gleason grau, extensão do tumor nas biópsias, antígeno específico da próstata pré-operatório (PSA), e estágio clínico. Embora estatisticamente poderosos, eles não são suficientes para as decisões individuais de tratamento ideais. Espera-se que uma melhor compreensão da biologia da doença irá eventualmente conduzir à identificação de marcadores moleculares clinicamente aplicáveis ​​que permitem uma previsão mais fiável da agressividade do cancro da próstata em pacientes individuais.

A família de proteínas de amarrar microtúbulos humana gancho (Hooks) compreende três homólogos, HOOK1, Hook2, e HOOK3, que são abundantemente expressa em células humanas. Ganchos funcionar como proteínas adaptadoras envolvidas no tráfico de vesículas de membrana e complexos de proteína ao longo dos microtúbulos entre o aparelho de Golgi, centrossomas [2-5], endossomas [6] e lisossomos [7]. Um papel relevante do cancro tem sido sugerido especificamente para HOOK3 a partir de vários estudos que encontraram alterações recorrentes do gene. Por exemplo, um estudo relatou um HOOK3: fusão RET em um caso de câncer de tireóide papilar, o que provou ser oncogénico em um modelo de câncer de rato xenotransplante [8]. Outro estudo descobriu mutações proteína de alteração de significado desconhecido, em 2 de 48 tumores neuroendócrinos intestino delgado [9]. Além disso, o gene está localizado no HOOK3 8p11, um ponto de interrupção comum em muitos tipos de tumores humanos, incluindo o cancro da próstata [10,11]. Assim, inativação de quebra, resultando em redução da expressão de HOOK3 foi encontrado em uma fração considerável (9,0%) dos tumores [11], em estudo em 77 cancros da próstata.

Estas descobertas levaram-nos a estudar os padrões de expressão HOOK3 no cancro da próstata em mais detalhe. Nós levou vantagem de nossa tissue microarray preexistente (TMA) contendo amostras de cancro da próstata 12.000 conectados a um banco de dados com acompanhamento clínico e dados moleculares extensas. Nossas descobertas demonstram que altos níveis de expressão da proteína HOOK3 estão fortemente ligadas ao fenótipo tumoral adversa e recorrência PSA cedo e pode prever de forma independente mau resultado no câncer de próstata.

Materiais e Métodos

Os pacientes

espécimes prostatectomia radical foram disponível a partir de 12.427 pacientes, submetidos a cirurgia entre 1992 e 2012 no Departamento de Urologia e as Clínicas de Martini na Universidade Medical Center Hamburg-Eppendorf. dados de acompanhamento estavam disponíveis para um total de 12.344 pacientes com um seguimento médio de 36 meses (variação: 1 a 241 meses; Tabela 1). valores de antigénio específico da próstata (PSA) foram medidos e o PSA cirurgia seguinte recorrência foi definido como o ponto no tempo quando o PSA pós-operatório foi, pelo menos, 0.2ng /ml e aumentando em medições subsequentes. Todos os espécimes de próstata foram analisados ​​de acordo com um procedimento padrão, incluindo uma incorporação completa de toda a próstata para análise histológica [12]. O processo de fabricação de TMA foi anteriormente descrito em detalhe [13]. Em suma, um núcleo 0,6 milímetros foi feita a partir de um bloco de tecido representativo de cada paciente. Os tecidos foram distribuídos entre 27 blocos de TMA, contendo cada um 144 a 522 amostras de tumor. Para controles internos, cada bloco TMA também continha vários tecidos de controlo, incluindo o tecido da próstata normal. O banco de dados molecular ligada a este TMA continha resultados sobre a expressão ERG em 10.678 [14], ERG quebrar análise FISH em 7099 (expandido a partir de [15]), estado exclusão de 5q21 (CHD1) em 7932 (expandido a partir de [16]), 6q15 (MAP3K7) em 6069 (expandido a partir de [17]), PTEN (10q23) em 6704 (expandido a partir de [18]), 3p13 (FOXP1) em 7081 (expandido a partir de [19]) cancros, e índice de marcação Ki67 (KI67LI) dados em 4.426 cancros (expandido a partir de [20]).

declaração Ética

O uso de tecidos sobras de diagnóstico arquivados para a fabricação de microarrays de tecido e sua análise para fins de pesquisa como bem como a análise dos dados do paciente tenha sido aprovado pelas leis locais (HmbKHG, §12,1) e pelo comitê de ética local (Comissão de ética Ärztekammer Hamburgo, WF-049/09 e PV3652). De acordo com as leis locais, o consentimento informado não foi necessário para este estudo. registros de pacientes /informação foi anónimos e de-identificados antes da análise. Todo o trabalho foi realizado em conformidade com a Declaração de Helsinki.

Imunohistoquímica

seções TMA Corte recentemente foram imunocoradas em um dia e em um experimento. As lâminas foram desparafinadas e exposto a calor induzido por recuperação de antigénios por 5 minutos numa autoclave a 121 ° C em pH 7,8 tampão de Tris-EDTA-citrato. Purificado por afinidade HPA024756 primária de anticorpo criado contra a proteína homólogo GANCHO 3 epitopo tag de proteína recombinante assinatura (KEEIAQRCHELDMQVAALQEEKSSLLAENQVLMERLNQSDSIEDPNSPAGRRHLQLQTQLEQLQEETFRLEA) (anticorpo policlonal de coelho, Sigma, St. Louis, MO, EUA; diluição 1: 150) foi aplicada a 37 ° C durante 60 minutos. Especificidade do anticorpo foi validada pelo fabricante, uma vez que mostrou uma única banda com o tamanho previsto (83,1 kD), num Western blot. O anticorpo ligado foi então visualizadas utilizando o kit EnVision (Dako, Glostrup, Dinamarca) de acordo com as instruções MANUFACTURER’S [15]. O anticorpo geralmente manchado no citoplasma da célula do tumor em todas as células (100%) de um dado local do tecido. Intensidade de coloração de todos os casos foi assim semiquantitativa avaliada em três categorias:. Negativos, baixa (fraca a moderada) e alto (forte intensidade de coloração)

Estatísticas

Os cálculos estatísticos foram realizados com JMP 10.0. 2 software (SAS Institute Inc., NC, EUA). tabelas de contingência ea chi²-teste foram realizados para procurar associações entre parâmetros moleculares e fenótipo tumoral. As curvas de sobrevida foram calculadas de acordo com Kaplan-Meier. O teste Log-Rank foi aplicado para detectar diferenças significativas entre os grupos. Análise de variância (ANOVA) foi aplicada para procurar associações entre a proliferação celular e coloração HOOK3. A análise de regressão de riscos proporcionais de Cox foi realizada para testar a independência estatística e significância entre variáveis ​​patológicas, moleculares e clínicos. análises separadas foram realizadas utilizando diferentes conjuntos de parâmetros disponíveis antes ou depois da prostatectomia.

Resultados

Aspectos técnicos

Um total de 10.572 (85,0%) das amostras de tumor foram interpretáveis em nossa análise TMA. Razões para casos não informativas (1.855 pontos; 15,0%) incluíram a falta de manchas de tecidos na seção TMA ou ausência de tecido de câncer inequívoca no local TMA

expressão

HOOK3 em células prostáticas normais e cancerosos

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imagens representativas de imunomarcações HOOK3 negativos e positivos são dadas na Figura 1. HOOK3 imunocoloração foi localizada no citoplasma das células (Fig 1C inserção). Os tecidos normais, derivados de pacientes com cancro da próstata, não apresentaram coloração de células do estroma e luminais, enquanto que as células basais coradas positivo (** na figura 1d). HOOK3 positiva imunocoloração foi visto em 5636 de nossos 10.572 (53,3%) cancros da próstata interpretável e foi considerada baixa em 36,4% (Fig 1b) e alta em 16,9% dos casos de câncer (Fig 1c)

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(a) negativo , (b) de baixa intensidade, (C) coloração de alta intensidade em 10x, 300x inserções em ampliação e (d) células luminais normais negativos e positivos células basais (*), em conjunto com de alto nível do tecido canceroso positivo (**) na mesma core de 150x de ampliação

Associação com TMPRSS2:. status de fusão ERG e expressão da proteína ERG

Para avaliar se a expressão HOOK3 está associado com o TMPRSS2: ERG fusion em cancros da próstata, usamos dados de estudos anteriores (expandidos de [14,15] Os dados sobre TMPRSS2:. status de fusão ERG obtidos por FISH foram disponível a partir de 6302 e por imuno-histoquímica de 9.370 tumores com imunocoloração HOOK3 avaliável de dados em ambos ERG FISH e IHC estavam disponíveis desde 6076 cânceres. e um resultado idêntico (ERG IHC positivo e ruptura por FISH ou ERG IHC negativo e ruptura por FISH em falta) foi encontrada em 5811 de 6.076 (95,6%) cancros. Positivo imunocoloração HOOK3 estava ligado ao rearranjo TMPRSS2: ERG e ERG positividade em cancros da próstata. HOOK3 imunocoloração foi observada em 74,3% e 76,1% dos cancros com TMPRSS2: ERG fusion detectado por IHC e FISH, mas encontrada em apenas 38,2% dos cancros sem coloração ERG e 44,1% dos cancros sem rearranjos ERG detectadas por FISH (p 0,0001 cada , Fig 2)

IHC = imuno-histoquímica.; FISH = Fluorescência hibridização in-situ.

Associação com o fenótipo tumoral

Quando todos os carcinomas foram analisados ​​em conjunto, expressão HOOK3 de alto nível foi significativamente ligado ao estágio do tumor patológico avançado, de alta Gleason grau, metástases em linfonodos (p 0,0001 cada) e positividade margem cirúrgica (p = 0,0003). Não houve correlação com elevados de PSA-níveis pré-operatórios (p = 0,7594; Tabela 2). análise de subgrupo de cânceres ERG-negativos e positivos revelou resultados semelhantes (Tabelas S1 e S2).

Associação com outras deleções genômicas chave

Estudos anteriores têm fornecido evidências para os subgrupos moleculares distintos de cancros da próstata definidos pela TMPRSS2: ERG fusões e várias deleções genômicas. Outros e nós já descrito anteriormente um forte elo de PTEN e 3p13 exclusões ERG positividade e de 5q21 e exclusões 6q15 para ERG negatividade [16-19]. De modo a analisar, se a expressão HOOK3 pode ser particularmente associada com uma de estas deleções genómicas, HOOK3 dados foram comparados com resultados de pré-existente de PTEN (10q23), 3p13 (FOXP1), 6q15 (MAP3K7) e deleções (5q21 CHD1). Na análise de todos os tumores, HOOK3 expressão foi significativamente ligado a todas as deleções acima mencionadas (PTEN, 5q21 e 3p13 (p 0,0001 cada), 6q15 (p = 0,003); Fig 3a). Estas associações variou quando a análise de subgrupo foi realizada para ERG negativo (Fig 3b) e cancros positivos ERG (Fig 3C). Aqui HOOK3 coloração foi fortemente correlacionado com deleções em PTEN (p 0,0001 para ambos os cancros ERG negativos e positivos), 6q15 (ambos p 0,0001) e 5q21 (p 0,0001, p = 0,01, respectivamente), mas não com 3p13 deleções (p = 0,10 e p = 0,73, respectivamente).

(a) todos os cancros, (b) no ERG-negativos, c) subconjunto ERG positivo.

Associação com a proliferação de células tumorais ( O índice de marcação de Ki67)

HOOK3 coloração forte foi significativamente associados à proliferação celular acelerado como medida por KI67LI em todos os tipos de cancro, bem como em subconjuntos de cancros com classificação de Gleason idêntica (≤3 + 3, 3 + 4, 4+ 3, e ≥4 + 4, p . 0,0001 cada, Tabela 3)

Associação com a recorrência PSA

estavam disponíveis dados de acompanhamento de 9,916 pacientes com HOOK3 interpretável imunocoloração em o TMA. A associação altamente significativa entre a expressão HOOK3 de alto nível e recorrência PSA início foi encontrado quando todos os tumores foram analisados ​​e também na análise de subgrupos para os cancros negativos e positivos ERG (p 0,0001 cada; Fig 4a-4e).

(a) todos os cancros (n = 9.540), (b) ERG-negativo (ERG

-) cancros (n = 4.732), (c) ERG-positivo (ERG

+) cancros (n = 3.678 ), (d)

PTEN

não-excluídos (PTEN

norma) cancros (n = 4.349), (e)

PTEN

cancros excluídos (n = 1037).

análise multivariada

Quatro tipos diferentes de análises multivariadas foram realizadas a avaliação da relevância clínica de expressão HOOK3 em diferentes cenários (Tabela 4). Cenário 1 avaliação de todos os parâmetros disponíveis de pós-operatório, incluindo estágio patológico do tumor, estado linfonodal patológica (PN), status da margem cirúrgica, valor de PSA pré-operatório e grau Gleason patológica obtida após a avaliação morfológica de toda a próstata ressecados. No cenário 2, foram incluídos todos os parâmetros de pós-operatório disponíveis com exceção do estado nodal. O racional para esta abordagem foi a de que a indicação e extensão da dissecção de linfonodos não é padronizado no tratamento cirúrgico do câncer de próstata e que a exclusão pN na análise multivariada pode aumentar significativamente o número de casos. Dois cenários adicionais teve a finalidade de modelar a situação pré-operatória, tanto quanto possível. Cenário 3 incluídos expressão HOOK3, PSA pré-operatório, o estágio do tumor clínico (fase TC) e grau de Gleason obtido na amostra de prostatectomia. Dado que a determinação de pós-operatório de um grau tumores Gleason é “melhor” do que o grau de Gleason pré-operatório determinada (sujeito a erros de amostragem e, consequentemente, sub-graduação em mais de um terço dos casos [21]), foi adicionada uma outra análise multivariada. No cenário 4, o grau de Gleason pré-operatório obtido na biópsia inicial foi combinado com PSA pré-operatório, estágio cT e expressão HOOK3. HOOK3 provou ser um parâmetro de prognóstico independente em todos os cenários, quando todos os tumores e também subgrupos de tumores positivos e negativos ERG ERG foram analisados ​​(Tabela 4). HOOK3 provou ser um prognosticador independente, independentemente do cenário ou subgrupo testado (todos os cânceres: p = 0,0003 no cenário 1, p 0,0001 no cenário 2-4; ERG cancros negativos: p = 0,0002 no cenário 1, p 0,0001 no cenário 2-4; ERG cancros positivos: p = 0,0381 no cenário 1, p = 0,0433 no cenário 2, p = 0,0006 no cenário 3, p 0,0001 no cenário 4)

Discussão

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Os resultados deste estudo demonstram que a expressão de alto nível HOOK3 é um preditor independente de recorrência PSA no início de câncer de próstata.

a nossa análise imunohistoquímica revelou marcação HOOK3 citoplasmática em 85,0% dos 10.572 cânceres de próstata analisáveis. epitélio normal da próstata normalmente mostrou imunomarcação negativa ou fraca em células luminais, enquanto as células basais e estromais não manchar para HOOK3. Que os níveis crescentes de HOOK3 paralelo agressividade do câncer é consistente com um papel relevante de HOOK3 a regulação para o desenvolvimento e progressão do câncer de próstata. Dados da proteína humana Atlas (www.proteinatlas.org) parecem sugerir que HOOK3 pode também ser-se regulamentada em outros tipos de câncer, incluindo câncer colorretal, câncer endometrial, glioma, cancro do pulmão, linfoma e cancro da tiróide [22].

A forte associação de expressão HOOK3 de alto nível com características de tumor adversos, incluindo estágio avançado, alto grau de Gleason, metástase nodal ea recorrência PSA defende uma relevância prática da medição HOOK3 para a avaliação do prognóstico. Essa expressão forte HOOK3 pertencia relevância prognóstica mesmo no subgrupo de cancros que abrigam PTEN supressões-um dos mais fortes marcadores prognósticos conhecidos no câncer de próstata [18,23,24] -further enfatiza um papel clinicamente relevante de testes HOOK3. Isto é tanto mais verdade quanto o impacto prognóstico da HOOK3 também era independente dos parâmetros clínicos e patológicos. Nossa ampla modelagem multivariada sugere ainda que HOOK3 pode ser um marcador de prognóstico clinicamente útil em ambos os cenários pré e pós-operatórias. Considerando-se que um biomarcador clínica deve ser analisado em material de biópsia e antes de as decisões de tratamento são tomadas, é digno de nota, que a nossa abordagem de analisar características moleculares em um minuto TMA amostra de tecido medindo 0,6 mm de diâmetro de perto modelos de análises moleculares de biópsias por agulha de núcleo onde são avaliados quantidades comparáveis ​​de tecidos. Como nossas amostras de TMA não foram exatamente retirado do “pior” área de cada tumor, mas aleatoriamente a partir de dentro de uma área de câncer representante, o nosso local TMA pode ser tão representativa quanto possível do “pior” área de um câncer clínica identificada em um conjunto de biópsias de câncer.

Não se sabe como HOOK3 podem contribuir para o desenvolvimento e progressão do câncer. Não realizamos próprias experiências funcionais, mas o grande número de cancros da próstata incluídos no nosso projecto, juntamente com informações molecular extensa sobre os nossos tumores nos permitiu tirar algumas conclusões sobre os papéis de câncer relevantes putativos de HOOK3 “in silico”. Esta abordagem de “epidemiologia molecular funcional” demonstrou pela primeira vez, que a expressão HOOK3 está fortemente ligada aos parâmetros clássicos de instabilidade genômica, como a prevalência de deleções cromossômicas, e à proliferação celular elevada. Exclusões de determinadas regiões pequenas e grandes cromossômicas são uma marca registrada de câncer de próstata. Os dados de estudos de sequenciação próxima geração de demonstrar que tais deleções são mais prevalente do que quaisquer mutações de genes que codificam específicas e muitas destas deleções foram ligados a ambos os ERG positivo (isto é, PTEN e 3p13) ou cancros negativos ERG (i.e. 6q15 e 5q23). Que a alta expressão HOOK3 está ligada a uma maior prevalência de todas as exclusões analisados ​​destaca um possível envolvimento de HOOK3 sobre os mecanismos que regulam a integridade genômica. Isto é consistente com trabalhos anteriores demonstrando que HOOK3 é relevante para o bom funcionamento dos centrossomas, uma vez que é essencial para o transporte e montagem das proteínas dinâmica centrosomal [3,4]. Ambos abater e a sobre-expressão ectópica de HOOK3 em modelos de linhas celulares resultou em funções comprometidas centrosomal [3], de um aparelho de Golgi fragmentada, interrompido rede de microtúbulos mal organizadas, e um aumento da fracção de células com dois ou mais núcleos [5]. Além disso, anormalidades centrossoma foram ligados a aneuploidia no câncer de próstata antes [25].

A nossa abordagem em silico ainda demonstrado que HOOK3 superexpressão está fortemente ligada à activação ERG. Mais de metade de todos os cancros da próstata, particularmente aqueles de pacientes jovens, realizar fusões de genes que ligam o gene TMPRSS2 regulado por andrógeno com o fator de transcrição ERG [14,26]. Estes rearranjos genómicos resultar em uma sobre-expressão conduzido por androgénio do ERG em células afectadas [27] e, assim, a expressão alterada de mais de 1.600 genes em células epiteliais da próstata [28]. É improvável, contudo, que os níveis elevados HOOK3 em cancros ERG positivos são accionados por activação directa, porque a região de promotor HOOK3 carece de locais de ligação de ERG. explicações alternativas para a associação positiva de expressão HOOK3 e ERG incluiria uma interacção directa ou indirecta destas duas proteínas. Pode, por exemplo, ser possível que HOOK3 -Responsável para o transporte de proteínas de centrosomal interage com proteínas, tais como centrosomal quinase ligada a integrina (ILK), que é um parceiro funcional relevante do ERG [29,30]. ILK e ERG foram mostrados para conduzir cooperativamente transformação maligna e de transição epitelial-mesenquimal no câncer de próstata [31].

Em resumo, nosso estudo fornece evidências de que HOOK3 é um prognosticador independente no câncer de próstata. Propomos assim, que a análise de expressão HOOK3 tem o potencial de aplicação clínica de rotina, quer isoladamente, ou, mais provavelmente, em combinação com outros biomarcadores. A nossa abordagem tissue microarray em larga escala continuará a ser altamente instrumental para a identificação de biomarcadores de prognóstico continuamente adequados. bases de dados moleculares larga escala associados a grandes TMAs também permitem análises funcionais limitados “in silico”.

Informações de Apoio

Tabela S1. Clinico-patológico associação de HOOK3 imunocoloração no subconjunto ERG negativo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0134614.s001

(DOC)

S2 Table. associação clínico-patológico de HOOK3 imunocoloração no subconjunto ERG positivo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0134614.s002

(DOC)

Reconhecimentos

Agradecemos Janett Lüttgens , Sünje Seekamp e Inge Brandt pela excelente assistência técnica.