Abstract

Não-convencional MHC classe I MIC moléculas não interagem com o TCR, mas com NKG2D, um C lectina do tipo de receptor presente na maioria activatory NK, γδ e CD8

+ ap células T. Enquanto essa interação é fundamental no desencadeamento /calibrar a atividade citotóxica destas células, a verdadeira extensão do seu

in vivo

envolvimento, no homem, na infecção, câncer ou auto-imunidade, precisa de uma avaliação mais aprofundada. Este último ganhou impulso junto com a expansão relatado de periférico CD4

+ CD28

-NKG2D

células + T na artrite reumatóide (AR). Nós primeira iniciado para estender esse relatório para uma coorte maior de não só pacientes com AR, mas também aqueles afetados pelo lúpus eritematoso sistémico (LES) e síndrome de Sjögren (SS). Em RA e SS, esta observação inicial foi ainda testado em tecidos-alvo: a articulação e as glândulas salivares, respectivamente. Em conclusão, e apesar da expansão ocasional e indiscriminada da subpopulação de células T anteriormente incriminado, nenhuma correlação pode ser observada entre o CD4

+ CD28

-NKG2D

+ e auto-imunidade. Além disso,

in situ

, a presença de NKG2D igualou a de CD8

+, mas não a de CD4

células + T. Em paralelo, uma verificação total de tecido corporal de ambos

MICA

e

MICB

transcrição mostra claramente que apesar pressupostos originais, e com a excepção de o sistema nervoso central, ambos os genes são amplamente e, portanto, transcrito possivelmente traduzido e membrana-bound. Estendendo esta análise para uma série de tumores humanos não revelou um padrão de expressão coerente versus tecidos normais. Colectivamente estes dados questionar suposições anteriores, correlacionando um tecido-específica de expressão /indução de

MIC

na relevância para processos auto-imunes ou tumorais

Citation:. Schrambach S, Ardizzone M, Leymarie V, Sibilia J, Bahram S (2007)

In Vivo

padrão de expressão de MICA e MICB e sua relevância para a auto-imunidade e câncer. PLoS ONE 2 (6): e518. doi: 10.1371 /journal.pone.0000518

Editor do Academic: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Public-Santé, Luxemburgo

Recebido: 17 Abril, 2007; Aceito: 07 de maio de 2007; Publicação: 13 de junho de 2007

Direitos de autor: © 2007 Schrambach et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Université Louis Pasteur, o Hospital Universitário de Estrasburgo, a Association Française du Gougerot Sjögren et des síndromes segundos, o Ligue contre le Cancer, a Association pour la recherche sur le Câncer (ARC).

Competindo interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

citotóxico CD8

+ e ajudante CD4

+ αβ células T reconhecem convencional carregado com péptido Complexo principal de Histocompatibilidade (. MHC) de classe I e II, respectivamente moléculas [1]. Enquanto as primeiras interacção conduz à eliminação do viralmente infectada ou as células alvo tumorized, este último, ajuda a aumentar e /regular principalmente a resposta imune humoral contra a exo ou auto-antígenos [2], [3]. Embora esta definição do livro da resposta imune adaptativa é claro, a vida real funcionais implicações /disfuncionais dessas interações, em conjugação com o segundo, inatas, atores da imunidade, está longe de ser simples. Isto é talvez melhor exemplificado em reacções auto-imunes, onde, dependendo da doença, as espécies (humana ou de ratinho, no essencial) e o modelo experimental, os diferentes componentes do sistema imune foram sequencialmente colocados para a frente, levando à conclusão lógica que praticamente todos os atores do sistema imunológico estão envolvidas, quer no desencadeamento e /ou perpetuação da doença [4] – [6].

ao contrário das moléculas MHC-I convencionais acima mencionados, as moléculas MIC [7], [8] não interagem com o TCR

per se

mas fazê-lo com NKG2D, um receptor activatory-lectina tipo C expressa em NK, γδ e CD8

+ ap células T [9], [10 ]. Esta interacção tem sido demonstrado que o excesso de montar o sinal inibidor fornecida por assassino Inibitória receptores (KIR) e /ou moléculas de CD94 /NKG2A /B, que detectam a presença de, respectivamente, HLA-ABC e -E em células alvo. Embora nas células T, funções NKG2D como uma molécula co-estimuladora [11], que pode activar as células NK assim como linfócitos T activados de IL-15-intra-epitelial de um modo independente de TCR [12]. acoplamento MIC-NKG2D acredita-se ser, por conseguinte, crítica na eliminação de células e /ou tumores [13], [14] infectadas. Se essa interação também é relevante na auto-imunidade é uma questão de ênfase mais recente [15].

A artrite reumatóide (AR) é uma doença auto-imune arquetípica e, como tal retoma nosso conhecimento e desafios presentes sobre auto-imunidade [16 ]. Um vasto corpo de trabalho tem rendido a inúmeras hipóteses sobre a iniciação e perpetuação da doença. Ao longo do tempo, as células T ou células B têm sido reconhecidos como os principais agentes da doença. O auto-antigénio específico do tecido ou sistémica putativo (s) no homem permanece elusiva, em contraste com vários modelos animais alvo naturais ou transgénico /gene onde vários antigénios próprios têm sido reconhecidos para capaz de dar início da doença [17]. Um dos últimos atores putativos em RA patogênese foi encaminhado como uma população discreta de CD4

células + T que não possuem a molécula co-estimuladora CD28 e foram relatados para ser expandido na AR [18], [19]. Investigações mais recentes relataram que as células T expressam, em vez de CD28, o NKG2D acima descrito [15]. O presente trabalho foi iniciado nesta hipótese e teve como objetivo primeiro replicar esses dados iniciais em um maior, mais bem definido, coorte de pacientes com AR. Ele foi alargado para duas outras doenças auto-imunes: o lúpus eritematoso sistémico (LES) e síndrome de Sjögren (SS). Na AR e SS pacientes afligidos foi também possível para sondar

MIC

nível de expressão em tecidos alvo, tanto no RNA mensageiro e o nível de proteína. Além disso, no sangue periférico além de medir a presença de células T CD4

+ NKG2D

+ células per se, também definido para analisar o repertório de TCR β destas células em determinados indivíduos (cf.

infra). Finalmente, e pela primeira vez, um órgão /tecido global de verificação permitido para revelar o facto de, em contraste com o que foi inicialmente assumida e, desde então, inserido livros de texto [20], e com a excepção de o sistema nervoso central,

MICA Comprar e

MICB

foram transcritas em praticamente todos os tecidos /órgãos examinados. A nova extensão desta análise para tumorized amostras ajudou a dar uma melhor compreensão do

MIC

transcrição na saúde e na doença.

Materiais e Métodos

Pacientes e controles

25 voluntários saudáveis, bem como 75 pacientes que sofrem de RA (n = 35; 1988 do Colégio americano de critérios de Reumatologia) [21], com LES (n = 15; 1997 revista do American College of critérios de Reumatologia) [22] e SS ( n = 25; 2002 americano e critérios europeus) [23] foram incluídos neste estudo (Tabela 1). Todas as amostras foram obtidas de voluntários que frequentam a clínica de Reumatologia do Estrasburgo Hospitais Universitários e foram coletadas durante procedimentos de rotina clínicos (diagnóstico /prognóstico /terapêutica) prescritos por um dos co-autores, o Dr. J. Sibilia. consentimento informado por escrito foi obtido de cada indivíduo de acordo com a Declaração de Helsínquia e legislação francesa, segundo a qual nenhuma aprovação por uma comissão de ética foi necessária neste caso. Todos os pacientes e controles não foram relacionados.

Citometria de Fluxo

A seguir, diversamente conjugado (PE, FITC, PerCP, Cy5 ou APC) anticorpos foram utilizados em três e -four- cor citometria de fluxo: anti -CD3, -CD4, -CD5, -CD8, -CD16, -CD19, -CD28, -CD45, -CD45RA, CD45RO, -CD56, -CD94, -CD158a, -CD158b, -NKG2A, – γδ TCR. O repertório de células T foi analisado pelo seguinte PE e conjugado com FITC anti-TCRV

β (1, 2, 3, 4, 5.1, 5.2, 5.3, 7.1, 7.2, 8, 9, 11, 12, 13.1, 13.2 , 13.6, 14, 16, 17, 18, 20, 21.3, 22, 23) (anticorpos Beckman Coulter). controlos do mesmo isotipo foram usadas para cada coloração. NKG2D expressão foi analisada utilizando ON72 conjugado com PE (Beckman Coulter) e 1D11 (BD PharMingen), quer conjugado com PE ou biotinilado; este último detectada por estreptavidina-PC5 (BD PharMingen). células do sangue periférico foram estudados quer não fraccionada ou após centrifugação com gradiente de densidade de Ficoll. As células mononucleares foram também isoladas por Ficoll a centrifugação em gradiente de densidade a partir de fluidos articulares obtidos a partir de 1 RA, osteoartrite 3 e 2 pacientes com artrite não auto-imunes. A citometria de fluxo foi realizada em ambos os sistemas de um BD FACSCalibur ™ (Becton Dickinson) ou FC 500 (Beckman Coulter).

A imuno-histoquímica

tecidos sinoviais foram obtidos a partir de pacientes com AR e um cotovelo 1 osteoartrite no tempo de artroplastia do joelho. tecidos das glândulas salivares foram obtidos a partir de 4 SS e um voluntário saudável durante a rinoplastia. Para imuno-histoquímica, 4 mm seções criostato foram feitos a partir de tecidos sinoviais ou glândulas salivares e congeladas em nitrogênio líquido. sucessivas secções foram fixadas em acetona, seco ao ar, re-hidratadas em PBS, e bloqueadas com 0,3% de peróxido de hidrogénio. As secções foram incubadas com anti: -NKG2D mAb 1D11 (BD PharMingen), -MIC mAb 6D4 (BD PharMingen), -CD4, -CD8 durante 1 h à temperatura ambiente. A ligação foi detectada utilizando IgG biotinilada anti-secundária e estreptavidina peroxidase. As secções foram contrastadas com hematoxilina de Harris e montadas com Glycergel.

Northern Blotting

borrões de mRNA humano foram adquiridos da Invitrogen (Invitrogen Territórios do Norte). As membranas foram hibridados sequencialmente com

MICA, β-actina

e

β

2-microglobulina (β

2m)

cDNAs, submetido posteriormente para lavagens de rigor elevadas (64 ° C , 0,1XSSC, SDS a 0,1%), antes da exposição à Kodak Xomat (Eastman Kodak, Rochester, NY) durante 8h, respectivamente, a -70 ° C, 1 h a temperatura ambiente e 4 h a -70 ° C, respectivamente.

quantitativa em tempo real PCR

Acessórios biópsias de glândulas salivares foram obtidos a partir de um conjunto independente de 20 (19 do sexo feminino e um do sexo masculino, idade média de 51, 52 mediana) dos pacientes com SS primária. glândulas salivares de 5 pacientes submetidos à cirurgia orofacial (por causas independentes) foram obtidos durante os procedimentos e serviram como controle enquanto ambos patologia, bem como o histórico do paciente eliminado ainda quaisquer sinais de auto-imunidade nestes indivíduos controle. O ARN celular total foi isolado por LS® TRIzol (Invitrogen) de acordo com as recomendações do fabricante. A qualidade do RNA extraído foi verificada por eletroforese em gel. 1 ug de ARN total foi submetido a transcrição inversa usando oligo-dT e o sistema de transcrição reversa ™ IMPROM-II (Promega), seguindo as recomendações do fabricante. PCR quantitativo em tempo real foi realizada num ABI Prism 7000 utilizando os seguintes oligonucleótidos e sondas TaqMan ®. Os níveis de expressão de

MICA

e

MICB

foram calibrados usando o da casa mantendo 18S RNA detectado usando o seguinte para a frente e primers respectivamente 3′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-5 Reverse ‘, 3’-GCTGGAATTACCGCGGCT -5 ‘e SYBR Green.

MICA

transcritos foram detectados utilizando o seguinte para a frente, e oligonucleótidos sonda TaqMan ® reversa respectivamente 3′-CAGCTGCAAACGCCTCATATC-5 ‘, 3′-TGACCTATGAAACAGAGAAAATAAAAGC-5′ e 3’-ACATTTTGCAGCCTCCAACAACAATAAATAAGTG-5 ‘e aqueles de

MICB

com F 3′-CACCCAGGCTGCAGTTCACT-5 ‘, 3′-R CGGGAGTCTGAGGTACGAGAA-5′, 3’-ACCTCTGCCTCCCAGGTTCAAGCAC-5 ‘na mesma ordem como acima. upregulation positivo de

MIC

transcrição foi verificada em células HeLa cultivadas não tratada ou choque térmico, como descrito anteriormente [24].

Resultados e Discussão

Apesar do fato de que o inicial ” falha “provocando doenças auto-imunes na artrite geral e artrite, em particular, a maioria permanece enigmática, décadas de pesquisa reuniu vários cenários plausíveis e que, no início, vários caminhos e cascatas tendem a mais ou menos perpetuar um auto-reativa (T e /ou expulsos) força de células B, acabou levando a patologia sintomático [6], [25] – [28]. Um dos mais recentes sub-populações de células T incriminados como tal, é a fracção de células CD4

+ células T auxiliares que expressam o receptor NKG2D de activação, mas desprovida da molécula co-estimuladora CD28 [15]. NKG2D, uma trans-membrana homodímero superfície de tipo II consiste de um tipo C do domínio extracelular de lectina, seguida por uma transmembranar e uma curta cauda citoplasmática desprovida de qualquer função de sinalização particular. A molécula sinaliza fato (pelo menos no homem) através da interacção com a DAP10 de trans-membrana proteína adaptadora (a DAP10 e a DAP12 na Mus dependendo da isoforma NKG2D) [29]. NKG2D reconhece uma variedade de moléculas distantemente relacionado não convencionais de MHC de classe I; no homem MIC [7] e RAET1 [30] (ULBP) [31] e no rato rae1 e H60 [9], [29]. O objectivo inicial deste trabalho era avançar o nosso conhecimento sobre o papel potencial da interação MIC-NKG2D na auto-imunidade no homem. Para que tal seja o caso, (pelo menos) devem ser preenchidas duas condições: (1) em primeiro lugar e, idealmente, os órgãos alvo para a auto-imunidade (por isso potencialmente todos os órgãos e /ou tecidos), não deve expressar MIC no estado basal, em outras palavras, MIC deve ser detectada em tecidos doentes ou estados patológicos. + células T (2) em segundo lugar que sistêmica e /ou infiltrados de tecido autoreactive CD4

expressar NKG2D e ser de fato ampliado em tal doença; um prelúdio para o seu potencial relevância funcional.

Mais uma vez e, embora a definição de livro didático de expressão MIC é o de quase-restrição a enterócitos [20], [24], a realidade está longe de ser tão bem defenido e este reducionista vista simplesmente não reflete a realidade (cf. abaixo). Na verdade, os primeiros anticorpos monoclonais produzidos contra MICA provou manchar preferencialmente, se não quase exclusivamente, enterócitos humanos, com a notável exceção do epitélio do timo [24]. Isto estava de acordo com blottings Northern iniciais destacando a transcrição do gene, e não em linhas de células transformadas () da linhagem lymphohematopoeitic, mas no os de origem epitelial /fibroblástica [7]. Por outro lado, as experiências de transferência de genes demonstraram claramente, uma e outra, que não importa a linhagem da célula receptora, se o transgene (sob um promotor heterelogous que é) é apropriadamente transcrita, a proteína MIC é invariavelmente sintetizado e atinge superfície da célula [24], [32] – [37], por conseguinte, com exclusão de qualquer “elemento de restrição (s)” celular, tais como aqueles precedentemente demonstrado ser necessário para a expressão adequada da superfície de outros não-clássica de MHC de classe I, por exemplo os genes sequência de sinal HLA clássica peptídeos derivados em caso de HLA-E /Qa-1 no homem /rato [38] ou bactérias derivadas de peptídeos N-formilados em caso de H2-M3 no rato [39]. Daí a questão crítica é em que o tecido /órgão

MICA

e

MICB Quais são, na verdade transcrita, caso em que se poderia confiantemente presumir sua consequente expressão de superfície. Tão trivial como esta questão pode parecer, quase 15 anos desde a sua identificação [7], nenhuma análise transcricional sistemática de

MIC

genes foi publicado até hoje. Aqui nós apresentamos uma primeira análise. Na verdade extensa mancha Northern de um grande número de tecidos e órgãos humanos indica claramente que, em contraste às alegações anteriores, tanto

MICA

e

MICB

são amplamente transcritas. Como visto na Figura 1 (painel superior), estes transcritos são encontrados em praticamente todos os órgãos examinados à excepção notável do sistema nervoso central (parte superior, painel da direita extrema, Figura 1). Isto correlaciona-se de facto perfeitamente com o padrão de transcrição de clássica loci MHC-I, como evidenciado por sondagem as mesmas membranas com um

β

2m

sonda de ADNc (painéis intermédios, Figura 1). Prestando mais atenção para

MIC

padrão de expressão, observa-se que mesmo um órgão “preenchido” com células lymphohematopoeitic – baço – não é desprovida de

MICA

transcrições e contém

MICB

transcrições em quantidades iguais como para outros órgãos (pulmão, rim …). Mais uma vez, a ausência de clara

MIC

do sistema nervoso central é notável e, de facto inesperada, na medida em que é paralela claramente que os genes de clássicos de CPH-I (

β

2m

painel ) e isso apesar do fato de que pelo menos as regiões promotoras imediatos desses loci (

MIC Comprar e convencional

MHC-I

) não mostraram qualquer homologia de sequência evidente [24]. Finalmente, e para cobrir os fundamentos, tanto quanto possível com relação ao

MIC

transcrição, estendemos esta transcrição de gráficos a partir saudáveis ​​para tumorized tecidos. Um número de tumores de vários tipos de tecido foram analisadas e comparadas com os tecidos adjacentes normais (Figura 2). Mais uma vez,

MIC transcrição foi amplamente presente, e nenhum padrão geral de indução /repressão pôde ser observado em tumores vs tecidos sadios (Figura 2), ao contrário precedentemente sugerido [13]. Assim, apesar de tudo,

MIC

é transcrito em praticamente todos os examinaram o tecido com a notável exceção do sistema nervoso central. O padrão geral de tumores é indicativo de um padrão de transcrição “frouxo”. A razão pela qual alguns anticorpos anti-MIC aparentemente mostrado para descrever um padrão de expressão tecido restrito deve, portanto, estar em outro lugar, por exemplo, polimorfismo genético [40], os vários padrões de glicosilação ligados a N (MICA 8 tem sítios potenciais de glicosilação N-ligada) [7], [24].

O painel representa o ARN proveniente de grandes órgãos humanos. Cada painel contém ARN de pulmão como um padrão interno. Painel superior foi hibridizada com o

MICA

cDNA. O comprimento transcrição diferencial da

MICA

e

MICB

é devido a uma documentado maior 3’UT em

MICB

mRNA [50]. O painel do meio mostra a expressão de

β

2m

, indicativo da β

2m limite convencional expressão de MHC-I. Finalmente, o

β-actina

transcrição atua como um controle de carga. Para uma explicação mais detalhada ver texto principal.

A mesma disposição como a Figura 1 aplica-se, mas desta vez as manchas contêm pistas de tumor e de controlo (tecido livre de doença ao lado).

Tendo estabelecido que

MIC

é transcrita e, portanto, potencialmente traduzido em qualquer /todos os tecidos, partimos agora para examinar a relevância da

MIC

e indiretamente a de expressão MIC-NKG2D na auto- imunidade. Para tal, foram seleccionados três doenças auto-imunes prototípicas, devido à sua relevância inerente na compreensão auto-imunidade humana [25], [41], [42], o interesse médico /clínica, bem como o facto de que no que diz respeito à AR, dados anteriores haviam assinalado MIC-CD4

+ NKG2D

+ interação na etiologia da doença /patogênese [15]

Para esta análise o seguinte coorte de indivíduos foram reunidos:. 25 controles saudáveis ​​e 75 pacientes sofrendo das doenças auto-imunes acima mencionadas, ou seja, 35 AR, LES e 15 SS 25 (Tabela 1). Entre estes um subgrupo incluindo 10 indivíduos de controle, 10 RA, 2 SS e 2 pacientes com LES foram amplamente immunophenotyped com uma vasta painel de anticorpos, em várias combinações, a fim de avaliar os padrões internos antes de esforço de grande escala (ver Materiais e Métodos para a lista completa de anticorpos). Desta forma, várias populações de células T, B e NK foram investigados. Não se observou qualquer diferença significativa entre o paciente e as populações de controlo (dados não apresentados). Mais especificamente, a distribuição de NKG2D na superfície de αβ CD8

+ e linfócitos γδ T bem como células NK, inicialmente testadas usando preparações totais de células do sangue periférico, não revelou, como esperado, qualquer diferença notável entre os pacientes e controles. Em seguida, virou-se nosso foco para a população de interesse ou seja CD4

+ NKG2D

+ T células (Figura 3). A proporção de expressão de CD4 em NKG2D

+ células T foi encontrado igualmente para ser semelhante em todos os voluntários saudáveis ​​(0,8-8,5%, média de 2,7%, o desvio padrão 2), todos RA (0,4-9,7%, média 2,1%, desvio padrão de 1,9), todas as LES (0,3-7,8%, com média de 2,4%, o desvio padrão 2) e todos os pacientes com SS (0-36,2%, significa 4%, desvio padrão de 7,6) (Figura 4). Dois pacientes com SS foram realmente encontrado a ter maior expressão NKG2D em seu CD4

+ células T (18,6% e 36,2% respectivamente) (ver abaixo para uma análise mais aprofundada) (Figuras 4 e 3.

NB

: Figura 3 representa de facto, um tal paciente). Porque um estudo precedente, que tinha encontrado significativamente maior CD4

+ NKG2D

+ células T em RA versus controlos, tinha usado outro NKG2D mAb anti-, ou seja, 1D11 (BD PharMingen) (vs. usados ​​acima mencionados ON72 clone , Beckman Coulter), também testamos este anticorpo. Comparação de coloração NKG2D tanto com anticorpos em CD4

+ células T em 3 voluntários saudáveis, 4 AR, 1 LES e 2 SS não revelou nenhuma diferença significativa (diferença média: 0,21; desvio padrão: 0,24). Além disso, nós também comparou esta imunofenotipagem comparando arterial periférica total vs. células mononucleares, usando ON72 mAb. Esta foi avaliada em 1 voluntários saudáveis, 2 RA e 2 SS sem insinuando a qualquer diferença (diferença média: 0,33; desvio padrão: 0,52). Finalmente, e para validar a configuração completamente, a estabilidade intra-individual de expressão NKG2D em linfócitos CD4 +

T foi verificada ao longo do tempo em 2 voluntários saudáveis ​​em respectivamente dias 1/14 e 1/120, por 1 paciente com AR em d1 /d120 e por 2 pacientes com SS em D1 /d150. foram observados em diferentes subpopulações de linfócitos e especialmente aqueles CD4

+ células T expressando NKG2D:;: há diferenças notáveis ​​(0,5 desvio padrão de 0,31). Tendo em conta que o mesmo relatório acima mencionado tinha insinuado para a indução da expressão NKG2D em CD4

+ T células sobre adjunção de TNF (

in vitro

), pacientes com AR sob terapia anti-TNF não foram incluídos neste estudo, apesar do fato de que uma análise preliminar dos três pacientes com AR tratados com infliximabe não mostraram qualquer diferença significativa no nível de expressão NKG2D em linfócitos CD4

+ T (dados não mostrados). Por isso tudo em todos, não fomos capazes de encontrar qualquer diferença significativa entre o CD4

+ NKGD

+ população em controles saudáveis ​​versus pacientes RA, SS ou LES. Finalmente, a Figura 5 dá uma imagem completa da

+ pool de células CD4 T com relação a NKG2D e /ou presença ou ausência de CD28.

Este exemplo, tirado de um dos dois pacientes com SS (MRS XET) abrigando um particularmente elevada proporção de CD4

+ NKG2D

+ T células (36,2%) ilustra a metodologia utilizada, a fim de enumerar estas células em todos os indivíduos (controles e pacientes) incluídos neste trabalho durante uma rotina de 50 000 eventos análise.

Esta figura ilustra a relação de CD4

+ NKG2D

+ células T dentro do total do conjunto de CD4 periférica no controle, AR, LES e indivíduos SS. A variabilidade em pacientes com SS é devido a 2 indivíduos que representam uma proporção invulgarmente elevada (ver texto principal para explicação). Nenhuma das diferenças é significativa como avaliado pelo texto de Wilcoxon: p = 0,1658 vs. controles para a RA; p = 0,9547 para controles vs. LES e p = 0,5012 para controles vs. SS.

Este valor, mais global, analisa a proporção de CD4

+ células T que abrigam ou não CD28 e /ou NKG2D, ou não. Nenhuma das diferenças é estatisticamente significativa.

O alvo final na AR sendo a articulação, que figura a seguir ao analisar o CD4

+ NKG2D

+ níveis de expressão dentro de células mononucleares em o fluido articular colhidas após Ficoll densidade de centrifugação de gradiente de um cotovelo RA e 5 controlos (três osteoartrite do joelho e dois não auto-imune artrite do joelho) pacientes. Mais uma vez não há diferença significativa na expressão de CD4 em NKG2D

+ células T foi destaque entre os controlos e RA em conjunto fluidos, e entre o sangue periférico e fluido da articulação em um paciente com AR (dados não mostrados). Para explorar ainda mais o significado da expressão de NKG2D em CD4

+ e CD8

+ T células

in situ

, tecidos sinoviais foram analisados ​​por imuno-histoquímica, a fim de quantificar a presença de CD4, NKG2D, CD8 e mica /B culas que expressam. Este foi realizada em um RA (artroplastia de quadril) e um controle de osteoartrite (cirurgia no joelho) individual. No controle individual NKG2D foi encontrado para ser expresso em 3,8% de sangue periférico CD4

+ linfócitos T vs. 2,5% daquelas encontradas no fluido articular. Como essa pessoa não realizou qualquer inflamação intra-articular ativo, não foi surpreendente não observar uma infiltração notável de CD4

+, CD8

+ +/- NKG2D

+ linfócitos (sem expressão MIC foi encontrado nem neste paciente). No paciente com AR, NKG2D foi expressa em 0,9% de CD4 circulantes

+ células T (sem líquido articular poderia ser recuperada a partir do quadril RA submetidos a cirurgia). O tecido se infiltrar na AR (Figura 6A) foi principalmente CD4

+ (Figura 6B) enquanto a expressão de CD8 era menos importante (Figura 6C). expressão NKG2D foi claramente exclusiva de CD4 e mais em linha com a de CD8 (Figura 6D) (NB .: estes são cortes de tecidos distintos, portanto não há sobreposição é significativa). Finalmente, MICA /B foi expresso em células fibroblásticas /epiteliais e não em infiltrados inflamatórios (Figura 7A e B).

(A) mancha colorida por coloração com Hematoxilina-eosina. A análise imuno-histoquímica utilizando (B) CD4 (C) CD8 e (D) anticorpos NKG2D. O infiltrado é claramente de origem linfocítica com uma maioria de células T CD4.

A análise imuno-histoquímica de (A) (B) sinovite RA e um (C) (D) SS glândula salivar acessório manchado com uma anticorpo monoclonal anti-MICA. expressão MIC é claramente de células epiteliais /natureza fibroblástica em ambos os tecidos /órgãos.

Embora nossos resultados em RA estão em desacordo com alguns dos dados publicados anteriormente, alguns esclarecimentos sobre este último pode ajudar a colocar nossos resultados e na verdade a toda questão em perspectiva. Antes de fazer tal, nós claramente não replicar o trabalho por Groh et al. no que diz respeito à expansão de CD4

+ NKG2D

+ na AR, embora fizemos o nosso melhor para manter o seu protocolo, por exemplo, usando os mesmos anticorpos anti-NKG2D etc. [15]. Pode haver explicações racionais para tal, uma falta ser de qualquer informação detalhada com respeito à sua população de pacientes, por exemplo, a fracção sob terapia anti-TNFa etc. Uma análise mais profunda da literatura de facto mostra que a expansão deste intervalo de tempo, CD4

+ CD28

– as células T, não é tão patognomônico de RA como poderia ter parecia no início [18]. Com efeito, uma análise mais recente de uma coorte independente de pacientes mostra claramente que metade dos pacientes com AR (n = 94) (de acordo com os autores aqueles desprovido de RA nodular e síndrome de sicca) não teve um aumento significativo na sua CD4 periférica

+ CD28

– pool de células T em relação aos controles (ver Figura 1 em [43] Finalmente Saez-Borderias et al trazer um novo toque para o problema, ao relatar a indução de CD4

+ NKG2D..

+ de células T em resposta a citomegalovírus humano (HCMV), o que leva a prever o facto de o anterior reportado expansões podem precisar de ser re-apreciada à luz do estado serológico de HCMV dos pacientes e controlos. Isto também abre o avenida para essa subpopulação de reconhecer, para além HCMV, outros agentes microbianos, um ponto não testado em estudos anteriores (e presente) [44].

para sondar o significado potencial de CD4

+ NKG2D

+ células T em imunopatologia da SS, imuno-histoquímica foi realizada em tecidos de glândula salivar com o objectivo de detectar CD4, NKG2D, CD8 e mica /B. Três SS tecidos das glândulas salivares foram obtidas por biópsia durante a hospitalização enquanto que um controlo de tecido da glândula salivar foi obtido a partir de um indivíduo voluntário saudáveis ​​durante a rinoplastia por razões independentes. No indivíduo controlo, a imuno-histoquímica, não revelou a presença de quaisquer números de notáveis ​​de CD4, CD8 e /ou NKG2D células de acordo com a ausência de qualquer infiltrado inflamatório que expressa; este foi igualmente o caso para a expressão MICA /B (dados não mostrados). No SS, NKG2D foi expressa em, respectivamente, 0,4, + linfócitos 0,9, 2% do sangue periférico CD4

T. A imuno-histoquímica (Figura 8A), focalizado no infiltrado inflamatório, mostrou que em todos os 3 pacientes, as células T CD4 eram mais prevalente, mais uma vez mutuamente exclusivo com CD8 coloração (Figura 8B e C). A quantidade e a repartição de expressão NKG2D parece ser comparável ao de CD8, mas não a de CD4 (Figura 8D, C e B). Além disso, a expressão MICA /B foi detectado nas células epiteliais glandulares de canais, mas não sobre os infiltrados linfóides (Figura 7C e D).

(A) mancha colorida por coloração com Hematoxilina-eosina. A análise imuno-histoquímica utilizando (B) CD4 (C) CD8 e (D) anticorpos NKG2D. O infiltrado é claramente de origem linfocítica com uma maioria de células T CD4.

Com relação à SS, dada a expressão documentada de genes MIC e proteínas em células epiteliais [24], putativo envolvimento de vírus diferentes na fisiopatologia SS [45] e a relativa facilidade de acesso ao tecido-alvo, isto é, glândulas salivares; que teve como objetivo quantificar o nível de

MIC

transcrição in saudável e SS aflitos glândulas salivares. Isto foi conseguido em tempo real, análise quantitativa de PCR de

MICA Comprar e

MICB

transcrições. Antes de fazer tal no RNA glândula, a metodologia foi validada em células HeLa; documentado para estar abrigando

transcrições MICA /MICB

em níveis significativos, quando estes são regulados por estresse celular, por exemplo, choque térmico [7], [24]. O choque térmico foi realizado como anteriormente descrito [24]. Com relação ao

MICA

houve uma indução 8x após 15 minutos e 3,5 × para

MICB

. Após 60 minutos, a indução permaneceu em 4,5 × para

MICA

e 2 × para

MICB

. parcelas qRT-PCR típicos são mostrados na Figura 9A e B. dentro dos tecidos das glândulas salivares, embora a expressão mostra uma variabilidade inter-individual clara, pode ser observada nenhuma diferença significativa entre os pacientes e controlos (Figura 10A e B).

MICA

(A) e

MICB perfil

(B) expressão como analisado por RT-qPCR. ▪ As amostras de 15 minutos após o choque térmico, as amostras ♦ 60 minutos após o choque térmico, ▴ controles não tratados.

nível de expressão relativa de

MICA

(A) e

MICB

(B) em pacientes com síndrome de Sjögren, em comparação com controles saudáveis. As diferenças entre pacientes e controles não são significativas como avaliado por Mann-Whitney

teste U

(α = 0,27 para

MICA Comprar e α = 0,53 para

MICB

).

Como mencionado acima, entre todos os 75 pacientes analisados, dois pacientes com SS (Sra XET e XRL; nesta ordem neste parágrafo), de fato, apresentar uma taxa particularmente elevada de CD4

+ NKG2D linfócitos

+ T no sangue periférico (respectivamente 36,2% e 18,6%).