evidências

Abstract

Acumulando clínica sugeriu a exigência de novos estratificação dos pacientes no mesmo estágio do tumor de acordo com molecular factores. Nós avaliamos a combinação de estágio do câncer e do estado de metilação do DNA como um indicador do risco de recorrência e mortalidade entre os pacientes com câncer colorretal (CRC). Um estudo de coorte de 215 pacientes com CRC (idade média 64,32 anos; 50,5% dos homens) de Tri-Service General Hospital, em Taiwan examinaram a associação entre palco e risco de CRC recorrência e mortalidade por câncer. Um modelo de riscos proporcionais de Cox foi utilizado para analisar o estado do paciente metilação e informação clínica no início do estudo, e suas associações com CRC recorrência e mortalidade durante o seguimento. Os pacientes em estágio avançado com

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metilação foram associados com maior risco de recorrência CRC comparados com os pacientes em estágio locais com status unmethylation em tecidos tumorais , com razões ajustadas de risco (HR) (95% intervalo de confiança [IC]) de 9,64 (2,92-31,81), 8,29 (3.40-20.22) e 11,83 (3,49-40,12), respectivamente. Ao analisar os tecidos normais, observou-se risco semelhante de CRC recorrência com RHs ajustado (IC 95%) de 10,85 (4,06-28,96), 9,04 (3,79-21,54) e 12,61 (4,90-32,44), respectivamente. Para análises combinadas, o risco de recidiva nos pacientes em estado avançado com a metilação do DNA em ambos os tecidos normal e de tumor, em comparação com a fase local com unmethylation, foi aumentado com HR ajustado (IC 95%) de 9,37 (3,36-26,09). Nos doentes em estágios avançados, estado de metilação e subtipo tecido foram associados com risco aumentado de 5-anos recorrência CRC cumulativa (

P

0,001). Este estudo demonstra que o estatuto de DNA agrupamento metilação de acordo com o estágio do câncer e subtipo tecido é fundamental para a avaliação do risco de recorrência em pacientes com CCR e também indicou um mecanismo subjacente

Citation:. Kuan JC, Wu CC, Sun CA , Chu CM, Lin FG, Hsu CH, et ai. (2015) de metilação do DNA Combinações em Adjacente tecido do cólon normal prever recorrência do câncer: Evidências de um estudo de coorte clínica. PLoS ONE 10 (3): e0123396. doi: 10.1371 /journal.pone.0123396

Editor do Academic: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPÃO

Recebido: 07 de outubro de 2014; Aceito: 18 de fevereiro de 2015; Publicação: 27 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Kuan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de Dados: Os dados foram depositado em Dryad: doi:. 10,5061 /dryad.pg126

Financiamento: Este estudo foi apoiado por bolsas de investigação do Conselho Nacional de Ciência, República da China (NSC 98-2314-B016-001, NSC 99-2314 -B016-020, NSC 100-2314-B016-025, e NSC 101-2314-B-016-029). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é um dos cânceres mais comuns, com mais de 140.000 novos casos e 50.830 mortes estimadas para ter ocorrido nos Estados Unidos em 2013 [1]. Embora as taxas de incidência e mortalidade do CRC diminuíram consideravelmente nos últimos anos por causa de melhorias substanciais nas estratégias de rastreio e tratamento, o prognóstico de pacientes com CCR após a ressecção cirúrgica continua pobre [2].

As actuais orientações para a avaliação do prognóstico de pacientes com CCR enfatizar a classificação dos elementos individuais do tumor-nódulo-metástase [3]. No entanto, evidências acumuladas sugeriu a exigência de novos estratificação de pacientes no mesmo estágio do tumor de acordo com factores moleculares [4]. Além disso, os factores moleculares, que incluem biomarcadores de vários tipos de câncer, pode ter valor clínico potencial em predizer o desenvolvimento ea progressão do câncer, e predizer o prognóstico de pacientes com câncer [5,6].

CRC é reconhecida como uma consequência da acumulação de mutações genéticas () genéticos e alterações epigenéticas (metilação do DNA aberrante) que transformar células epiteliais do cólon em células de adenocarcinoma de cólon [7]. modificação epigenética, que envolve as modificações de ADN e histonas, desempenha um papel crítico nas vias de carcinogénese em vários cancros. Estudos anteriores têm demonstrado que a modificação epigenética aberrante mais frequente no cancro, a metilação do DNA, reduz a eficácia da transcrição do ARN de genes supressores de tumor [8,9]. O estudo recente concluiu que vários metila�es promotor do gene resultar no silenciamento transcricional, e pode ser explorada como biomarcadores para a detecção precoce de CRC [10]. A progressão tumoral em CRC é causado pela perda de função na regulação do ciclo celular e a reparação de DNA sem correspondência (MMR), que está relacionada com a metilação de ADN do local de início da transcrição [11]. Estudos anteriores identificaram os genes-DNA metilação relacionadas associadas com as vias de carcinogênese usando silenciamento de genes [12,13]. No entanto, estes estudos não analisou o status de metilação do DNA e estágio clínico para o acompanhamento de pacientes com CCR.

O objetivo deste estudo foi avaliar a combinação de estágio do câncer e estado de metilação do DNA como um indicador de o risco de recorrência e mortalidade entre os pacientes com CCR. Também foi investigada a associação entre os fatores de risco para e prognóstico da CRC, após a estratificação de acordo com os subtipos de tecido do cólon.

Materiais e Métodos

As características dos pacientes

De acordo com a escrita procedimentos operacionais, Boas Práticas Clínicas (BPC) e as exigências regulatórias aplicáveis, esta aplicação foi aprovado pelo Tri-Service general Hospital Institutional Review Board (IRB) (TSGHIRB número de aprovação: 098-05-292). A placa foi organizada sob, e opera por Conferência Internacional de Harmonização (ICH) /OMS GCP e as leis e regulamentos aplicáveis. Todos os pacientes assinaram carta de consentimento informado e foram clinicamente diagnosticados com CRC teve que ser capaz de tolerar ressecção cirúrgica. as características do paciente (sexo, idade no momento da cirurgia, palco, recorrência e mortalidade) foram obtidos a partir de suas histórias médicas. Pares de espécimes foram coletados a partir dos 215 pacientes de CRC (430 amostras) que preencheram os critérios de inclusão. coleta de amostras foi realizada em clínicas cirúrgicas, no qual tumor e tecidos normais foram ressecados simultaneamente. As amostras de tecidos normais adjacentes foram coletados a partir de uma incisão 10 cm de distância dos locais de carcinoma. Todos os espécimes foram imediatamente armazenadas em azoto líquido. O procedimento de ressecção foi avaliada pelo Departamento de Cirurgia Colorretal, Tri-Service Hospital Geral.

isolamento de ADN e tratamento bissulfito de sódio

DNA genômico foi extraído de amostras de tecido usando um Ácido Nucleico MagCore Automated Extractor (RBC Bioscience, Taipei, Taiwan) e um Kit Tissue DNA genômico de acordo com o protocolo do fabricante. O ADN resultante foi de bissulfito de sódio-modificado usando um Kit de metilação de ADN EZ (Zymo Research, laranja, EUA). Um controle de ADN metilado para ensaios de reacção em cadeia da polimerase-metilação específica (MS-PCR) foi gerado usando SSSI metilase (Zymo Research, laranja, EUA).

metilação específicas de PCR ensaio

3 seleccionado genes supressores de tumor (

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) estão relacionados com risco de CRC que envolveu nas vias associados aos estágios de câncer e prognóstico, incluindo MMR e o ciclo celular [14]. Condições de DAN bisulfite-tratamento e ensaio de PCR específicos de metilação foram fornecidos em Métodos S1, e controle de qualidade do ensaio foi fornecer em S1 Fig.

A análise estatística

características iniciais do paciente, incluindo o sexo , a idade no momento da cirurgia (contínua), fase (I, II, III e IV), a recorrência, status de mortalidade e estado de metilação da região promotora do gene nos genes candidatos (

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), foram comparados. Para avaliar as possíveis interações entre a metilação do DNA e estágio clínico e risco de CRC recorrência e mortalidade, os pacientes de diferentes estágios do câncer foram avaliadas separadamente e também dividido em 2 subgrupos (locais e avançados). Os tecidos tumorais foram comparados com os tecidos normais adjacentes. Vários fatores podem ter contribuído para as diferenças entre nossos resultados e os de outros estudos. ajuste de fatores de confusão é detalhado em Métodos S1. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando software SPSS (IBM SPSS Statistics 21; Ásia Analytics Taiwan Ltd., Taipei, Taiwan). Todos os testes estatísticos foram 2 faces com um nível α de 0,05.

Resultados

A média de idade (± SD) dos pacientes do estudo foi 64,32 (± 14,48) anos, e os homens constituíram 50,5 % da amostra do estudo. No geral, a duração média (± DP) de acompanhamento foi de 24,94 (± 17,90) meses. Durante os 5.363 pessoas-meses de seguimento, foram identificados 85 casos de CRC recorrência e 43 mortes, com uma densidade de incidência de 15,85 e 8,02 por 1000 pessoas-mês, respectivamente. A associação entre o estadiamento clínico e risco de CRC recorrência e mortalidade é fornecer nos resultados S1.

A Tabela 1 apresenta as características basais dos pacientes de acordo com o seu estado de metilação do DNA. Ao analisar os tecidos normais, observamos que os pacientes com maior estado de metilação dos genes supressores de tumor foram significativamente associados com uma maior proporção de CRC recorrência do que os pacientes com menor estado de metilação foram (55,3% vs. 37,7%,

p

= 0,012). Esta associação foi limítrofe significativa em tecidos tumorais (84,7% vs. 73,1%,

p

= 0,065). Examinamos ainda mais a associação entre palco e risco de recorrência do câncer de CRC, estratificando pelo estado de metilação do gene alvo nos subtipos de tecido depois de ajustado para sexo, idade no momento da cirurgia e quimioterapia adjuvante (Tabela 2). Ao analisar tecidos tumorais, observamos que os pacientes em estágio avançado com

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metilação foram associados com maior risco de CRC recorrência em comparação com o local, pacientes em estágio com status unmethylation, com RHs ajustado (IC 95%) de 9,64 (2,92-31,81), 8,29 (3,40-20,22) e 11,83 (3,49-40,12), respectivamente. Ao analisar os tecidos normais, observou-se risco semelhante de CRC recidiva nos pacientes em estágio avançado com

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,

hMLH1

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metilação em comparação com os pacientes em estágio locais com estatuto unmethylation, com RHs ajustadas (IC 95%) de 10,85 (4,06-28,96), 9,04 (3,79-21,54) e 12,61 (4,90-32,44), respectivamente. Além disso, uma análise de Kaplan-Meier com o teste log-rank mostrou a importância da associação entre o estágio do câncer e do estado de metilação do DNA em tecidos normais adjacentes, e os 5 anos de recorrência cumulativa de CRC (

p Art 0,001 ; Figura 1); um modelo de regressão Cox confirmou o risco consistente após ajustado potenciais fatores de confusão, tais como sexo, idade, localização do tumor, a quimioterapia adjuvante, e estágio clínico (

p Art 0,001)

O cumulativo. taxas de recorrência foram significativamente diferentes nos 4 subgrupos durante os 5 anos de follow-up após ajustado para sexo, idade no momento da cirurgia, localização do tumor, a quimioterapia adjuvante, e estágio clínico.

Como se mostra na Tabela 3, que subsequentemente analisados ​​estado de metilação de ADN e CRC recidiva nos pacientes do estudo, a estratificação de acordo com a fase do cancro (local e avançado) e subtipo tecido (normal e de tumor). Observou-se que o risco de CRC recorrência foi significativamente associada com o estado de metilação nos pacientes dos vários estágios do câncer, e nos subtipos de tecido 2, após o ajuste para sexo e idade no momento da cirurgia (

p Art 0,001) . Os pacientes em estágio locais foram não significativamente associado ao aumento do risco de recorrência CRC, independentemente do estado de metilação e subtipo de tecidos. Nos pacientes em estágio avançado, estado de metilação e subtipo de tecido foram associados com risco aumentado de CRC recorrência.

Discussão

Os nossos resultados indicam que a metilação do DNA de certos genes e estádio clínico foram associada com o risco de recorrência de CRC nos pacientes do estudo. Observou-se que o estado de metilação do DNA nos 3 genes-alvo e estágio do câncer foram significativamente associados com CRC recorrência em tumores e tecidos normais. Quando agrupados os status de metilação de genes de acordo com o estágio do câncer e subtipo tecido, observou-se novos aumentos no risco de recorrência CRC. Estes resultados sugerem que o estágio do câncer clínico e do estado de metilação do DNA poderiam ser avaliados como preditores do risco de CRC recorrência.

Estudos anteriores observaram semelhante uma associação entre curta sobrevida livre de recorrência e metilação do DNA em pacientes CRC [15 -17]. Zitt et al compararam vários testes de triagem para CRC, e relatou que a metilação do DNA fornece um indicador clinicamente útil para a detecção precoce de progressão da doença em pacientes com CRC, o que poderia melhorar a sobrevivência ea qualidade de vida [15] paciente. Kim et al relataram que a metilação do ADN de vários promotores poderia proporcionar um biomarcador para a detecção precoce de CRC, e que os padrões de metilação do DNA também podem ser utilizados como indicadores de CRC metastático ou agressivo [16]. Os dados a partir de um estudo clínico de seguimento revelou que a metilação de genes específicos está associada com a sobrevivência pobre em pacientes de CRC avançada [17]. Um grande estudo de seguimento em 61 494 pacientes asiáticos e caucasianos com CRC indicou que as taxas de sobrevivência foram significativamente maiores nos pacientes do Filipino e etnia chinesa que em outros pacientes [18]. No entanto, os nossos resultados a partir de uma população chinesa foram consistentes com os dos estudos descritos e o estudo teve resultados semelhantes com o Cancer Genome Atlas [19].

aberrações na metilação de macromoléculas, em particular de ADN, bem como interrupção na síntese e reparo do DNA, são considerados a desempenhar papéis importantes na carcinogênese [20]. A metilação do DNA é a mudança epigenética mais extensivamente investigada [21], e pode proporcionar uma nova geração de cancros. Epigenetic modificações, particularmente de metilação de ADN em promotores de genes seleccionados, são comuns alterações de nível molecular em tumores humanos [16]. Neste estudo, observou-se que a metilação de certos genes foi associada com aumento significativo do risco de recidiva de CRC. Brock et al identificou a metilação do

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nos gânglios linfáticos tumorais e do mediastino, estimando as odds ratio (OR) para CRC recorrência de 8,00 (IC 95%, 2,50-25,51) e 4,32 (IC de 95%, 1,61-185,02), respectivamente. Quando avaliada a metilação global nos gânglios linfáticos tumorais e do mediastino, o OR para CRC recorrência foi de 15,5 (1,61-185,02) [22]. Nossos resultados igualmente demonstrou aumento do risco de recorrência CRC quando estratificar o status de metilação do DNA de acordo com o estágio do câncer clínica e subtipo de tecidos.

Os genes avaliados neste estudo,

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, estão envolvidos na regulação do ciclo celular e DNA MMR. Aberrante metilação do promotor dos genes supressores de tumores pode conduzir a expressão transcricional regulada negativamente e a expressão da proteína em células epiteliais [23]. MMR e controlo do ciclo celular, tanto desempenham papéis cruciais na eliminação de repetições mononucleotídicos, e perda do sistema de reparação é um dos principais mecanismos envolvidos na acumulação de funcional de mudança de efeitos oncogénicos, incluindo o desenvolvimento de CRC [24]. alterações de metilação do DNA explicar a heterogeneidade histológica e diversidade clínico-patológico de cancros humanos. A sobre-expressão de DNA metiltransferase 1 não é um resultado secundário de um aumento da actividade proliferativa de células, mas está significativamente correlacionada com a hipermetilação do ADN acumulada nas ilhas de CpG de genes relacionadas com tumores [25]. A associação entre a metilação do DNA e do estádio do cancro pode ser dependente da interleucina 6, um marcador de inflamação crónica que aumenta a hipermetilação do gene supressor de tumores

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famílias, mas reduz a metilação do receptor do factor de crescimento epidérmico [26]. A inflamação crónica é considerada como sendo causada por danos citosina mediada por inflamação, e os produtos de tais danos pode proporcionar uma ligação mecânica entre a inflamação e cancro [27], e promover a metilação aberrante em cancros humanos. mediadores de resposta inflamatória, tais como as citoquinas, os radicais livres, e factores de crescimento, induzir alterações epigenética em genes supressores de tumores. Observações de tais mudanças reforçaram ainda mais a associação entre inflamação e câncer [28].

Portanto, o risco de pobres aumenta prognóstico nos estágios clínicos avançados de câncer quando os pacientes são diagnosticados primeiro, mesmo após a ressecção cirúrgica. Nossos resultados foram consistentes com os de estudos relacionados associando metástases linfáticas e distantes com mau prognóstico [29,30]. Os estágios avançados de CRC são associados com maior risco de mau prognóstico em comparação com o CRC fase local. Além disso, uma avaliação clínica do cancro do pulmão indicaram que quando as estratégias estão no local para acelerar a análise de pessoas com suspeita de câncer, a doença geralmente se desloca em direção a um aumento palco e taxas de ressecção anterior [31]. Estudos anteriores identificaram que aberrante hipermetilação do promotor de genes relacionados ao câncer pode ser potencialmente úteis como marcadores epigenéticos para predizer os resultados do tratamento do câncer [32,33]. No outro estudo de 22 cancro de pulmão de células não pequenas (NSCLC) pacientes por Esteller et al., 68% dos pacientes que apresentavam hipermetilação no ADN do tumor também demonstrada em ADN no soro entre as fases, as quais ocorreram com todas as fases de I a III [ ,,,0],33]. Dois estudos mostraram que a metilação do DNA aberrante estão associados com prognóstico do câncer, mesmo em diferentes estágios clínicos. Outro estudo demonstrou a metilação do promotor do gene está associada com recorrência precoce da fase I NSCLC [22]. Além disso, as proporções de metilação inferior foram principalmente em tecidos normais do que em tecidos de tumor da Tabela 1, mas os riscos de recorrência foram semelhantes nestes dois tipos de tecidos. Os resultados indicam que uma vez que a metilação do ADN foi detectada em pacientes avançada, o risco de recorrência seria aumentado drasticamente. estudo anterior demonstrou o mecanismo deste aumento do risco a partir das alterações de nível molecular. Sato et al. A metilação do DNA têm relatado de tecidos não-cancerosas obtidos a partir de doentes com adenocarcinomas do pulmão foi em fases pré-cancerosas com metilação de ADN aberrante ao longo de vários genes [34]. alterações de metilação do DNA em fases pré-cancerosas são fortalecidos em tecidos normais durante a progressão para adenocarcinoma de pulmão desenvolvida. Que é composto com os nossos achados que as alterações moleculares podem não ser encontrados por exame patológico, mas as alterações de metilação do DNA ter ocorrido em tecidos normais adjacentes das lesões. Por conseguinte, as alterações da metilação do DNA em tecidos normais levar a um mau prognóstico do que em tecidos de cancro. estado de metilação do gene em uma coorte de validação independente foi conduzida com significativamente maior razão de chances de recorrência entre os pacientes casos, geralmente aumentou com diferentes locais de detecção metilado, como tumor, gânglios regionais, nós mediastino e tumor e gânglios do mediastino. Investigações adicionais de informação clínica do paciente, tais como dados bioquímicos do sangue ou histórico de medicação, com estratificação para identificar grupos de alto risco de recorrência CRC, são necessários.

Os pontos fortes e limitações da nossa discussão estudo mandado. Neste estudo, foram avaliados dados de acompanhamento sobre a metilação do DNA e estágio do câncer como indicadores de risco de recorrência CRC acordo com o subtipo de tecidos. Realizamos nossas avaliações, utilizando biomarcadores moleculares e informação clínica. Nossos resultados poderiam fornecer médicos com uma referência clínica para o prognóstico da CRC pacientes pós-cirurgia. No entanto, é concebível que a maior tempo de seguimento podem ter maiores diferenças neste estudo. No entanto, estudos anteriores mostraram a curto médio de follow-up após o tratamento cirúrgico entre os pacientes com CCR, com menos de 2 anos de follow-up períodos, que são relatados diferenças significativas na incidência de recidiva [35,36]. Em segundo lugar, não avaliamos as respostas inflamatórias ou biomarcadores relacionados com a inflamação nos pacientes com CCR. Kanai et al. identificou que a inflamação crônica pode afetar o prognóstico de pacientes CRC [25]. Não nos foi possível avaliar essa associação. Embora, MSP semi-quantitativo foi utilizado neste estudo, a MPS quantitativos, tais como, piro-sequenciação deve ser realizada para um estudo mais aprofundado. Além disso, a expressão de genes não avaliou neste estudo devido aos tecidos congelados armazenados no banco de tumores, o nível total de ARN nas amostras eram insuficientes para a experiência de expressão do gene. Replicação não foi realizada neste estudo.

Em conclusão, este estudo demonstra que o agrupamento de estado de metilação do DNA de acordo com o estágio do câncer e subtipo tecido é fundamental para a avaliação do risco de recorrência em pacientes com CCR. Os resultados do estudo também indicaram um mecanismo subjacente para o aumento do risco de recorrência em pacientes com CCR, especialmente nos tecidos não tumorais.

Informações de Apoio

Métodos S1. metilação específicas de condições de PCR.

ADN tratado com bissulfito foi submetido a um MS-PCR utilizando pares de iniciadores concebidos para amplificar especificamente os genes-alvo. A solução de reacção (15 ul) continha HotStart Taq Pré-mistura (7,5 mL) (RBC Bioscience, Taipei, Taiwan), ADN tratado com bissulfito (0,6 mL), e 0,6-uL alíquotas de iniciadores directos e inversos. As sequências dos iniciadores para

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foram previamente descritos [14]. A reação em cadeia da polimerase (PCR) condições de ciclismo para o metilado e não metilado iniciadores envolvidos desnaturação a 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 35 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos, emparelhamento a 62 ° C, 60 ° C, e 53 ° C durante 35 segundos, e 72 ° C durante 30 segundos, e uma extensão final a 72 ° C durante 4 minutos. Os produtos de PCR foram misturados com um corante de ADN (Bioman, Taipei, Taiwan), submetido a electroforese em gel horizontal em gel de agarose a 2% durante 25 minutos, e corados com brometo de etídio durante 10 minutos. Os resultados foram analisados ​​sob luz ultravioleta (UV) transiluminação que foi mostrado na Fig S1. Métodos estatísticos. Neste estudo, os pacientes foram classificados de acordo com a metilação de 3 genes alvo. As medidas de desfecho primárias foram CRC recorrência e mortalidade. As pessoas-anos de follow-up foram utilizados para calcular as taxas de recorrência e mortalidade CRC, a partir da data da ressecção cirúrgica e continuando até a data do diagnóstico da CRC recorrência, a data da morte, ou 31 de dezembro de 2012. A Kaplan Meier e um modelo de riscos proporcionais de Cox foram utilizados para analisar o estado do paciente metilação e informação clínica no início do estudo, e suas associações com CRC recorrência ou mortalidade durante o seguimento, após ajuste para potenciais co-variáveis ​​de confusão. As proporções ajustadas de risco (HR) e intervalos de confiança de 95% (IC) foram calculados para avaliar o estado de metilação como preditor de risco de CRC recorrência. Os potenciais variáveis ​​de confusão no modelo foram: sexo, idade na cirurgia (tratado como uma variável contínua), localização do tumor e quimioterapia adjuvante. Os RHs ajustados foram calculados para cada categoria. As associações entre o estado de metilação do DNA e risco de CRC recorrência e mortalidade foram ainda avaliados utilizando análises estratificadas de acordo com o estágio do câncer clínico inicial (I-IV). Para testar uma tendência linear em toda a estágios do câncer e status de metilação clínica em subtipos de tecidos, a taxa de incidência de CRC recorrência em cada categoria foi usado como uma variável contínua num modelo multivariável

doi:. 10.1371 /journal.pone.0123396 .s001

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S1 Fig. gel de agarose foi representado o estado

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gene metilado ou não metilado de pacientes CRC

T:. tecido tumoral; N: tecido normal; MR: marcador de referência de tamanho do produto de PCR; L: unmethylation; H: metilação. Para a qualidade de PCR específicos de metilação, controlos experimentais foram apresentados por WBC de pessoas saudáveis, e duas linhas de células de adenocarcinoma colorrectal humano (HT29 e DLD1). Água era para controle negativo para este experimento

doi:. 10.1371 /journal.pone.0123396.s002

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Resultados S1. Nossos resultados das associações entre os vários estágios do câncer e CRC recorrência e mortalidade foram observados um aumento gradual significativa no CRC recorrência e mortalidade entre a fase I-IV pacientes (

p Art 0,001).

A fase III e IV os pacientes foram associados com risco significativamente maior de CRC recorrência em comparação com a fase de pacientes I, com HR ajustado (IC 95%) de 19,37 (2,59-145,05) e 56,36 (7,42-428,09), respectivamente. Os pacientes estágio IV foram associados com risco significativamente maior de mortalidade, em comparação com pacientes a fase I, com uma HR ajustado (IC 95%) de 5,76 (1,99-16,61). Foram incluídos no estágio I e II pacientes no subgrupo fase local, eo estágio III e IV pacientes no subgrupo estágio avançado. Os pacientes do subgrupo estágio avançado foram associados com maior risco de CRC recorrência e mortalidade em comparação com os pacientes no subgrupo estágio locais, com RHs ajustado (IC 95%) de 6,73 (3,56-12,71) e 1,75 (0,94-3,28), respectivamente

doi:. 10.1371 /journal.pone.0123396.s003

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