Abstract
Fundo
O câncer de próstata é inicialmente dependente de andrógenos para a sobrevivência e crescimento, tornando a terapia hormonal tratamento pedra angular para tumores em estágio final. No entanto, apesar remissão inicial, o câncer irá inevitavelmente se repetem. O presente estudo foi desenhado para investigar como as células de câncer de próstata andrógeno-dependentes, eventualmente, sobreviver e retomar o crescimento sob condições de privação de andrógeno e anti-andrógeno suplementados. Como sistema modelo, foi utilizada a linha celular PC346C andrógeno-sensível e suas sublinhas resistente à terapêutica:. PC346DCC, PC346Flu1 e PC346Flu2
Metodologia /Principais Achados
tecnologia de microarrays foi utilizado para analisar as diferenças de expressão genética entre as linhagens de células PC346 andrógeno-sensíveis e resistente à terapêutica. microarrays análise revelou 487 transcritos diferencialmente expressas entre a as linhas de células resistentes à terapia de andrógeno-sensível e. A maioria destes genes eram comuns a todos os três sublinhas resistente à terapia e apenas uma minoria (~ 5%) foi andrógeno-regulamentado. Pathway Analysis revelou enriquecimento em funções que envolvem o movimento celular, o crescimento celular e a morte celular, bem como a associação com o cancro e doenças do sistema reprodutivo. PC346DCC expressaram níveis residuais de receptor de andrógeno (AR) e mostrou significativa diminuição da regulação de genes regulados por andrógenos (valor-p = 10
-7). -Regulação de oncogenes e a repressão do tumor-supressor DKK3 vav3 e TWIST1 foi observada em PC346DCC, sugerindo um mecanismo potencial de bypass AR. validação subsequente destes três genes em amostras de pacientes confirmou que a expressão foi desregulamentado durante a progressão do câncer de próstata.
Conclusões /Significado
crescimento resistente à terapêutica pode resultar de adaptações na via AR, mas androgénio autonomia também pode ser alcançado por mecanismos de sobrevivência alternativas. Aqui nós identificamos TWIST1, vav3 e DKK3 como potenciais jogadores no bypass da via AR, tornando-os bons candidatos como biomarcadores e novos alvos terapêuticos
Citation:. Marques RB, Dits NF, Erkens-Schulze S, van Weerden WM, Jenster G (2010) Bypass Mecanismos de receptor de andrógeno Pathway em resistente à terapia do cancro da próstata celular Models. PLoS ONE 5 (10): e13500. doi: 10.1371 /journal.pone.0013500
editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América
Recebido: 01 de julho de 2010; Aceito: 29 de setembro de 2010; Publicação: 19 de outubro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Marques et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O trabalho apresentada neste manuscrito foi apoiado financeiramente pela Organização holandesa para Pesquisa Científica (NWO), por meio ZonMW concessão 903-46-187, e pelo Cancer Society Holandês (KWF), por meio de doações NKB97-1479 e DDHK 2001-2455. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de próstata (PCA) é a segunda principal causa de mortes por câncer do sexo masculino nos países ocidentais e um problema crescente em aqueles que adotam estilo de vida ocidental e dieta. Avanços no rastreio e diagnóstico têm permitido a detecção de tumores em estágios iniciais, quando a terapia curativa ainda é viável. Durante a fase final de doença disseminada no entanto, as terapias atuais são meros paliativos e não existe tratamento curativo. Uma vez que o crescimento de tumores na próstata é originalmente andrógeno-dependente, os cancros metastáticos são geralmente tratados com a terapia de ablação de androgénios, com ou sem suplementação de antiandrogénio [1], [2]. A grande maioria destes pacientes mostram uma regressão clínica significativa, mas o câncer finalmente se repete dentro de 12-18 meses. Estes tumores recorrentes ter escapado supressão de androgénio e tornaram-se resistentes à terapia hormonal, referido como hormona refractário ou resistente à castração CaP. Para sobreviver e retomar o crescimento em um ambiente privado de andrógeno células APC, deve adaptam a via de receptor de andrógeno (AR) com as condições de depleção de androgênio ou invocar sobrevivência e crescimento caminhos alternativos [3]. evidência experimental muito existe para apoiar ambos os mecanismos, que não são mutuamente exclusivas. AR expressão foi mostrada para ser mantida na maior parte dos pacientes que foram submetidos a terapia hormonal e que demonstraram recorrência da doença, sugerindo um papel da AR também na fase tardia da doença [4], [5]. Além disso, o gene de AR é amplificada e /ou sobre-expresso em cerca de 30% dos tumores refractários a hormona de terapia, e tem sido proposto que poderia sensibilizar o receptor para as concentrações de androgénio residuais e antiandrogénios presentes sob terapias hormonais [6], [7 ], [8]. Além disso, várias mutações Ar, resultando no aumento da actividade ou especificidade do ligando ampliado para esteróides e anti-androgénios alternativas, têm sido associados com a progressão da doença [9], [10]. Outras modificações da via AR que podem induzir o crescimento hormônio-refratário incluem steroidogenesis intratumoral, a ativação independente de ligante por cross-talk com outras vias de sinalização, alterações no equilíbrio de AR co-reguladores ou a expressão de isoformas AR truncadas constitutivamente activas [3] [11], [12]. Curiosamente, recente trabalho dos outros e nos revelou que a via de AR pode ser atenuada selectivamente na doença avançado /metastático [13], [14], [15]. Uma vez que a via de AR está também envolvido em processos de diferenciação e maturação celular da próstata, é tentador sugerir que as células APC, pode, eventualmente, ter vantagem de crescimento inibindo a diferenciação induzida por RA. Alertado por estes resultados, nós nos concentramos no presente estudo sobre a sobrevivência e crescimento caminhos alternativos, que são independentes da ativação do AR. Para contornar eficazmente a via AR, células epiteliais de cancro deve ser capaz de sobreviver aos sinais apoptóticos desencadeadas por terapias hormonais e invocar vias de crescimento alternativos. produção autócrina de factores de crescimento ou seus receptores, a activação de oncogenes e de inibição de genes supressores de tumores são todos os possíveis mecanismos de contornando a via AR. Consistente com esta hipótese, factores de crescimento parácrinos que normalmente são secretadas por células do estroma da próstata, tais como o factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento semelhante a insulina 1 (IGF-1), factor de crescimento de hepatócitos (HGF), factor de crescimento de queratinócitos (KGF) ou interleucina 6 (IL6), são encontrados para ser sobre-expressão no câncer hormônio-refratário em associação com um interruptor para produção autócrina por células epiteliais de câncer [16]. Além de ser potenciais agentes mitogénicos, evidência crescente indica que estas hormonas de crescimento também são capazes de conversa cruzada com a via de sinalização de AR, que conduz a expressão de genes alvo de RA na ausência de androgénios [17]. Portanto, ele ainda tem de ser determinado se a produção autócrina desses fatores de crescimento representa uma adaptação ou um verdadeiro desvio da via de sinalização AR. Alterações no anti-apoptótica
BCL2
oncogene e na pró-apoptótica
P53 Comprar e
PTEN
genes supressores de tumores também foram encontrados no câncer de próstata [18], [19]. No entanto, esses eventos ocorrem principalmente antes da progressão fase tardia, tornando-os candidatos menos prováveis para a chave para o crescimento hormônio-refratário na doença fase tardia. No entanto, através da inibição da morte celular CaP e deslocando o equilíbrio no sentido da proliferação celular, genes envolvidos na regulação da apoptose pode também desempenhar um papel no crescimento do refractário a hormonas.
Para explorar o mecanismo (s) pelo qual androgénio células CaP dependentes se tornam resistentes à terapia hormonal, usamos tecnologia de microarrays para interrogar as diferenças na expressão genética entre linhagens de células andrógeno-sensíveis e resistente à terapêutica. Como sistema modelo foi utilizada a linha celular PC346C andrógeno-sensível e suas sublinhas resistente à terapêutica PC346DCC, PC346Flu1 e PC346Flu2. Estes sub-linhas foram derivadas a partir da PC346C parental por ablação de longo prazo de androgénio (PC346DCC), suplementado com a hidroxiflutamida antiandrogénio (PC346Flu1 e PC346Flu2) [20], [21]. Estudos anteriores revelaram modificações AR distintas em todos os três sublinhas de terapia-resistentes, o que correspondeu a diversos mecanismos de crescimento hormônio-refratário. Considerando PC346DCC, que expressam níveis muito baixos de AR e PSA, mostrou evidência de bypass da via AR, PC346Flu1 exibiram quatro vezes AR-regulação e PC346Flu2 foi mostrada para transportar a mutação T877A AR. Ambos os PC346Flu1 e PC346Flu2 sublinhas de replicar a progressão para doença refratária hormônio terapia através de adaptações da via AR. Portanto, nós nos concentramos na sublinha PC346DCC selecionar para genes particularmente envolvidos no desvio da via AR. Além de fornecer novos insights sobre os mecanismos de progressão APC, os genes aqui identificados podem ser úteis como marcadores prognósticos e alvos potenciais para novas abordagens terapêuticas.
Métodos
Reagentes e linhas de células
a linha celular foi derivada PC346C a partir do tumor da próstata de um paciente com adenocarcinoma de próstata não-progressiva (T4N0M0) [20], [21]. O PC346DCC, sublinhas PC346Flu1 PC346Flu2 e foram derivados a partir de PC346C sobre a cultura a longo prazo em meio despojado com carvão, com ou sem suplementação de antiandrogénio hidroxiflutamida, respectivamente. O desenvolvimento e a caracterização destas linhas celulares foi publicado anteriormente [20], [21]. O meio de cultura básico utilizado na manutenção de linhas celulares PC346 consistiu em meio DMEM-F12 (Cambrex BioWhitaker, Bélgica) suplementado com 2% de soro fetal de vitelo (FCS; PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Alemanha), 1% de insulina-transferrina-selênio (Gibco BRL), 0,01% de albumina sérica bovina (Boehringer Mannheim, Alemanha), 10 factor de ng /mL de crescimento epidérmico (Sigma-Aldrich), penicilina /antibióticos estreptomicina (100 U /ml de penicilina, 100 mg /mL de estreptomicina; BioWhitaker, Bélgica ); mais os seguintes acréscimos: 100 ng /ml de fibronectina (Porto Bio-Products, Tebu-bio, Países Baixos), 20 mg /ml fetuine (ICN Biomedicals, Holanda), 50 ng /ml choleratoxin, fosfoetanolamina 0,1 mM, 0,6 ng /triiodotironina ml e 500 ng /ml de dexametasona (todos de Sigma). PC346C células foram mantidas em cultura em meio completo acima descrito, suplementado com 0,1 nM de 17-metiltrienolona (R1881; NEN, Boston, MA, EUA). meio de selecção PC346DCC foi completado tal como descrito acima, mas a partir de androgénios empobrecido usando carvão vegetal revestido com dextrano (DCC) tratada FCS. PC346Flu1 e meio de cultura, também foi PC346Flu2 androgénio esgotados usando 2% de DCC-FCS, e suplementado com 1 fiM de hidroxiflutamida (OH-flutamida, Research Institute Schering-Plough, New Jersey, EUA).
As células foram cultivadas em T25 Primaria ™ frascos de cultura de tecido (BD Biosciences Benelux NV, Holanda) a 37 ° C sob 5% de CO
2 atmosfera húmida.
Expression microarray análise
As células foram semeadas em seu respectivo meio de selecção para alcançar ~ 50% de confluência e deixado a crescer durante 2 dias. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS e armazenadas a -20 ° C até o isolamento de ARN. O ARN total foi isolado com o reagente RNAzol B (Campro Scientific, Veenendaal, Holanda) e adicionalmente purificado por meio de colunas RNeasy (Qiagen) com digestão de ADN em coluna, de acordo com o protocolo do fabricante. qualidade de ARN foi verificada em gel de agarose a 1%.
Cy3- ou sondas de ARN marcado com Cy5 foram produzidos por incorporação UTP amino-alil durante a amplificação de RNA, seguido de acoplamento a N-hidroxisuccinimida corante modificado. Em resumo, 3 ug de ARN foi utilizado para um protocolo de amplificação linear à base de ARNm de T7, descrito anteriormente [22]. UTP amino-alilo, além de uma quantidade igual de rUTP não modificada, foi incorporada com o Kit T7 ARNA MEGAscript (todos da Ambion), de acordo com o protocolo do fabricante. RNA amplificado foi purificado e concentrado utilizando Microcon-YM 30 colunas (Amicon®) para lavar três vezes com 300 mL de água livre de RNAse. Finalmente, 2 ug de ARN, em um máximo de 3,33 mL de água livre de RNase modificado por aminoallyl, foi incubado com 1,66 ul de tampão de bicarbonato de sódio (0,3 M, pH 9) e 5 ul Cy3- ou corante Cy5- (CyScribe Post-Labeling kit, Amersham, NJ, EUA), durante 1 h no escuro a temperatura ambiente. A reacção foi parada com 5 ul de hidroxilamina 4 M de HCl (Sigma), as sondas contra-marcadas foram combinadas e purificadas /concentradas utilizando Microcon YM-30 Sonda foi recolhido em 5-15 ul volume final e ressuspendeu-se em 80 ul de tampão de hibridação número Ambion 1 .
Para o microarray usamos oligoarrays double-dye que representam cerca de 15.000 genes humanos, em que rotulados RNA a partir da cada sub-linha resistente à terapêutica foi cohybridized com PC346C contra-rotulados. Quatro microarrays foram realizadas por condição, utilizando duas passagens celulares distintas na tintura-swap. Isto foi feito para ter em conta a variabilidade biológica e para excluir corante preferencial de ligação a oligonucleótidos sobre o micro-arranjo. Os oligoarrays utilizados neste estudo foram produzidas no Centro Erasmus para Biomics. Resumidamente, um humano 18,584 oligonucleotídeos biblioteca (Compugen, Sigma-Genosys) foi descoberto em lâminas aminossilano usando um arrayer Virtek Chipwriter Professional (Virtek Vision International, Waterloo, Canadá). pontos de controle incluídos marcos, tampão manchas, oligonucleotídeos alienígenas (SpotReport Oligo estrangeiro matriz, La Jolla, Stratagene), poli d [A] 40-60, ADN de esperma de salmão, e de DNA COT-1 humano. Antes da hibridação, as lâminas de microarray foram pré-hibridados em SSC 5x, SDS a 0,05%, solução de BSA a 4% durante 30 min a 45 ° C, lavou-se duas vezes com água livre de RNase durante 2 min, lavou-se com isopropanol e spin-seco durante 3 min a 1500 g. As hibridações foram realizadas durante a noite Microarray a 45 ° C, com agitação contínua, numa estação de hibridação HS4800 (Tecan Benelux BV). Finalmente, as matrizes foram lavadas automaticamente na Estação A hibridação utilizando:. 2x SSC /SDS a 0,05% (a 45 ° C), 1x SSC e 0,2x SSC (à temperatura ambiente), e secou-se sob uma corrente de N2, antes da digitalização
Arrays de extração e análise de dados
foram digitalizados em um scanner HT ScanArray Express (Perkin Elmer, Nederland BV) e intensidades exatas foram quantificados utilizando software Imagene (Bio Descoberta Inc, El Sequndo, CA, EUA ). Para equilibrar Cy3 e Cy5 intensidades local, Loewess normalização per subarray foi realizada utilizando limma-package (https://bioinf.wehi.edu.au/limma/) a partir Bioconductor (https://www.bioconductor.org) [23] , [24]. Para dimensionar entre matrizes, a intensidade média mundial por matriz foi estabelecido em 1000. intensidades Dye abaixo de 200 foram então thresholded em 200, para minimizar o ruído e fazer fold-change na faixa de baixa intensidade mais firme contra valores extremos. Spots com intensidades abaixo do limiar (200) para ambos os canais Cy3 e Cy5 em mais do que 2 dos 4 conjuntos realizados por sub-linha foram excluídos da análise. Amostra para referenciar os rácios foram calculados e 2log transformado. Pontos que mostraram efeitos opostos para o corante de troca /réplicas biológicas foram excluídos da análise posterior; efeitos foram chamados oposto, se a relação 2log média para o per sublinha foram ≥0.5 para um corante e abaixo ≤-0.5 para o corante-swap. Após normalização e todos os controlos de qualidade acima mencionados, as razões de intensidade 2log-se a média para os replicados de cada sub-linha. Estes dados foram armazenados em SRS7 (Sequence Retrieval System versão 7, Lion Bioscience AG, Heidenberg, Alemanha), que também foi utilizado para as comparações com outras bases de dados públicas previamente publicados /disponíveis [25]. Os dados de microarray foi depositado no gene Expressão repositório Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/sob o número de acesso GEO GSE21596). agrupamento hierárquico e visualização de dados foi realizada por meio de programas de cluster e TreeView (Eisen Labs: https://rama.lbl.gov). Análise de significância de Microarrays (SAM; https://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM) foi utilizado para determinar quais os genes foram estatisticamente diferentes entre as amostras estimuladas e não estimuladas referências. agrupamento Gene ontologia foi realizada utilizando banco de dados para anotação, visualização e descoberta integrada (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov) [26], [27]. As análises da via e funcionais foram gerados através do uso de Ingenuity Pathways Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).
síntese de cDNA e análise de RT-PCR
normais e tumorais espécimes de pacientes utilizados para análise em tempo real RT-PCR quantitativa foram obtidos a partir do banco de tecidos congelados do Centro Médico Erasmus (Roterdão, Países Baixos). Os espécimes foram coletados entre 1984 e 2001. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética Médica do Erasmus MC de acordo com a pesquisa clínica envolvendo seres humanos agem. Informações adicionais sobre essas amostras foi fornecida anteriormente. [28] O RNA total foi isolado como descrito acima e o ADNc foi sintetizado utilizando o kit da transcriptase
12-18 iniciador MMLV-inversa e oligo (dT) (Invitrogen), de acordo com o protocolo do fabricante. amostras de cDNA foram armazenadas a -20 ° C. a análise por PCR em tempo real TaqMan foi realizada num Prism 7700 Sistema de Detecção de Sequência ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA), utilizando polimerase de ADN AmpliTaq Gold (Applied Biosystems), de acordo com as especificações do fabricante. primers validados e sondas de Gene TaqMan Ensaios de Expressão (Applied Biosystems) foram utilizados para quantificação de vav3 (Hs00916821_m1), TWIST1 (Hs00361186_m1), DKK3 (Hs00951307_m1) e GAPDH (Hs99999905_m1), de acordo com as configurações de PCR fornecidos pela Applied Biosystems. PBGD foi quantificada utilizando 0,33 ^ M de iniciadores directos: CATGTCTGGTAACGGCAATG e reverso: iniciadores GTACGAGGCTTTCAATGTTG, em Power PCR Master Mix SybrGreen (Applied Biosystems), de acordo com o protocolo de ciclos térmicos recomendado pelo fabricante. quantidades de transcritos para cada amostra foram normalizados contra a média de duas referências endógenos e em relação a um calibrador. Os dois genes de limpeza utilizados como referências endógenos foram
PBGD
e
GAPDH
; uma mistura de cDNAs a partir de xenoenxertos de carcinoma da próstata foi usado como o calibrador. Gráficos e estatísticas foram realizadas com GraphPad Prism (versão 3.0). P-valores 0,05 foram considerados significativos
Resultados
perfil de expressão gênica diferencial entre o PC346C andrógeno-sensível e suas sublinhas resistente à terapêutica
análise de arranjo de Expressão foi realizada. para explorar se a via AR ainda está ativo nas células refratários hormônio-terapia em condições de privação de andrógeno e identificar vias de crescimento /sobrevivência alternativas putativos. Cada uma das sub-linhas resistente à terapia foram cultivadas no respectivo meio de selecção (meio despojado-esteróide para PC346DCC, suplementado com 1 ^ M OH-flutamida para PC346Flu1 e Flu2) e hibridou-se nas micromatrizes, em conjunto com o PC346C responsivos aos andrógenos parental (cultivadas em meio completo suplementado com 0,1 nM R1881). Para levar em conta a variabilidade biológica e corante preferencial de ligação a oligonucleótidos no microarray, quatro matrizes foram realizadas por condição, utilizando duas passagens celulares independentes em corante de troca. Variação no padrão de expressão foi analisada por sub-linha resistente à terapia, e as manchas foram consideradas diferencialmente expressas, se a relação 2log absoluta ≥ 0,5 (razão ≥ 1,42 ou ≤0.71) durante pelo menos três das matrizes e 4 para a média de todos os quatro matrizes. De acordo com estes critérios, houve um total de 487 transcritos diferencialmente regulados nas sublinhas resistente à terapêutica em comparação com PC346C sensível ao androgênio, a maioria dos quais foram sobrepostos os três sublinhas refratários (Fig. 1). Com 276 transcritos diferencialmente reguladas, PC346DCC mostrou a divergência mais forte a partir da linha parental, enquanto PC346Flu2 revelou o mínimo de alterações (127 transcrições). Análise de significância de Microarrays (SAM) foi utilizado para determinar a significância estatística dos genes seleccionados e, a uma taxa de detecção falsa de 5%, 392 de 487 (80%) seleccionado atingiu significância estatística. Os 100 primeiros genes diferencialmente expressos entre os resistente à terapia e as linhas celulares responsivos aos andrógenos, respectivas proporções de expressão e análise estatística são apresentados nas Tabelas 1 e 2. Uma lista completa de todos os genes regulados por sub-linha é fornecida nas Tabelas S1 a S3 . Curiosamente, uma proporção considerável (64/487) dos genes diferencialmente regulados agrupados em locais genómicos distintos nos cromossomos 4, 5, 6, 8, 11 e 18 (p 0,05; Tabela 3).
PC346C foi cultivado em meio completo com 0,1 nM R1881, enquanto que as sub-linhas refractário a hormonas foram cultivadas em carvão vegetal revestido com dextrano forma descascada (PC346DCC), suplementado com 1 uM do hidroxiflutamida antiandrogénio (PC346Flu1 e PC346Flu2). A) representação Heat-map: cores vermelhas e verdes representam aumento da regulação e para baixo-regulação, respectivamente, enquanto preta indica que não há diferença entre sublinhas e células PC234C parentais. quadrados cinzentos indicam dados em falta, quer devido aos baixos níveis de expressão, má qualidade dos dados ou ausência de sondas para o respectivo transcrito na plataforma de matriz utilizado para o estudo. B) Venn-diagrama do número de genes regulados nas diferentes sub-linhas.
via AR é regulada em PC346DCC
Para investigar do estado de activação da via de AR na PC346DCC, PC346Flu1 e PC346Flu2, a base de dados SRS foi usado para ligar e comparar os dados apresentam-se com um gene assinatura androgénio-resposta anteriormente estabelecido (Fig. 2A). Esta assinatura de androgénio-resposta foi determinada por análise da expressão de microarray, após estimulação das diferentes linhas de células de PC346 com o androgénio sintético ou R1881 a hidroxiflutamida antiandrogénio (Tabela S4). Dos 487 transcritos diferencialmente regulados nas sublinhas resistente à terapêutica, apenas 27 eram genes alvo AR ( 6%), indicando que outros genes e vias também estão envolvidos na hormonioterapia proliferação refractária destes sublinhas. Além disso, os genes alvo AR foram regulados negativamente em PC346DCC (p-valor = 10
-7), ao passo que a sua expressão em PC346Flu1 e PC346Flu2 não foi significativamente afectada (Fig. 2B). No entanto, embora não estatisticamente significativa para a via AR como um todo, PC346Flu1 e PC346Flu2 fez mostrar indução inferior de alguns genes responsivos aos andrógenos, tais como KLK2, STEAP1, STEAP2 e EHF.
genes diferencialmente expressos em hormona PC346 sublinhas -tijolos contra PC346C parental estavam ligadas a um gene assinatura andrógeno-resposta previamente estabelecida (ver secção Materiais e Métodos). (A) Representação de calor mapa de genes responsivos aos andrógenos desregulados em qualquer uma das sublinhas PC346 refractário a hormonas. O esquema de cores, tal como descrito na Fig. 1. (B) Venn-diagrama e respectivas estatísticas.
ontologia Gene e análise de caminho identifica câncer de assinatura
A assinatura 487-gene selecionado foi classificada de acordo com Gene Ontology (GO) Processos biológicos que utilizam o banco de dados para anotação, visualização e descoberta integrada (DAVID) [26], [27]. A análise mostrou enriquecimento anotação agrupamento em categorias envolvidas no desenvolvimento de órgãos, sistema reprodutor diferenciação, o crescimento celular, diferenciação e apoptose (Tabela 4). Ingenuity Pathway Analysis foi utilizado para identificar o enriquecimento em “doenças e distúrbios”, “funções moleculares e celulares”, e para procurar vias intrínseca /redes dentro dos conjuntos de genes selecionados (www.ingenuity.com). doença do cancro e sistema reprodutivo foram classificados no top 3 das “doenças e distúrbios”, que logicamente confirmados o enriquecimento de genes associados com a APC, tais como hepsina, clusterina, receptor de vitamina D, factor trevo 3, D52 proteína tumor, a própria AR e vários dos seus genes-alvo (Fig. 3A e 3B, respectivamente). Além disso, utilizamos a análise de rede para rastrear a assinatura 276-gene de PC346DCC de potenciais vias de crescimento alternativos que poderiam estar envolvidos na ignorando a sinalização AR. Curiosamente, a sinalização através do receptor de hormônio de crescimento (GHR), receptor de insulina (INSR) e do receptor do factor de crescimento epidérmico estava entre os 10 melhores Networks (escore = 20), mostrando a desregulamentação em PC346DCC (Fig. 3C).
Top 5 funções biológicas enriquecidas nas sublinhas resistentes à terapia: (a) doenças e distúrbios, (B) as funções celulares e moleculares. (C) Exemplo de análise de rede para PC346DCC mostrando desregulação da sinalização do receptor da hormona e do fator de crescimento: genes regulados positivamente são representados em genes vermelhas e reprimidos em verde. A análise foi realizada utilizando software Ingenuity Pathway Analysis (www.ingenuity.com).
análise Integrative revela genes desregulados na próstata progressão do cancro
Para identificar genes modulados em CaP que poderia explicar hormona terapia crescimento refractário através de bypass da via de AR, que ligado o assinatura 276 para o gene de PC346DCC com dados de sete estudos microarray CaP publicados anteriormente (Tabela 5) [14], [29], [30], [31 ],, 33, 34 [32] [] []. Apenas os genes presentes em bases de dados, pelo menos, 5/7 (209 genes) e desregulados em, pelo menos, 3/7 (111 genes) foram incluídos para análise posterior. agrupamento hierárquico realizada nos genes assinatura (primeira coluna), ao lado de cancro primário vs. próstata normal (segunda coluna), câncer metastático vs. câncer primário (terceira coluna) e, finalmente, hormônio-refratário vs. doença hormônio-naïve (quarta coluna ), é mostrado na Fig. 4. Cerca de 30% dos genes diferencialmente expressos em PC346DCC foram encontrados para ser consistentemente desregulada em metastático CaP em comparação com a doença confinado ao órgão.
A assinatura 276 para o gene de PC346DCC foi ligada a dados de microarray cancro da próstata sete bases de dados de primário (Lapointe, Varambally, Tomlins, Yu), metastático (Chandran, Lapointe, Varambally, Tomlins, Yu) e hormônio terapia de tumores refratários (Tamura, Tomlins e Melhor). Apenas os genes presentes em bases de dados, pelo menos, 5/7 (209 genes) e desregulados em, pelo menos, 3/7 (111 genes) foram incluídos na análise. representação calor mapa de (A) 72 overexpressed e (B) 39 genes reprimidos em PC346DCC. (C) genes desregulamentados selecionados para análise qPCR. O esquema de cores, tal como descrito na Fig. 1. quadrados cinzentos indicam dados em falta, quer devido aos baixos níveis de expressão, má qualidade dos dados ou ausência de sondas para o respectivo transcrito na plataforma de matriz utilizado para o estudo. PC-NAP: cancro da próstata menos de próstata normal adjacente; MET-PC: metástase menos próstata tumores primários; HR-HN:. Hormônio-terapia menos refratário tumores hormônio-naïve
TWIST1, DKK3 e vav3 como marcadores para o diagnóstico da doença e prognóstico
Com base nas suas funções patológicos reconhecidos e desregulação consistente em vários bancos de dados APC, torção homólogo 1 (TWIST1), foram selecionados vav fator 3 guanina troca de nucleotídeos (vav3) e Dickkopf homólogo 3 (DKK3) por seu papel potencial no desvio da via AR. Desta maneira, TWIST1 e vav3 são oncogenes putativos envolvidos na sinalização de hormona de crescimento, como revelado por Engenho Pathway Analysis (Fig. 3C). Por outro lado, DKK3 é um supressor tumoral, mostrando forte infra-regulação nos conjuntos de dados de Chandran
et al.
, Lapointe
et al.
E Varambally
et al.
(Fig. 4C). Considerando TWIST1 mostrou consistente aumento da regulação em conjuntos de dados CaP primários e metastáticos de Varambally
et al.
, Yu
et al.
, Lapointe
et al.
E Chandran
et al.
, vav3 foi regulada em tumores primários seguido de aumento da regulação na metástase (Fig. 4C).
RT-PCR quantitativa foi realizada em um conjunto independente de amostras de próstata, obtido por prostatectomia radical ou ressecção transuretral da próstata dos pacientes que estão sendo operados pelo Erasmus MC clínica. Este painel continha 21 amostras de tecido da próstata benigna e 74 adenocarcinomas em diferentes estágios da doença. análise de PCR quantitativa mostrou-regulação de TWIST1 em amostras de CaP primários e metástases em linfonodos (P = 0,0001 e 0,002, respectivamente). Não foi observada diferença entre tumores hormônio-refratário (HRPC) e da hormona-naïve (HNPC) (Fig. 5A). expressão DKK3 foi significativamente diminuída em APC e metástases em linfonodos (P-valor ≤0.0001), embora nenhuma diferença foi observada durante a progressão de a metastático ou doença hormônio-refratário (Fig. 5B) confinado ao órgão. expressão vav3 diminuiu gradualmente durante a progressão da APC, com os mais baixos níveis observados em tumores metastáticos próstata (P-valor = 0,0001 para o teste pós-linear tendência) e amostras de hormônio-refratário (P-valor = 0,005 para HNPC vs. HRPC; A Fig. 5C ). amostras de nódulos linfáticos foram removidos a partir da análise vav3 na Fig. 5C, porque vav3 foi altamente expressa no nódulo linfático normal, em comparação com tecidos prostáticos normais (dados não mostrados). Nesses ambientes, a presença de restos de tecido normal dos linfonodos pode levar à sobre-avaliação da quantidade vav3 real no linfonodo metástases. Kaplan-Meier análise mostrou uma correlação direta entre a expressão vav3 ea sobrevida livre de metástase (P-valor = 0,004 para o teste de tendência Logrank; A Fig. 5D).
amostras de tumores de próstata foram obtidas por prostatectomia radical ou ressecção transuretral da próstata de pacientes a ser operado a Erasmus MC clínica. Este painel contém 21 amostras de tecido da próstata benignas e 74 adenocarcinomas em diferentes estágios da doença. (A) TWIST1; (B) DKK3; (C) vav3 expressão em amostras de próstata; (D) vav3 análise de sobrevida livre de metástases. NAP: próstata normal adjacente; PC: cancro da próstata primário; LNmet: linfonodo metástases; PC-Met: cancro da próstata órgão-confinado não progressiva; PC + Met: tumor primário de câncer de próstata progressiva que ou teve ou desenvolvido metástase durante seguimento subsequente; HN: hormona-naïve; HR: hormônio-terapia refratário; (*) P-valor ≤0.0001 e (**) p-valor ≤0.005 utilizando o teste de Mann-Whitney de duas caudas. (***) Valor p ≤0.0001 com teste post linear-tendência.
Discussão
No presente estudo foi utilizada a análise de microarray para identificar diferenças no padrão de expressão gênica a linha de células PC346C andrógeno-sensível e suas sublinhas resistente à terapêutica: PC346DCC, PC346Flu1 e PC346Flu2. Esta análise detectou 487 transcritos diferencialmente regulados nas células refratários hormônio-terapia contra o PC346C parental. Muitos deles eram comuns a todas as sublinhas de terapia-resistente, apesar das diferentes modificações da via AR, sugerindo adaptações que favoreçam o crescimento semelhantes (Fig. 1). Estes genes compartilhados pode ser dividido em quatro categorias principais: regulação da progressão do ciclo celular e proliferação (HPN, NDN, ATR, ABL2, DHRS2 ex.), Desenvolvimento e diferenciação celular (CLEC3B, KCNJ8, ADAM29, DNMT3A), ácidos graxos e esteróides