Abstract

Fundo

A ativação da MAPK e PI3K /AKT /mTOR está implicada na maioria dos cancros. As mutações de activação ambas estas vias tem sido descrita em cancro colorrectal (CRC), indicando, assim, o seu potencial como alvos terapêuticos. Este estudo avaliou a combinação de um inibidor de PI3K /mTOR (PF-04691502 /PF-502) em combinação com um inibidor da MEK (PD-0325901 /DP-901) em linhagens de células de CRC e modelos de xenoenxerto de tumor de BF derivado de paciente (PDTX) .

Materiais e Métodos

Os efeitos anti-proliferativa de PF-502 e DP-901 foram avaliados como agentes únicos ou em combinação contra um painel de linhas celulares de CRC com várias origens moleculares. Synergy foi avaliada utilizando o método Bliss aditividade. Em linhas de células selecionadas, foram investigados os efeitos da combinação de efectores a jusante por immunoblotting. A combinação foi então avaliada em vários modelos CRC PDTX totalmente geneticamente anotados.

Resultados

in vitro

experimentos demonstraram uma ampla gama de IC

50 valores para ambos agentes contra um painel de linhas celulares. A combinação de PF-502 e DP-901 demonstraram actividade anti-prolif erativa sinergística com valores na gama Bliss aditivo. Tal como esperado, p-AKT e p-ERK foram reprimidos por PF-502 e DP-901, respectivamente. Em modelos PDTX, na sequência de uma exposição de 30 dias para PF-502, PD-901 ou a combinação, a combinação demonstrou maior redução no crescimento do tumor, em comparação com um ou outro agente único, independentemente do estado mutacional do KRAS ou PI3K.

conclusões

A combinação de uma PI3K /mTOR e um inibidor MEK demonstrou melhorados efeitos anti-proliferativa contra linhas celulares de CRC e modelos PDTX

Citação:. Pitts TM, Newton TP, Bradshaw-Pierce EL , Addison R, Arcaroli JJ, Klauck PJ, et ai. (2014) Dupla farmacológico Segmentação da MAP quinase e PI3K /mTOR em modelos pré-clínicos de cancro colorectal. PLoS ONE 9 (11): e113037. doi: 10.1371 /journal.pone.0113037

editor: Marie-Josée Boucher, Université de Sherbrooke, Canadá |

Recebido: 19 de junho, 2014; Aceito: 17 de outubro de 2014; Publicação: 17 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Pitts et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Pfizer Inc e da Universidade do Colorado Cancer Center Grant P30 CA046934. Os financiadores não tiveram um papel menor no desenho do estudo e decisão de publicar. Os financiadores não tiveram nenhum papel na recolha de dados e análise, ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores deste manuscrito ter lido a política da revista e ter os seguintes interesses concorrentes: Pfizer fornece apoio financeiro aos SGE para bolsas de oncologia. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Duas das vias celulares mais implicados em cancros são as quinases fosfatidilinositol-3 (PI3K) e o mitogénio activada proteína quinase (MAPK) vias. A de classe I (PI3K) são cinases de lípidos heterodiméricos que compreendem uma subunidade p85 reguladora e uma subunidade catalítica p110 [1]. PI3K fosforila o grupo 3-hidroxilo do fosfatidilinositol, que participam numa variedade de percursos de sinalização importantes para o cancro, tais como a proliferação, a diferenciação, a quimiotaxia, a sobrevivência, o tráfico, e homeostase da glicose [2], [3]. Devido à sua função celular diversa, o eixo de PI3K é altamente implicada em cancros humanos; até 30% de todos os cancros humanos têm uma mutação em um componente da via PI3K [4]. No cancro colorrectal (CRC), a

PIK3CA gene, que codifica a subunidade catalítica p110α de PI3K de classe I, tem sido encontrado para ser mutado em 10-20% dos espécimes de tumor de CRC [5].

p> Um componente a jusante da via de sinalização de PI3K é o alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR). O crescimento celular é uma das principais funções regidas pela mTOR; activação de mTOR através da via PI3K /AKT é crítica para a célula de absorção de equilíbrio de nutrientes e o crescimento, e hiperactivação aberrante desta via contribui para a tumorigénese [6], [7]. O papel de mTOR nessas funções celulares torna-o um alvo atractivo para a inibição; uma vez que o desenvolvimento de rapamicina quarenta anos, muitos inibidores de primeira e segunda geração de mTOR foram sintetizados e estão em vários estágios de desenvolvimento pré-clínico e clínico [8], [9].

O MAPK /ERK (MEK) complexos são componentes do eixo de sinalização de Ras /Raf. A sinalização através da via esta resulta no aumento da proliferação e resistência à apoptose, enquanto que a activação constitutiva contribui para quimiorresistência em vários cancros [10], [11]. As mutações no KRAS, ARN, ou BRAF (todos a montante dos complexos MEK) são muito comuns no CRC, e têm sido encontradas em 50-60% de amostras de tumores [12], [13]. Uma variedade de agentes têm sido desenvolvidos que visam EGFR, RAS, RAF, ou MEK, muitos dos quais estão em ensaios clínicos e alguns dos quais já estão aprovados [14].

Crosstalk entre o PI3K /AKT /mTOR existe via: por exemplo, a PI3K pode ser activada pelo RAS, e o tuberina supressor de tumor (um regulador negativo da mTOR) é um substrato directo de ERK [15] – [17]. Verificou-se também que a co-ocorrência de alterações na PI3K-AKT-mTOR e vias RAS-RAF-MEK ocorre em um terço de amostras de CRC, sugerindo que a inibição simultânea de ambas as vias pode ser necessário para o benefício terapêutico [12]. Além disso, pensa-se que o eixo de sinalização RAS-RAF-MEK pode actuar como um mecanismo de compensação com a inibição da via PI3K-AKT-mTOR, e vice-versa [18], [19]. A evidência de uma extensa cross-talk entre estas vias criou grande interesse na inibição simultânea, com várias estratégias diferentes atualmente em desenvolvimento [20].

Para explorar a eficácia de inibição simultânea do PI3K-AKT-mTOR e as vias de RAS-RAF-MEK, examinámos a combinação de PF-04691502 (PF-502) com PD-0325901 (DP-901). PF-502 é um inibidor potente oralmente biodisponível, ATP-competitivos de cinase de ambas as PI3Ks de classe I e de mTOR [21], [22]. Num completou recentemente uma Fase I de ensaios clínicos, PF-502 foi encontrado para ser bem tolerada, fadiga, diminuição do apetite, hiperglicemia náuseas, erupção cutânea, vómitos, diarreia e inflamação da mucosa sendo os eventos adversos mais comumente visto. No entanto maioria destes eram de grau 1 ou 2. [23] DP-901 é um muito potente, inibidor da via oral, de pequena molécula da MEK1 e MEK2 que demonstrado alguma actividade em ensaios clínicos iniciais e foi associado com toxicidade característicos desta classe de agentes : erupção cutânea

, diarreia, fadiga, náuseas e distúrbios visuais, [24]. DP-901 está correntemente na fase I de ensaios clínicos para o tratamento de CRC em combinação com PKI-587 (PF-0521384), um inibidor duplo de PI3K /mTOR com uma potência semelhante à PF-502 [24] – [26]. Uma vantagem dessa combinação é que, através da inibição da via PI3K a montante, a regulação positiva de retorno sobre a inibição de AKT mTOR é evitada [27].

Neste estudo, descrevemos a actividade anti-tumoral melhorada da dupla PI3K /inibidor de mTOR PF-502 e o inibidor MEK PD-901 em

in vitro Comprar e

in vivo

modelos de cancro colo-rectal.

Materiais e Métodos

Químicos e reagentes

PF-04691502 (PF-502) e PD-0325901 (DP-901) foram fornecidos pela Pfizer Inc. (San Diego, CA). Para

In vitro

trabalho, ambos os agentes foram dissolvidos em 100% DMSO a uma concentração de 10 mM. Para

In vivo

estudos, PF-502 foi suspenso em 0,5% metilcelulose em água, e DP-901 foi suspenso em 0,5% de metilcelulose de hidroxipropilo, 0,2% de Tween-80 em água.

celular linhas e Cultura

linhas celulares de cancro colorrectal humano foram obtidas da American Type Culture Collection, DSMZ, ou a célula coreana linha de banco. células geo, descrito anteriormente [28], foram gentilmente cedidas pelo Dr. Fortunato Ciardiello (Cattedra di Oncologia Medica, Dipartimento Medico-Chirurgico di Internistica Clinica e Sperimentale “F Magrassi e A Lanzara,” Seconda Universita ‘degli Studi di Napoli, Nápoles, Itália). KM12L4, KM12C e KM20, descrito anteriormente [29], foram todos gentilmente cedido por Scott Kopetz (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX). Todas as células foram rotineiramente cultivadas em RPMI 1640. Todo o meio foi suplementado com 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina e aminoácidos não essenciais MEM a 1%. Todas as células foram mantidas a 37 ° C sob uma atmosfera contendo 5% de CO

2. As células foram rotineiramente testadas quanto à presença de micoplasma (MycoAlert; Cambrex BioScience). Todas as linhas celulares de CRC utilizados neste estudo foram totalmente caracterizados e autenticada na Universidade do Colorado Cancer Center DNA Seqüenciamento e Análise de núcleo.

Sulforodamina B (SRB) e CyQUANT proliferação celular Assays

Células foram semeadas em placas claras de 96 poços a 2000-8000 células por poço, dependendo as propriedades da linha celular. Para o ensaio de CyQUANT, as células foram plaqueadas em placas de paredes negras-. Após 24 h, as células foram incubadas durante 72 horas apenas com meio ou concentrações variáveis ​​de DP-901 (0,015 umol /L-1 umol /L) ou FP-502 (0,08 umol /L-5 umol /L), como agentes isolados ou em combinação. Para o ensaio de CyQUANT, as placas foram preparadas e lido de acordo com o protocolo do fabricante (Life Technologies, Carlsbad, CA). Sulforodamina B de ensaio (SRB) foi realizada como descrito anteriormente [30]. Resumidamente, as células foram fixadas com 10% tricholoracetic acidat 4 ° C durante 30 minutos, lavadas 3X com água, e secou-se à TA. Eles foram então coradas com um sulforrodamina B (SRB) solução (0,4% w /v de SRB em ácido acético a 1%) durante 20 minutos à temperatura ambiente lavou-se 3 x com ácido acético a 1%, e permanecendo SRB foi solubilizado com Tris 10 mM tamponado . A absorvância foi lida a 492 nm, utilizando o leitor de placas de Sinergia 2 (Biotek, Winooski, VT). Os dados foram normalizados para absorção de nenhuma droga (ND). Um efeito da combinação foi analisada utilizando o modelo Bliss aditividade, como descrito anteriormente [31].

Caspase 3/7 Atividade

O ensaio luminescente Caspase-Glo 3/7 (Promega, Milwaukee, WI) foi usado como um indicador da actividade apoptótica através de caspase 3 e 7 actividade. As células foram semeadas em placas de paredes brancas em 2000-8000 células por poço, dependendo as propriedades da linha celular. Após 24 h, as células foram incubadas durante a ponto de tempo indicado com apenas ou concentrações variáveis ​​de DP-901 ou PF-502 meios, como agentes isolados ou em combinação. Os dados são apresentados como vezes de alteração, normalizada com o controlo.

clonogénicos Assays

As células foram semeadas a 2000 células por poço de uma placa de 6 poços e deixou-se ligar durante a noite. DP-901 ou PF-502 foi adicionado como agentes únicos ou em combinação, e incubou-se durante 72 horas. Após 72 horas as células foram lavadas em meio completo e meios de comunicação sem fármaco foi adicionado de volta para um período adicional de 72 horas. As células foram fixadas com metanol a 100% durante 30 minutos e coradas com violeta de cristal a 2%. O violeta cristal foi então solubilizado em ácido acético a 1% e o sobrenadante foi transferido para uma placa de 96 poços. A absorvância foi lida a 565 nm, utilizando o leitor de placas de Sinergia 2 (Biotek, Winooski, VT). Os dados foram normalizados para controlar.

imunotransferência e Anticorpo matriz

As células foram semeadas em placas de 6 poços e deixadas a aderir durante 24 h. As células foram então incubadas durante 24 h quer com DP-901 ou PF-502, ou a combinação. As células foram então lavadas com PBS e lisadas com tampão RIPA (Cell Signaling, Danvers, MA). Depois de sonicação e centrifugação, com um total de 30 ug de lisado de proteína foi aplicada num gel de NuPage (Life Technologies, Carlsbad, CA), sujeito a electroforese e transferido para uma membrana de nitrocelulose usando o iBlot (Invitrogen, Carlsbad, CA). A membrana foi bloqueada e sondada com anticorpos primários durante a noite, lavou-se durante 10 minutos com 3 ×, e sondados com os anticorpos secundários (DyLight sinalização celular, Danvers, MA) e visualizados utilizando o Licor Odyssey (Licor, Lincoln, NE). Todos os anticorpos primários foram comprados a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA) e diluiu-se de acordo com a instruções dos fabricantes. Para a matriz de anticorpo, os tumores excisados ​​foram lisadas em tampão RIPA usando um homogeneizador de tecidos FastPrep24 (MP Biologicals, Santa Ana, CA). A concentração de proteína foi normalizada e adicionado ao stress PathScan e apoptose do anticorpo de Sinalização de matriz de acordo com a instruções dos fabricantes. Matriz foi desenvolvido utilizando o Licor Odyssey (Licor, Lincoln, NE). Intensidade de cada local foram analisados ​​utilizando o programa Image Studio (Licor, Lincoln, NE) ea densidade de cada local foi representada graficamente.

derivados do Paciente Xenoenxerto Estudos

Cinco a seis semanas de idade ratinhos nus atímicos fêmea (Harlan Labs, Indianapolis, iN) foram utilizados para todos os estudos com animais, engaiolados em grupos de 5, mantidos em um ciclo de 12 horas de luz /obscuridade, e dado comida esterilizada e água

ad libitum

. Os xenotransplantes derivados de pacientes foram geradas como previamente descrito [28]. Resumidamente, uma amostra do tumor foi recolhido no momento da cirurgia a partir de um paciente consentindo na Universidade do Colorado Hospital. material de tumor remanescente após análise histopatológica foi cortado em 2 a 3 mm

3 partes, submersas em Matrigel, e implantados subcutaneamente no flanco de cinco ratinhos nus. Depois de tumores foram expandidos através de, pelo menos, a geração F3, eles foram excisadas, corte, e injetado nos flancos direito e esquerdo de cerca de 25 ratos para cada estudo de xenotransplante (50 tumores totais divididas entre quatro grupos: controle do veículo, PF-502 agente único , PD-901 como agente único, e PF-502 /PD-901 combinação). Quando o tamanho médio do tumor atingiu um volume de cerca de 200 mm

3, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos diferentes. Os ratinhos foram monitorizados diariamente para sinais de toxicidade e pesados ​​duas vezes por semana. O tratamento foi administrado uma vez por dia (10 mg /kg PF-502 e /ou 1,0 mg /kg de DP-901) por gavagem oral. O volume do tumor (equação para volume = (comprimento x largura

2) × 0,52) foi avaliada duas vezes por semana, com paquímetro digital, utilizando o pacote de software Diretor de Estudo (Studylog Systems, South San Francisco, CA). as taxas de crescimento do tumor foi determinada para cada tumor individual pelo ajuste dos dados do volume do tumor ao longo do período de tratamento a uma equação de velocidade de crescimento exponencial com SAAM II v. 2.3. (Com o grupo epsilon, Charlottesville, VA). No final do tratamento, os ratinhos foram sacrificados por CO

2 sobredosagem seguido por deslocamento cervical antes da remoção dos tumores para mais análises.

Análise de Dados

One-way ANOVA com análises um pós-teste de Tukey foi utilizado para determinar a significância estatística entre os vários grupos. As análises foram realizadas com Prism versão 5.0,

p

valores. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Ética Declaração

Todo o trabalho dos animais e cuidados foram realizados sob as diretrizes da Comitê Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC). aprovação específica para os experimentos de rato foi obtido com o protocolo 51410 (08) 1E intitulado “Desenvolvimento e Manutenção de GI tumor primário Bank for Projetando Tratamento Rational utilizando explantes de tumores do rato”. Todos os esforços razoáveis ​​foram feitos para amenizar o sofrimento, incluindo anestesia para procedimentos dolorosos. Os tumores humanos foram obtidos utilizando Colorado Institutional Review Board múltipla (COMIRB) aprovou o protocolo de número 08-0439. Consentimento para a recuperação de tumor foi escrito.

Resultados

Os efeitos da PF-502 e DP-901 como agentes únicos sobre a proliferação de linhas celulares de cancro colorectal

linhas celulares de CRC foram expostos a concentrações crescentes de PF-502 e DP-901, durante 72 horas, a proliferação foi avaliada e IC

50 valores foram calculados a partir proliferação média de experiências em triplicado. Como representado nas Figuras 1 e 2 não houve uma diferença maior do que 10 vezes em IC

50 entre as linhas de células sensíveis e resistentes CRC que não se correlacionam com o estado mutacional de KRAS, BRAF, ou PIK3CA. Quatro linhas celulares de CRC com genótipos diferentes foram escolhidas para análise adicional.

As células foram plaqueadas em placas de 96 poços e deixou-se aderir durante 24 horas. As células foram expostas a concentrações crescentes de composto durante 72 horas e a proliferação foi avaliada utilizando o ensaio de CyQUANT. Proliferaion ensaios foram realizados em triplicado e IC

50 valores foram calculados a partir da média de proliferação. estado mutacional de KRAS, BRAF, PIK3CA e estão em caixas coloridas.

As células foram plaqueadas em placas de 96 poços e deixou-se aderir durante 24 horas. As células foram expostas a concentrações crescentes de composto durante 72 horas e a proliferação foi avaliada utilizando o ensaio de SRB. Os ensaios de proliferação foram realizados em triplicado e IC

50 valores foram calculados a partir da média de proliferação. estado mutacional do KRAS, BRAF e PIK3CA estão em caixas coloridas.

efeitos combinatórios da PI3K /mTORi PF-502 eo Meki, PD-901 em linhas celulares de cancro colorrectal

LaVO (KRAS

G13D /PIK3CA

WT), HCT116 (KRAS

G13D /PIK3CA

H1047R), WIDR (BRAF

V600E /PIK3CA

P449T) e Geo (KRAS

G13D /PIK3CA

WT) foram escolhidos para análise posterior combinação.

Cada uma das 4 linhas de células de CRC foram expostas a concentrações variáveis ​​da via PI3K /mTORi, PF-502 e o Meki PD- 901 como agentes únicos ou em combinação, durante 72 horas. A proliferação foi avaliada utilizando o ensaio de CyQUANT e os valores de inibição são apresentadas na Figura 3A. A combinação demonstraram um maior efeito sobre a inibição da proliferação em todas as quatro linhas celulares de CRC testados a várias concentrações. Estes dados foram confirmados em linhas celulares de CRC utilizando o modelo Bliss aditividade. valores Bliss foram calculados como descrito em Materiais e Métodos e a pontuação para cada combinação é apresentado na Figura 3B. HCT116, WIDR e GEO ambos mostram pontuações Bliss média ligeiramente superior a 1 que demonstram uma maior do efeito aditivo (1,08 ± 0,09, 1,11 ± 0,08, 1,08 ± 0,08, respectivamente), enquanto LaVO demonstrou aproximadamente um efeito aditivo (1,019 ± 0,08,). Para determinar se o efeito observado combinação foi associada à inibição irreversível da proliferação, um ensaio clonogénico foi realizada. As quatro linhas celulares de CRC foram expostos a 0,6 umol /L de PF-502 e 0,3 umol /L de DP-901 como agentes isolados e em combinação. Todas as quatro linhas celulares apresentaram uma redução na clonogenicidade da associação versus qualquer agente único passo que a HCT116, GEO e WIDR demonstrou diferenças estatisticamente significativas. (Figura 4).

LaVO (KRAS

G13D), HCT116 (KRAS

G13D /PIK3CA

H1047R), WIDR (BRAF

V600E /PIK3CA

P449T), GEO (KRAS

G13D). As células foram expostas a várias combinações de PF-502 e DP-901, durante 72 horas. (A) Fraction inibida foi traçada após a exposição a um único agente e combinação. (B) aditividade Bliss foi calculada e para avaliar os efeitos combinatórios. pontuações médias bliss foram representados graficamente.

(A) LaVO, (B) HCT116, (C) WIDR, e (D) GEO foram semeadas em placas de 6 poços e expostos a um único agente da PI3K /mTORi , PF-04691502, o Meki, PD-0325901 ou a combinação durante 72 horas. O fármaco foi removido e substituído com meio para permitir o novo crescimento de clones. As células foram então coradas com violeta de cristal e fotografada. (E) O violeta de cristal foi solubilizado em ácido acético a 1% e a absorvância foi determinada num leitor de placas. Os dados foram normalizados para controlar e gráficos. Todos os dados apresentados como média ± SD, valores de p ajustados de variância Tukey: *

p

, 0,05, **

p Art 0,01, ***

p

0,001 vs veículo, #

p

, 0,05, ##

p Art 0,01, ###

p Art 0,001 vs PF-502,

p

, 0,05,

p Art 0,01,

p Art 0,001 vs PD-901. Todos os dados representam três experiências independentes.

Nós também caracterizados os efeitos da PI3K /mTORi, PF-502 eo Meki, PD-901 em efectores a jusante estabelecidos de vias relevantes. PF-502 foi mostrada para diminuir AKT, 4EBP1 e S6RP fosforilação [22], enquanto DP-901 inibe a fosforilação de ERK [32], [33]. Para validar os efeitos desses 2 agentes e procurar evidências de um efeito cooperativo, foram analisados ​​modulação dos alvos a jusante nas vias MAPK e PI3K. Como representado na Figura 5, o tratamento com PF-502 ou DP-901 diminui induzidas em pAKT, pS6RP, P4EBP1, e pERK respectivamente. Curiosamente, após exposição à Meki, PD-901 observou-se uma diminuição mais pronunciada em pS6RP do que o que foi observado nas células tratadas PF-502 em três das quatro linhas celulares de CRC. Essas reduções foram em grande parte mantido na combinação.

A apoptose é reforçada após a exposição à combinação de PF-502 e PD-901 em linhas celulares de cancro colorectal

Os dados indicaram que clonog�icas a combinação resultou em efeitos antiproliferativos sustentada, portanto, nós medimos a apoptose como outro endpoint fenotípica. Para fazer isso, expôs as quatro linhas celulares de CRC a 0,6 mmol /L de PF-502 e 0,3 mmol /L de PD-901 como agentes únicos ou em combinação, durante 24 horas. A apoptose foi medida pelo ensaio de caspase 3/7 Glo. Como representado na Figura 6, embora tenha havido uma tendência para o aumento da apoptose com a combinação de todas as linhas de células, em células WiDr estes efeitos foram estatisticamente significativos em comparação com ambos os agentes isolados.

Todos os dados apresentados como a média ± DP, valores de p ajustados de variância Tukey: *

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, 0,05, **

p Art 0,01, ***

p Art 0,001 vs veículo, #

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p Art 0,01, ###

p Art 0,001 vs PF-502,

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, 0,05,

p Art 0,01,

p Art 0,001 vs PD-901. Todos os dados representam três experiências independentes.

efeitos antitumorais da PF-502 e DP-901 em pacientes derivado xenotransplantes tumorais

Avançar para confirmar os efeitos anti-tumorais observados no nosso

in vitro

modelo, expostos quatro pacientes derivado xenotransplantes tumorais modelos (PDTX) com variados estado mutacional ao PI3K /mTORi, PF-502, o Meki, PD901, ou a combinação. Os efeitos anti-tumorais de cada composto foi avaliada por determinação da taxa de crescimento de cada tumor individual em cada grupo de tratamento. Como representado na Figura 7A, apenas o modelo CUCRC040 (

KRAS

G12V /PIK3CA

E542G) demonstraram um benefício significativo do tratamento de combinação em relação aos tratamentos únicos agentes (P 0,05). O tratamento de combinação também foi estatisticamente significativa na CUCRC108 (KRAS

G12C) e CUCRC125 (

WT KRAS) modelos PDTX em relação aos controles, mas não em comparação com grupos de tratamento único agente (Figura 7B-C). E, o (G13D KRAS

) modelo CUCRC042 foi relativamente insensível a todos os tratamentos (Figura 7D). As curvas de crescimento do tumor são apresentadas na Figura S1.

Cada ponto representa um único tumor. A taxa média de crescimento do tumor ± desvio padrão são representados pelo bar e alças. Todos os dados apresentados como a média ± DP, valores p ajustados de Tukey ANOVA: * P 0,05 versus Controlo;

† P 0,05 vs. 901;

‡ P 0,05 vs. 502.

A combinação de PF-502 e DP-901 inibe vias pró-sobrevivência e impactos marcadores apoptóticos em modelos PDTX

Para avaliar os efeitos nas vias de sinalização da via PI3K /mTORi, PF-502 e o Meki, DP-901, nos modelos PDTX, uma matriz de anticorpo foi usada com os lisados ​​de tumores recolhidos a partir do grupo para cada modelo no final do estudo. Os tumores foram lisadas em tampão RIPA e aplicado ao stress PathScan e apoptose Sinalização Anticorpo matriz em concentrações iguais. As matrizes foram visualizados em um Licor Odyssey e densidade /intensidade das manchas duplicadas a partir de três diferentes tumores foram normalizados para o controle do veículo e gráficos. Níveis de pERK e pAKT foram diminuiu nos grupos de tratamento de DP-901 e PF-502, em comparação com o controlo, no CUCRC040, modelos CUCRC108 e CUCRC125 PDTX, o que é consistente com os perfis de crescimento do tumor e da resposta observada nos estes grupos de tratamento ( A Figura 8A-B e Figura S2). Além disso, a regulação negativa de pERK e pAKT foi mantida nos grupos de combinação nestes modelos. No entanto, apenas no modelo CUCRC040 foi o nível de pERK no grupo de combinação, na verdade, mais baixa do que ambos os braços individuais do agente. O modelo resistente CUCRC042 não mostrou qualquer redução no pERK ou pAKT (Figura 8A-B e Figura S2). Interessantemente, no tratamento CUCRC042 com DP-901 resultou em um aumento na pAKT e um aumento em pBAD (Figura 8B e Figura C-S2).

A proteína total foi purificado a partir de PDTX no final do tratamento e avaliadas uma matriz de anticorpo estresse e apoptose. foram obtidos a densidade dos pontos, e gráficos. Todos os dados apresentados como média ± SD, valores de p ajustados de variância Tukey: *

p

, 0,05, **

p Art 0,01, ***

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0,001 vs veículo, #

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, 0,05, ##

p Art 0,01, ###

p Art 0,001 vs PF-502,

p

, 0,05,

p Art 0,01,

p Art 0,001 vs PD-901. Todos os dados são um representante do três tumores separados de cada grupo.

Discussão

Aproximadamente 40% dos cânceres colorretais abriga uma mutação no gene KRAS causando esta via ser constitutivamente ativo. Outras mutações nessa via, incluindo RAS (ARN e HRAS) e BRAF compreender outro 1-3% e 5-15%, respectivamente [34], [35]. PIK3CA mutações ocorrem em aproximadamente 15% dos cancros colorectal e destes 8-9% apresentam mutações em ambos PIK3CA e KRAS [34], [36]. Com estas importantes pró-sobrevivência /vias proliferativas ativos em cânceres colorretais, além do cross-talk /feedback que ocorre entre estas vias, há uma lógica para direcionar ambas as vias com inibidores de pequenas moléculas.

inibidores da via RAS /RAF /MEK foram em torno de mais de uma década de estudos clínicos e de agente único têm sido muito decepcionantes. Por exemplo, um ensaio de Fase II com CI-1040, um inibidor da MEK de primeira geração, no cancro colo-rectal avançado não demonstrou actividade anti-tumoral significativa. No entanto, um estudo mais recente de Fase II com a segunda geração selumetinib inibidor MEK demonstrou uma actividade semelhante ao capecitabina agente quimioterapêutico em pacientes de CRC [37], [38]. Com resultados modestos a única agente de inibição de MEK em cânceres colorretais, parece óbvio que a terapia combinada deve ser investigada.

Numerosos estudos pré-clínicos demonstraram que a segmentação tanto o RAS /RAF /MEK eo AKT /PI3K /mTOR é mais vantajoso em numerosos tipos de tumores [39] – [42]. No cancro do ovário co-segmentação da via PI3K /mTOR e RAS /MEK via demonstrada uma inibição sinergística da proliferação e indução da morte de células [42]. Da mesma forma, em modelos de cancro da mama basais semelhante, foi observada uma inibição aumentada de proliferação e um aumento da apoptose

In vitro

e um aumento da inibição do crescimento do tumor foi observada

In vivo

[39] . A maioria dos dados em câncer colorretal tem sido em modelos KRAS mutante uma vez que esta população tem necessidade de novas terapias inovadoras. Roper

et. al

. demonstraram que a combinação de PI3K e inibição de MEK promove a apoptose e regressão do tumor em modelos de ratos com câncer colorretal [41]. Outro estudo em modelos PDTX colorretal em humanos, demonstrou um efeito mais estase do tumor, com e pouco regressão sugerindo que este regime de combinação pode não se traduzir em efeitos terapêuticos duráveis ​​[40].

No presente estudo utilizamos tanto o cancro colorectal linhas celulares e modelos PDTX para demonstrar que a terapia combinada PI3K /MEK é mais ativo do que o tratamento único agente em modelos de CRC com fundos moleculares distintas. Ambos PF-502 e PD901 exibiram atividade do agente único contra em um grande painel de linhas celulares de cancro colorrectal, independentemente de estado mutacional RAS ou PIK3CA. Quando a combinação foi testada em KRAS mutante, BRAF mutante ou KRAS /PIK3CA mutantes duplos houve um efeito da combinação reforçada em várias concentrações com HCT116, WIDR e GEO exibindo um efeito combinação ligeiramente mais robusto, quando comparado com LaVO. A capacidade para formar colónias após exposição à combinação também foi prejudicado indicando que a inibição destas vias conduz a um agente citotóxico, em vez de fenótipo citostático. Isto foi ainda apoiado por um aumento da apoptose em combinação. É interessante notar que, após tratamento com o Meki, PD901, uma diminuição marcada foi observada em pS6RP em três dos quatro modelos de linhas celulares de CRC. Isto pode ser devido ao facto de a actividade TORC1, que efectua S6 fosforilação é um ponto de convergência que incorpora múltiplas vias de sinalização a montante, em alguns tipos de tumores. Por exemplo, em pacientes com melanoma sensível MAPKi, o tratamento com um Rafi ou um Meki, resulta em diminuição da PS6, enquanto que nos modelos insensíveis sem diminuição da fosforilação é observado [43]. O mesmo pode ser verdade em três-901 com DP linhas sensíveis CRC celulares (HCT116, LOVO, e WiDr), em contraste com a linha mais resistente CRC célula, GEO, o que pode indicar que a diminuição da pS6RP pode servir como um marcador de resposta.

em seguida, transferida nossos

in vitro

dados

in vivo

usando nossos modelos CRC PDTX. Estes modelos são pensados ​​para fornecer melhorias significativas sobre xenoenxertos da linha de células normais, embora validação clínica está em curso [40], [44]. Similar ao

in vitro

dados houve resposta heterogênea ao tratamento combinado com um modelo, CUCRC040, demonstrando um efeito estatisticamente significativo combinação. Isto estava em contraste com os modelos e CUCRC108 CUCRC125, onde a combinação só foi estatisticamente diferente da do veículo e para CUCRC042 que não exibiram efeitos de tratamento. Curiosamente, este modelo PDTX resistente, exibiram um aumento no pAKT quando tratados com o Meki, DP-901, que foi associada com um aumento em pBAD, uma proteína que pode ter efeitos anti-apoptóticos e levar a sobrevivência celular aumentada [45]. sucesso misto Isso pode ser vale a pena perseguir como um mecanismo de resistência putativa.

Apesar da forte evidência pré-clínica para apoiar co-alvo da PI3K /mTOR e MAPK em vários tipos de tumor, os primeiros resultados dos ensaios clínicos têm demonstrado [46 ] – [48]. As combinações foram geralmente bem toleradas e as doses terapêuticas foram alcançados com a evidência inicial da actividade anti-tumoral observada em pacientes com melanoma avançado e câncer de ovário seroso de baixo grau, enquanto que em pacientes com tumor encolhimento cancro colorectal foi raramente documentado.

em um estudo de Fase I, pacientes com câncer colorretal foram submetidos perfil molecular potencial para mutações no KRAS, BRAF, PIK3CA e níveis de PTEN e PMET expressão. Estes pacientes foram então oferecido primeiro-em-humanos estudos de Fase I com base nos resultados destes perfis de expressão de proteínas genética /alteradas. As escolhas incluídas segunda geração de anti-EGFR mAb (se KRAS do tipo selvagem), os inibidores da via PI3K (se mutação PIK3CA ou baixa expressão de PTEN), inibidor de mTORC1 mais o AcM anti-IGF1R (se for baixa expressão de PTEN), inibidores da via PI3K mais MEK inibidores (se KRAS ou mutação BRAF), inibidor de BRAF (se a mutação BRAF) e mAb anti-HGF (se a expressão alta PMET) [49].