Abstract

metabolismo celular Cancer responder à terapia da privação do andrógeno (ADT) podem estar envolvidos no desenvolvimento e na progressão da próstata câncer e o fracasso final da terapia de privação de androgênio. Para investigar os efeitos de regulação do metabolismo no crescimento independente de androgénios de cancro da próstata, um modelo celular de LNCaP-s estabelecido que se assemelha ao cenário clínico de cancro da próstata resistente à castração (CRPC), foi utilizada neste estudo. Esta linha celular foi cultivada a partir de células parentais LNCaP andrógeno-sensíveis, em uma condição reduziu-andrógeno, assemelhando-se terapia de privação de andrógeno clínica. Para avaliar os efeitos de smsDX sobre a capacidade de invasão de células de cancro da próstata que usamos para feridas ensaio de cura e ensaio de invasão de Matrigel ™. Foram avaliados expresso diferencialmente proteínas das células LNCaP e células LNCaP parentais s depois ADT por meio de duas dimensões em gel de electroforese (2-DE), seguido de análise espectrométrica de massa MALDI-TOF. A área coberta na ferida e o número de células invasoras através de uma câmara de Matrigel foram significativamente menores para as células tratadas com smsDX do que eram para células de controlo tratadas com veículo. 56 proteínas foram encontrados expressos diferencialmente em células LNCaP-S em comparação com células LNCaP, a maioria deles foram regulados negativamente após o tratamento ADT. 104 proteínas de células LNCaP e 86 em células LNCaP-s, separadamente, foram encontrados expressos diferencialmente após o tratamento com smsDX, Quando explorado estas funções das proteínas dentro do site UniProtKB /Swiss-Prot, surpreendentemente, a maior parte das proteínas foram encontrados para ser envolvido no metabolismo celular e regulação da função mitocondrial. como potenciais células cancerosas independente de androgénios metastático LNCaP-s e as suas funções do metabolismo mitocondrial e pode ser alterado por um novo derivado de somatostatina smsDX, os efeitos reguladores no metabolismo smsDX em LNCaP-s entregar mais informação terapêutico com o tratamento da CRPC.

Citation: Yan L, Xing Z, Guo Z, fang Z, Jiao W, X Guo, et al. (2013) A somatostatina Derivada (smsDX) alvos celulares metabolismo das células do cancro da próstata após andrógeno terapia de privação. PLoS ONE 8 (2): e55790. doi: 10.1371 /journal.pone.0055790

editor: Ming Tat Ling, Universidade de Tecnologia de Queensland, Austrália |

Recebido: 12 de setembro de 2012; Aceite: 31 de dezembro de 2012; Publicação: 07 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Patrocínio Grant : The National Natural Science Foundation da China (No. 81.172.435) e Shandong Natural Science Foundation (No. ZR2010HM026). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é a neoplasia maligna mais comum em homens, ea principal causa de mortalidade relacionada ao câncer nos EUA e Europa machos [1]. A progressão do tumor de fase CRPC é um processo complexo que pode ser tanto envolvendo selecção clonal e mecanismos adaptativos em tumores heterogéneos compostos de células que respondem de forma diferente a terapia de privação de androgénio (ADT). No entanto, os mecanismos através dos quais os tumores adquirem independência androgénio permanecem pouco claros e precisam de ser tratadas antes de estratégias de tratamento eficazes podem ser desenvolvidas.

ADT é geralmente utilizado no tratamento de cancro da próstata avançado. Mas a terapia de privação de androgénios não é curativa [2], de modo a CRPC letal é inevitável. Os sinais de degeneração vascular, hipóxia, stress metabólico e no tecido de tumor da próstata são exacerbados seguinte castração cirúrgica ou médica [3]. Depois de um curto período de remissão, a maioria de cancro da próstata torna-se independente de androgénios. células CRPC após ADT são capazes de sobreviver ao ambiente de baixo oxigênio e nutrientes e emergir com um fenótipo diferente. privação de andrógeno é conhecida por induzir a diferenciação neuroendócrina (NE) em células LNCaP, e envolve na transição para andrógeno independência [4], [5]. tumores NE ter sido provada a sobre-expressar receptores de somatostatina (SSTRs) [6]. A expressão SSTR1-5 poderia ser regulada pela somatostatina e sua smsDX derivado possível através da regulação da mitocôndria de LNCaP que, eventualmente, poderia desencadear apoptose mediada por mitocondrial [7]. análogos de somatostatina ligam a SSTRs e acredita-se que tem actividade anti-tumoral dupla, tanto directa (anti-proliferativa) e indirecta (inibição de várias hormonas peptídicas segregados pelas células tumorais) [8], [9]. análogo de somatostatina, lanreotida foi demonstrada para ter um efeito antineoplásico considerável em vários tumores, incluindo CRPC [10]. Mas a regulamentação do análogo de somatostatina no metabolismo celular do câncer de próstata não foi claramente abordado.

Nós argumentamos que a inibição do receptor de andrógeno expressão (AR) é por si só suficiente para induzir a morte celular nas células AR-positivos. Mas quando essas células AR-positivas gradualmente perdeu expressão AR ou em uma expressão de AR inferior em células de câncer de próstata, essas células CRPC poderia obter fornecimento de energia através de atividades mitocondriais. De acordo com as conclusões do grupo Sotgia F [11], as células cancerosas epiteliais poderia levar até metabólitos ricos em energia a partir de fibroblastos estromais que fornecem o microambiente rico em energia necessária para facilitar o crescimento do tumor e angiogênese vizinho. Estas células despojadas de androgénio em jejum podem utilizar estes metabolitos no ciclo do ácido tricarboxílico mitocondrial (TCA), resultando em uma maior capacidade proliferativa. Para as células CRPC emergentes após ADT,-regulam enzimas que convertem androgênios adrenais a testosterona e DHT (em particular AKR1C3) aumentando ainda mais a sua síntese de andrógenos intratumoral e reativando a atividade transcricional AR [12], AR reativação é o aumento da síntese intratumoral de testosterona e DHT androgénios fracos produzidos pela possivelmente

de novo

de colesterol no estroma host e metabólitos extracelulares.

o principal problema decorrente do câncer de próstata é a sua propensão para metástase. invasão local é um dos primeiros passos fundamentais na metástase, como sem ele disseminação do tumor não pode ocorrer. O processo de múltiplos passos de invasão e metástase foi esquematizada como uma sequência de passos discretos, frequentemente denominado cascata de invasão de metástases [13], [14]. Durante esta cascata metabólica a reprogramação para suportar a síntese de novas proteínas, lípidos e ácidos nucleicos é crítica para o crescimento e divisão celular [15]. Nós especulamos que as alterações metabólicas celulares iria acompanhar o progresso do câncer de próstata ao status CRPC letal. Nosso estudo incidirá sobre os efeitos inibitórios smsDX sobre a invasão de câncer de próstata e regulação de relacionar o metabolismo celular após a inibição da atividade da AR, mediada pela depleção de androgênio. Usando células LNCaP e LNCaP-s para examinar as proteínas que envolvem nas funções do metabolismo celular e de energia no cancro da próstata e para determinar os efeitos reguladores causados ​​pela somatostatina smsDX derivado, demonstramos ADT sub-regula a maioria das proteínas mitocondriais, eventualmente, resulta na activação de mitocondrial mediada via apoptótica. Os efeitos smsDX em ER leva à sobre-expressão de GRP78, em conjunto com outras duas proteínas ER PDIA1 e PDIA3. smsDX exerce os seus efeitos por dysregulating de enzimas metabólicas em níveis múltiplos, que envolve no processo de invasão celular e sobrevivência CRPC. Em conclusão, estes resultados sugerem que regula ADT mediada por mitocondrial e ER tensão de sinalização em células LNCaP e leva a reprogramação do metabolismo nas células CRPC, efeitos reguladores sobre as células smsDX CRPC fornece informação útil para o tratamento da CRPC.

Materiais e Métodos

cultura celular e Reagentes

LNCaP linha celular de cancro da próstata humano (American Type Culture Collection, Rockville, MD, EUA) foram rotineiramente mantidas em meio normal (sem vermelho de fenol positiva meio RPMI 1640 suplementado com 5% de FBS, 1% de glutamina e 0,5% de gentamicina), tal como descrito anteriormente a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. O meio foi mudado duas vezes por semana e as células foram tripsinizadas e subcultivadas uma vez por semana. Para os experimentos, foram utilizadas células LNCaP sensíveis andrógeno com números passagem 28-33. Para estabelecer uma linha de células de cancro de próstata independente de androgénios, foi realizada cultura de uma linha celular de LNCaP-S a partir de uma linha celular de cancro da próstata LNCaP parentais em condições de privação de androgênio. Depois de 8-12 passagens, as células LNCaP-s foram tratados com smsDX. Somatostatina foi a partir de Ferring, Kiel, Alemanha. A cultura de células foi tratada com smsDX (do Professor Sten Nilsson Lab) ou com somatostatina para três dias, 1 nM por dia, tal como descrito por Liu Z [7]. AR anti-humano, de CgA e NSE, o anti-anticorpo de TOM40 (sc11414), β-actina (coelho anti-actina anticorpo R-22) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotecnologia. (# 9412) anticorpos TCTP (# 5128), STMN1 (# 3352) e VDAC2 foram adquiridos a partir de Cell Signaling comercialmente. anticorpos CBX3 (HPA004902) e GRP78 (G9043) foram adquiridos comercialmente a partir de Sigma.

Cicatrização de feridas ensaio

As células foram cultivadas até à confluência em placas de 6 poços de cultura de tecido e uma ferida foi feita por raspagem no meio da monocamada de células com uma pipeta de ponta P200. Depois de células flutuantes foram removidos por extensa lavagem com solução salina de fosfato gelada tamponada meio completo fresco contendo 10 nM smsDX ou a quantidade correspondente de PBS foi adicionado. Migração e movimento celular em toda a área da ferida foram examinados após 24 horas.

Matrigel Invasion Ensaio

ensaio de invasão foi realizada utilizando Matrigel revestidos inserções Transwell (BD) com 8 mm poros em 24 poços placas, conforme instruções do fabricante. Resumidamente, uma suspensão de 1 × 10

6 células em 100 de meio isento de soro ul foi adicionada à inserção e 500 ul de meio RPMI 1640 contendo 20% de FBS suplementado com 1-10 nM smsDX ou a quantidade correspondente de solução salina eram adicionada à parte inferior do poço. Depois as placas foram incubadas durante 48 horas a 37 ° C, as inserções foram fixadas em metanol, os filtros foram coradas com 0,1% de violeta de cristal e o número de células que invadiu através das inserções Transwell revestidas com Matrigel foram contadas aos 40 × ampliação. O número de células foi contado em experiências em triplicado independentes em pelo menos 10 campos por poço. Os ensaios foram repetidos 3 vezes.

análise de Western blot

Nas células LNCaP andrógeno-dependentes após o tratamento ADT, foi realizada cultura de uma linha celular LNCaP-s estável. Os biomarcadores de células de cancro da próstata independentes de androgénio e proteínas afectadas por smsDX foram testados. Western blotting foi realizado para validar várias proteínas diferencialmente expressas seleccionados identificados por 2-DE MS base. Os anticorpos primários foram utilizados nas seguintes diluições: de cabra anti-humano AR, CGA e NSE, 1:1000; p-actina, 1:1500; anti-TOM40 anticorpo, 1:800. TCTP, 1:1000; STMN1, 1:1000; VDAC2, 1:1000; CBX3, 1:1000; GRP78, 1:1000. As transferências de Western foram realizadas como descrito [16]. Em resumo, as células foram lisadas com um tampão contendo Tris-HCl 50 (pH 7,5), NaCl 250 mM, 0,1% de NP-40 e 5 mM de EGTA, 50 mM de sódio gripe-oride, mM β-glicerol-fosfato-60, 0,5 mM vanadato de sódio-, PMSF 0,1 mM, 10 ug /ml de aprotinina e 10 ug /ml de leupeptina. As amostras de proteína (35 ug) foram submetidas a um 10% de SDS-PAGE e transferidas electroforeticamente para membranas de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). As membranas foram incubadas primeiro com leite magro a 5% em solução salina tamponada com Tris (TBS). Após lavagem três vezes em 0,1% de Tween 20-TBS (TBST), as membranas foram incubadas com anticorpos primários diferentes separadamente a 4 ° C durante a noite, seguido com os anticorpos secundários correspondentes separadamente (1:2000) durante 1 h à temperatura ambiente e o proteínas ligadas a anticorpo foram detectados pelo sistema ECL (Amersham Biosciences, Little Chalfont Buckinghamshire, UK).

a preparação das amostras e extração de proteínas e concentração

a extração celular de LNCaP e as células-s LNCaP e a preparação do ligado celular total foram realizados como anteriormente descrito por [17]. Determinação de proteínas foi feita utilizando reagente de ensaio de Pierce de proteína BCA (Rockford, IL, EUA).

IEF e SDS-PAGE

As amostras foram diluídas para um volume total de 250 ul, 0,2% Pharmalyte , 8 M de ureia, 0,3% de DTT, 2 H CHAPS e um vestígio de azul de bromofenol (Sigma). Uma quantidade de 100 ug de proteína foram carregadas em cada faixa usando através de re-hidratação de pH não linear 3-10 Pronto tira de IPG, tiras (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Focando foi efectuada durante um total de 45500 Vh numa célula IEF PROTEAN (Bio-Rad). géis pré-moldados (12,5% Tris-HCl homogénea Critério) SDS-PAGE (Bio-Rad) foram realizadas usando um aparelho de gel célula Critério Dodeca (Bio-Rad). Um total de 4 géis foram corridos por grupo de amostras. O tampão de corrida foi eléctrodo de Tris 25 mM, glicina 192 mM, 0,1% w /v de SDS. Os géis foram corridos a 250 V durante aproximadamente 1 hora até o marcador azul de bromofenol tinha atingido o fundo do gel a uma temperatura de aproximadamente 15 ° C. As proteínas foram visualizadas por coloração com prata como descrito por [18].

digitalização Gel e análise de imagem

2-DE géis foram digitalizadas a 100 mm resolução (12 bits /pixel) usando um GS -710 densitómetro a laser (Bio-Rad). Os dados foram analisados ​​utilizando o software PDQuest ™ Versão 7 (Bio-Rad). Após a detecção automática de todos os spots de proteínas, gel-imagens foram cuidadosamente editados. As quantidades de proteínas individuais foram expressos em ppm de OD integrada total. Todos os mapas 2-DE foram combinados e avaliados de forma independente. A reprodutibilidade metodológico da análise de 2-DE foi determinada utilizando análise de correlação grupo. Resumidamente, a densidade óptica total é directamente correlacionada com a concentração de proteína total. As pequenas diferenças de carregamento de gel, condições de funcionamento, e coloração com prata pode afectar as comparações da amostra e afectar a reprodutibilidade gel de 2-D. Quatro géis foram corridos a partir de cada grupo de tratamento e as comparações da intensidade das manchas compensadas entre 2-DE géis foram realizadas utilizando o coeficiente de correlação de análise. Um coeficiente de correlação foi medida entre dois geles à base de as densidades ópticas dos mesmos pontos nos dois géis a ser comparados. Um coeficiente de correlação de uma implicará que as duas amostras em comparação sejam idênticos. Em um grupo que consiste em 4 amostras, um máximo de seis pares de comparações inteligentes são possíveis. O coeficiente de correlação média entre as amostras smsDX foi de 0,85 (n = 6 pares de gel, intervalo 0,80-0,92).

A espectrometria de massa análise

As proteínas foram identificadas com um instrumento vMALDI-LTQ (Thermo Electron , San José, CA, EUA). O ponto de separação, descoloração, a digestão, a extracção, a preparação da amostra e detectar em placas alvo MALDI foram efectuadas utilizando uma estação de trabalho spothandling (estação de trabalho ettan Spothandling, GE Healthcare) e um protocolo padrão fornecida pela GE Healthcare. A placa contendo os extractos combinados foram evaporados até à secura. Cada amostra foi preparada por constituindo os péptidos secos em 2,5 ul de solução de matriz (2.5 mg /ml de α-ciano-4-hidroxi-cinâmico ácido (Sigma) em 50% de acetonitrilo contendo 0,05% de TFA). 2,0 ul da amostra foi manchada sobre uma superfície alvo de MALDI corrediça limpa e deixou-se secar. As amostras foram analisadas com um vMALDI-LTQ (Thermo Electron, San José, CA, EUA). A análise foi feita usando Xcalibur 1.4 software no modo dependente de dados. Uma varredura levantamento (MS) foi seguida por verificações de MS /MS nos iões 5 mais abundantes. Esta série de 6 eventos de verificação foi repetido seis vezes para cada ponto de amostra. Dinâmico Exclusão ™ assegurar que um total de 30 péptidos diferentes foram seleccionados e fragmentados para cada amostra. O espectros de MS foram obtidos no intervalo de massa 900-2000 Da, enquanto a faixa de massa para a espectros MS /MS foram seleccionados automaticamente pelo sistema com base em um valor de Q de 0,25. A energia de colisão padrão de 38 foi marcada para toda a análise. Um limite de tempo de 5 minutos /amostra foi seleccionado, se ou não o 30 espectros MS /MS pode ser adquirida. pesquisas de banco de dados foram feitas usando tanto o MASCOTE e algoritmo de busca Sequest contra a sessão humano do banco de dados de proteínas IPI (versão 2.38). As duas pesquisas foram comparados na casa software desenvolvido Promiscuous MS /MS. Foram necessários um mínimo de dois peptídeos e marcar um mascote de 45 para uma proteína para ser aceito como identificados.

Resultados

Criação de linha de células independente de androgénios, LNCaP-s e detecção de AR , CGA e expressão NSE em células LNCaP-s

para abordar a progressão natural do câncer de próstata andrógeno sensível ao andrógeno estado independente, um modelo de células de câncer de próstata é muito importante para

in vitro

estudo . Portanto, cultivadas numa linha celular de LNCaP-S a partir de uma linha celular de cancro da próstata LNCaP parentais em condições de privação de androgênio. células de NE são caracterizados por um fenótipo neuronal do tipo que produzem e segregam uma série de neuropeptídeos envolvidos na proliferação tumoral, metástase transformação e [19]. As características morfológicas apresentaram uma morfologia neuronal com corpos celulares compacta arredondados, tendo estendido e processos ramificados finos. Assim, células LNCaP andrógeno-sensíveis adquirido um fenótipo NE-like (Figura 1) LNCaP-s em uma condição de redução de androgénio. As células NE semelhante, características foram avaliadas por teste dos marcadores de NED, cromogranina A (CgA) e enolase específica dos neurónios (NSE). Após cultura na condição reduzida-androgénio, as células LNCaP mostraram um nível diminuído de expressão de AR, um aumento do nível de expressão de NSE, mas CGA com nenhuma expressão significativa. Figura 1 mostrou diferentes expressões da AR, CGA e NSE em células LNCaP-s.

células LNCaP parentais têm uma morfologia epitheial e células LNCaP-s mostrou uma morfologia neuronal. AR, CGA e NSE expressões em LNCaP e células LNCaP-s examinada por RT-PCR e Western Blotting.

smsDX inibiu a capacidade de invasão das células cancerosas da próstata

É bem estabelecido que somatostatina e os seus efeitos análogos na proliferação de células de cancro da próstata [20]. Mas os efeitos da somatostatina sobre invasividade não tinha sido investigado. Para avaliar os efeitos de smsDX sobre a capacidade de invasão de células de cancro da próstata foi utilizado ferida ensaio de cura e ensaio de invasão de Matrigel ™, a área coberta na ferida e o número de células invasoras através de uma câmara de Matrigel foram significativamente menores para as células tratadas com smsDX que eles foram para as células de controlo tratadas com veículo com células LNCaP e LNCaP-s células (Figura 2 e 3). A inibição da smsDX mostra uma forma dependente da dose, com a capacidade de invadir o número de células, tanto de LNCaP e células LNCaP-s. Estes resultados sugerem que smsDX diminuiu a capacidade de invasão de células cancerosas da próstata.

fotomicrografias representativas demonstram fecho da ferida em células LNCaP (A) e células LNCaP-S (B). Monocamadas de células /-s LNCaP LNCaP foram interrompidas com a ponta da pipeta estéril para criar uniformand tratados com PBS ou 1-10 nM smsDX por 24 horas.

Os dados invasão Matrigel quando células LNCaP /s LNCaP-in bem superior foram incubadas em meio isento de soro e bem inferior foi preenchida com o meio isento de soro e 1-10 nM smsDX ou PBS. Após 24 horas, o número de células que invadiram através Matrigel foi contado em pelo menos 10 campos por poço. Fotografias representativas que revelam LNCaP (A) e células que invadiram através Matrigel LNCaP-S (B). Redução de × 100.

Análise

eletroforese em gel 2D

A Figura 4 mostra géis 2D representativas de células LNCaP-s controle e amostras smsDX em LNCaP e. Três repetições foram realizadas para cada grupo, controle e smsDX. Os efeitos sobre smsDX LNCaP e células LNCaP-S foram comparadas separadamente com o grupo de controlo utilizando um teste de Mann-Whitney.

lisado de células total foi submetido a 2-DE IPG utilizando tiras de pH 3-10 no primeiro e 12,5% de SDS em gel de poliacrilamida na segunda dimensão. A, as células LNCaP parentais, B, células LNCaP-s derivativos. C, LNCaP + smsDX, D, LNCaP-s + smsDX.

As proteínas diferencialmente expressos entre LNCaP e células LNCaP-s

Um total de 222 pontos foram identificados com sucesso usando 2DE- MS base. Na primeira análise, as células LNCaP tratadas com smsDX foram comparados com o grupo de controlo de LNCaP utilizando um teste de Mann-Whitney. 56 proteínas foram encontrados para ser diferencialmente expressos em LNCaP e LNCaP-S (Tabela S1). Na segunda análise, 104 e 86 proteínas, em separado, foram encontrados expressos diferencialmente em células LNCaP e células LNCaP-s a seguir ao tratamento smsDX (Tabela S2A e Tabela S2B). A expressão de isoformas específicas de enzimas metabólicas tem sido mostrada ser crucial para a adaptação de células tumorais a mudanças na disponibilidade de nutrientes, especialmente para enzimas glicolíticas [21]. Então isoformas de proteínas também foram listados nesta tabela. A mesma proteína foi encontrado às vezes em vários pontos de fechamento em géis 2DE, é possível devido a modificação pós-tradução da proteína após o estresse.

Cinquenta e seis proteínas foram encontrados down-expresso (mudança de mais de 1,2 vezes) em células LNCaP-s em comparação com as células LNCaP parentais, conforme listado na tabela S1.

as proteínas tanto em LNCaP e células LNCaP-s afectadas por smsDX incubação com uma mudança vezes ≥1.2 foram listadas no S2A de mesa e mesa S2B .

funções ordenadas de proteínas no efeito da smsDX sobre o câncer de próstata (LNCaP-s) células após o tratamento ADT

as diferentes funções das proteínas com código de adesão consulte o site, http: //www.uniprot.org/uniprot/. As proteínas identificadas foram categorizadas com base nas suas funções bioquímicas conhecidas, incluindo o metabolismo, a transdução, a manutenção da estrutura da célula, regulação da transcrição e regulação do ciclo celular de sinalização. A maior parte da privação do andrógeno salientou proteínas foram regulados negativamente após o tratamento ADT. Quando explorado estas funções das proteínas dentro do site UniProtKB /Swiss-Prot, surpreendentemente, a maioria das proteínas afectadas pela terapia ADT foram encontrados para ser envolvido no metabolismo celular e na regulação da função mitocondrial. Com base nas funções putativas no banco de dados via KEGG (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html), Tabela S3 (A, B, C) foram obtidos a partir S2A de mesa e mesa S2B para destacar as semelhanças /as diferenças no efeito de smsDX entre LNCaP e linhas celulares de LNCaP-s. Tabela S3A listados quarenta e oito proteínas comuns entre LNCaP e células LNCaP-S após exposição a smsDX. Tabela S3B, S3C listou as proteínas diferencialmente afetadas em LNCaP e LNCaP-s células, separadamente.

privação de andrógeno poderia afetar a expressão da proteína mitocondrial, por exemplo, HSPD1, ETFA, GLUD1, PMPCB e et al. Estas proteínas foram encontradas pertencentes a proteínas mitocondriais envolvendo no metabolismo da glicose, a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e função apoptótica mediada por mitocondrial intrínseca. As proteínas com funções importantes no processo metabólico da célula, incluindo a energia (APRT, ATP5B, CKB, TUBB), lipídios (ACAT2, ACADM, PRDX6), glicose (ENO1, TPI1) e ácido amino e biossíntese de proteínas (PHGDH, eIF5A, EIF1AY) , foram encontrados regulados negativamente em células LNCaP-s. Também foram identificadas algumas enzimas metabólicas envolvidas no TCA. tratamento ADT leva a um declínio na expressão da proteína de vários chaperones ER, incluindo GRP78, ERP29, PDIA1 e proteína PDIA3.

Validação de proteínas afetadas por smsDX e ADT tratamento em células de câncer de próstata com Western Blotting

As proteínas em células LNCaP-s envolvendo em diferentes vias de sinalização foram identificados neste estudo, estas proteínas poderia ser regulada por smsDX a alteração diferente dobra conforme listado na tabela S2. Validação das proteínas afectadas pelo tratamento e smsDX ADT em células de cancro da próstata foram realizadas por Western Blotting. Várias proteínas mitocondriais, proteínas de ER e proteínas relacionadas com o metabolismo foram seleccionados para detectar validação com imunotransferência. Figura 5 mostrou que TCTP, STMN1 e CXB3 em células LNCaP depois de ADT foram regulados negativamente e TOM40, GRP78 e VDAC2 que envolva na atividade mitocondrial em células-s LNCaP foram up-regulada por quando tratados com smsDX.

a, expressões mais baixos de TCTP proteínas, STMN1 e CXB3 em células LNCaP após ADT em células LNCaP-s. expressões B, Baixo regulada de TOM40, GRP78 e VDAC2 em células LNCaP por de privação de androgênio, expressões-se regulamentados em células LNCaP-s por tratamento smsDX.

As vias metabólicas reguladas pelo derivado de somatostatina (smsDX) em células cancerosas da próstata

com base no banco de dados via KEGG (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html), apresentamos um diagrama de vias metabólicas reguladas por smsDX no cancro da próstata a partir dependente de andrógeno estado CRPC (Figura 6). As enzimas em círculo foram identificados por 2-DE MS neste estudo actual.

Enzimas e metabolitos que são parte da glicose, síntese de acide gordo e o ciclo de TCA são mostrados. G6PD, glucose-6-fosfato desidrogenase-1. ENO1, Alpha enolase. PPP, via das pentoses fosfato. ACAT2, acetil-CoA-acetiltransferase. ACAMD, Acil-CoA desidrogenase. IDH2, Isocitrato desidrogenase [NADP]. MDHM, malato desidrogenase. GLUD1, glutamato dehydrogenase1. α-KG, α-cetoglutarato. Este diagrama simplificado baseia-se na base de dados via KEGG (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html). As enzimas no círculo foram identificados por 2-DE MS neste estudo atual.

Discussão

andrógeno desempenha um papel essencial no crescimento do câncer de próstata, a privação de modo andrógeno eo bloqueio da AR sinalização eixo é atualmente o principal tratamento para o câncer de próstata e sua progressão. Está bem documentado que a terapia de privação de androgênio clínica está associada com o aumento da diferenciação NE em carcinomas da próstata, e envolvidos na transição para androgénio independência [22], as células de NE são caracterizados por um fenótipo neuronal semelhante: eles são não-proliferativa e expressar proteínas neuronais semelhante, tais como NSE e CGA. Privação de andrógeno pode influenciar os níveis séricos de CgA em diferentes graus no câncer de próstata [23]. A sobre-expressão de NSE em LNCaP-s no nosso estudo foi encontrado na progressão da NED a partir de células LNCaP dependente de androgénio. No presente estudo, depois de até 10 passagens das células LNCaP em uma condição de androgénio reduzido, as características como NE-de LNCaP-S foram identificados através de uma morfologia neuronal e expressões de AR e NSE alterada.

Os efeitos inibição da somatostatina sobre a viabilidade celular e a proliferação do cancro têm sido bem examinados, mas o nosso conhecimento, os seus efeitos sobre a capacidade de invasão não tinha sido investigado. Usando a cicatrização de feridas e ensaio de invasão de Matrigel observou-se que smsDX inibiu a invasão de ambos LNCaP e células LNCaP-s. Embora os mecanismos exatos da smsDX supressão induzida de invasão não estão claras, pode ser devido a respostas às funções mitocondriais danificadas. Em nossos estudos anteriores [7], [24], proteínas mitocondriais regulada e afins smsDX tanto em andrógeno células cancerosas da próstata dependentes e independentes, de modo que as alterações associadas a cancro no metabolismo são possivelmente responsáveis ​​pelos sinais de proliferação celular e sobrevivência no câncer de próstata recorrente e CRPC.

para determinar os efeitos de regulação do metabolismo smsDX na progressão do cancro da próstata a partir de androgénio-dependente ao estado independente de androgénio, foi realizada bidimensional electroforese em gel (2-dE), seguido por espectrometria de massa MALDI-TOF análise. Após a comparação da expressão da proteína em LNCaP-s e as suas células LNCaP parentais, cinquenta e seis proteínas foram encontrados para ser diferencialmente expressos até 1,2 vezes a mudança como mostrado na tabela S1. Estas proteínas foram classificados de acordo com as suas diferentes funções no metabolismo celular, incluindo o açúcar, a energia, o lípido e o processo de aminoácidos. Os resultados sugerem que a alteração metabólica regulada por androgénio é as principais diferenças durante o desenvolvimento do câncer de próstata com o estado andrógeno resistente sensível andrógeno-. foram encontrados os efeitos semelhantes e diferentes causadas por smsDX entre LNCaP e células LNCaP-s. O estresse causado pela privação de andrógeno e smsDX ao ambiente de células de câncer de próstata poderia possivelmente causado danos a função mitocondrial e ativar via AMPK nas células cancerosas da próstata. mitocondriais processos desempenham um papel importante na iniciação e progressão do tumor. O aumento da atividade metabólica é uma característica das células cancerosas proliferam [25]. Assim, suprimindo a actividade metabólica da célula de cancro proporciona uma estratégia alternativa para a fase CRPC. ADT para câncer de próstata causada condição microambiente anormal obter respostas de células tumorais para afetar a atividade metabólica. Estas adaptações otimizar o metabolismo das células tumorais para obter energia e nutrientes do microambiente do tumor. Vários estudos têm mostrado que a biossíntese de andrógenos e Ar sinalização em células de cancro da próstata estão intimamente afetado pela lipogênese [26] – [28]. Assim como alvo os possíveis mecanismos moleculares subjacentes que ligam o metabolismo poderia facilitar ainda mais o desenvolvimento de abordagens terapêuticas promissoras para o status CRPC.

Com base nos dados que coletamos aqui, encontramos o smsDX regulada PI3K /Akt /mTORC1 e TCA ciclo de via cima e para baixo que regulam diferentes proteínas metabólicas listados na S2A tbale e S2B mesa. No cancro da próstata Akt é activada através da via PI3K que surgiu como um caminho crítico para a sobrevivência da célula. Removendo o suporte de androgénio a partir de células LNCaP desencadeia uma série de acontecimentos, incluindo a paragem do ciclo celular e aumento da actividade de PI3K /Akt, culminando na eventual aquisição do fenótipo independente de androgénio [29]. Activado PI3K /Akt conduz à assimilação de glucose melhorado e glicólise [30] .Este via também promove o fluxo de carbono glicose em vias biossintéticas que dependem do metabolismo mitocondrial funcional, incluindo ácido gordo, colesterol e síntese isopronoid todos requerem acetil-CoA. Akt também activa ATP-citratelyase (ACL) promover a conversão de derivados de citrato mitocondrial a acetil-CoA para a síntese de lípidos. mTORC1 é um regulador de crescimento celular bem caracterizada como actuando a jusante de PI3K /Akt, tem muitos efeitos interwined com o metabolismo mitocondrial. mTORC1 é mais conhecido para aumentar a síntese de proteínas [25]. Alfa enolase (ENO1), também conhecida como fosfatase piruvato desidrogenase, é crítico para o metabolismo da energia celular [31]. ENO1, como uma enzima glicolítica chave, desempenha um papel crítico na glicólise anaeróbica. No presente estudo, ENO1 poderia ser regulada para cima por smsDX, que mostrou que smsDX tem um efeito regulador sobre a glicólise em células de cancro da próstata.

O ciclo de TCA é uma via central no metabolismo de açúcares, lípidos e amino ácido, metablites ciclo TCA resultar em redução da diferenciação celular.