Abstract

Purpose

A expressão de desmogleínas (DSGs), que são conhecidos por ser crucial para estabelecer e manter a adesão célula-célula necessária para a integridade do tecido, tem sido bem caracterizado a epiderme e folículo capilar; No entanto, a sua expressão em outros tecidos epiteliais tais como a próstata é mal compreendida. Embora a regulação negativa de caderinas clássicas, tais como E-caderina, tem sido descrito em amostras de tecido de cancro da próstata, a expressão de desmogleínas só foi previamente relatada em linhas celulares de cancro da próstata. Neste estudo, caracterizado desmogleínas expressão em tecidos da próstata normais, e investigou também se Desmogleína 2 (DSG2) expressão especificamente pode servir como um potencial fator de prognóstico clínico para pacientes diagnosticados com câncer de próstata primário.

Experimental Design by

Nós utilizamos a imunofluorescência para examinar expressão DSG2 na próstata normal (

n

= 50) e em uma coorte clinicamente bem caracterizada de pacientes com câncer de próstata (

n

= 414). Correlação de expressão DSG2 com características clínico-patológicas e recidiva bioquímica foi analisada para avaliar o seu significado clínico.

Resultados

Estes estudos revelaram que DSG2 e DSG4 foram especificamente expressos em células luminais da próstata, enquanto basal células não têm a sua expressão. Em contraste, Dsg1 e Dsg3 não foram expressas em epitélio normal da próstata. Outras análises de expressão DSG2 no cancro da próstata revelou que níveis reduzidos deste biomarcador foram um marcador independente significativa do prognóstico clínico.

Conclusão

Aqui nós relatamos pela primeira vez que uma baixa expressão DSG2 fenótipo é um biomarcador de prognóstico útil de agressividade do tumor e pode servir como uma ajuda na identificação de pacientes com câncer de próstata clinicamente significativo

Citation:. Barber AG, Castillo-Martin M, Bonal DM, Rybicki BA, Christiano AM, Cordon -Cardo C (2014) Caracterização de Desmogleína Expressão na normal da próstata Gland. Desmogleína 2 é um fator prognóstico independente para o câncer de próstata agressivo. PLoS ONE 9 (6): e98786. doi: 10.1371 /journal.pone.0098786

editor: Craig N. Robson, Instituto Norte para Pesquisa do Câncer, Reino Unido

Recebido: 17 de fevereiro de 2014; Aceito: 07 de maio de 2014; Publicação: 04 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Barber et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo National Institutes of Health concede P01-CA087497 (CCC e MCM) e R01-ES11126 (BAR). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

desmososmas são um tipo de ancoragem da junção célula-célula encontrada em tecidos que sofrem um elevado grau de esforço mecânico, e perda de adesão desmossomal está associada com doenças que afectam a pele, cabelo, e coração [1] – [ ,,,0],13]. No desmossoma, a família de proteínas caderina é representada pelos chamados caderinas “não clássicos”, que incluem desmogleínas (DSG) e 1-4 (DSC desmocollins 1-3) [14]. Desmogleínas e desmocollins desempenham um duplo papel na formação de desmossomos. No espaço extracelular, e desmogleínas desmocollins em células opostas interagem de forma heterofílica dependente de cálcio através dos seus domínios repetidos caderina. Intracelularmente, as caderinas se ligam a placoglobina e plakophilin, que por sua vez se ligam a desmoplaquina. Desmoplakin seguida, liga-se a filamentos intermédios, garantindo, assim, a estrutura inteira do citoesqueleto [15], [16]. Enquanto claramente importante na manutenção da integridade dos tecidos adultos, o papel de caderinas desmossômicas na progressão do cancro é menos bem compreendido. A perda de heterozigotia perto da região cromossómica que contém o aglomerado de genes da caderina desmossomal tem sido relatada em cancro do esófago, bem como cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas [17], [18]. Alterações na expressão de desmogleínas têm sido relatados para uma variedade de cancros. expressão reduzida de DSG2 tem sido relatada em carcinomas gástricos e pancreáticos [19] – [21]. Por outro lado, a superexpressão de DSG2 e Dsg3 tem sido relatada em carcinomas de células escamosas da pele, bem como câncer de cabeça e pescoço, respectivamente [22], [23].

A expressão de caderinas desmossômicas foi completamente caracterizado a epiderme, folículo de cabelo e tecido arachnoidal. Enquanto a expressão de DSG2 é conhecido por ser ubíqua em todos os tecidos formando-desmosome, a expressão das restantes caderinas desmossômicas exteriores da epiderme e folículo de cabelo é mal compreendida [24]. Um estudo realizado por Whittock e Bower em 2003 utilizada RT-PCR para analisar a expressão de

DSG4

num painel de tecidos e descobriu que

DSG4

poderia ser detectado em vários tecidos incluindo a próstata, o que sugere que o perfil da próstata expressão desmogleínas pode estender-se para além da expressão ubíqua de DSG2 [25]. A infra-regulação ou a perda de proteínas de adesão célula-célula – como a caderina clássica, E-caderina – é uma característica comum de uma variedade de cancros, incluindo o cancro da próstata, e podem ser causados ​​por uma variedade de mecanismos diferentes [26], [ ,,,0],27]. Por outro lado, embora a expressão aberrante de desmogleínas foi avaliado em vários tipos de cancro, a expressão destes caderinas no cancro da próstata tem sido apenas relatado em linhas de células até à data [28] – [30]. No presente estudo, caracterizamos pela primeira vez a expressão de desmogleínas em amostras de tecidos normais da próstata humana e determinar o tipo específico de célula em que prostrar desmogleínas específicos são expressos. Nós, então, analisar a expressão de DSG2 em uma coorte bem caracterizada paciente com câncer de próstata, e examinar a associação entre a expressão DSG2 e evolução clínica dos pacientes. Os nossos resultados revelam que DSG2 e DSG4 são especificamente expressos nas células luminais de próstata humana normal, ao passo que Dsg1 e Dsg3 não são expressos no epitélio da próstata. Além disso, a expressão reduzida de DSG2 foi encontrado para ser associados de forma independente com uma recorrência bioquímica mais curto, destacando a utilidade potencial de expressão DSG2 como um biomarcador de prognóstico da agressividade do câncer de próstata.

Materiais e Métodos

Ética declaração

lâminas humanos normais congeladas de tecido da próstata correspondentes a prostática zona de transição com confirmação histológica áreas de glândulas normais de pacientes que foram submetidos a uma prostatectomia radical foram obtidas anonimamente do Columbia Tumor Serviço de Banco de acordo com o Conselho de Columbia Institutional Review Protocolo University # AAAB2447. O TMAs utilizada neste estudo foram construídos em laboratório Cordon-Cardo, e foram gerados a partir de 414 casos de prostatectomia radical, originalmente coletadas entre setembro de 2000 e janeiro de 2005, o Henry Ford Health System, em Detroit, na sequência de um Conselho de Revisão Institucional aprovado o protocolo nº 1018 [31]. Cada participante completou uma breve entrevista por telefone (demografia e história da saúde), um questionário de freqüência alimentar, e uma entrevista cara-a-face em relação aos riscos relacionados com o trabalho. Além disso, todos os participantes fornecida uma amostra de sangue para análises genéticas e para o teste de PSA. Inscrição fechado em primavera de 2005, e do IRB permanece aberto para PSA follow-up (contato não-paciente) para sujeitos do estudo.

Cultura de Células e RNA Isolation

O epiteliais benigna da próstata BPH- linha 1 celular (uma oferta generosa do Dr. Ralph Buttyan, e comercialmente disponível através da Colecção alemã de Microrganismos e culturas Celulares; DSMZ, Braunschweig, Alemanha) foi cultivada em RPMI com soro fetal bovino a 10% (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Três linhas metastático de células humanas de câncer de próstata foram utilizados neste estudo: DU145, PC3 e LNCaP. A linha celular DU145 (ATCC, Manassas, VA) foram cultivadas em MEM com FBS a 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA). A linha celular PC3 (ATCC, Manassas, VA) foi cultivada em F12K com 10% de FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA). A linhagem de células LNCaP (ATCC, Manassas, VA) foi cultivado em RPMI com FBS a 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para isolar ARN, as células foram lavadas em PBS 1X, tratadas com tripsina e sedimentadas através de centrifugação. As células foram cultivadas quatro dias confluência passado antes do isolamento de ARN, uma vez que foi anteriormente relatado que o seu perfil de expressão de desmogleína completo é atingido neste ponto de tempo [32]. Os sedimentos celulares foram ressuspensos em PBS 1X e então sedimentadas através de centrifugação a lavar. Este passo de lavagem foi repetido duas vezes para remover todos os vestígios de meio antes da colheita de ARN. RNA foi então colhidas utilizando o Kit RNeasy Mini e QIAshredder seguindo o protocolo do fabricante intitulada “Purificação de RNA total a partir de células animais Usando a tecnologia Spin” (Qiagen, Valencia, CA).

Os anticorpos

Anti -DSG3 (clone 5H10) e Dsg1 (clone 27B2) anticorpos monoclonais foram previamente descritos e foram dadas a nós como uma oferta generosa do Dr. James Wahl; ambos foram utilizados a uma diluição de 1:10 [33]. Anti-rato DSG2 anticorpo monoclonal (clone 10G11) foi adquirido a partir de ARP, Inc. (Belmont, MA) e utilizado a uma diluição de 1:50 para a análise de imunofluorescência de linhas de tecido e de células da próstata normais; anti-Dsg1 /2 o anticorpo monoclonal de ratinho (clone DG3.10) foi adquirido a partir de Fitzgerald (Acton, MA) e utilizado a uma diluição de 1:20 para TMA. anticorpo policlonal cobaia anti-DSG4 foi gerado pelo Dr. Lutz Langbein e que nos foi dada como um dom generoso, este anticorpo foi usada na diluição de 1:2000. Anti-citoqueratina anticorpo 14 (CK14) policlonal de coelho foi adquirido de Covance (Princeton, NJ) e utilizado a uma diluição de 1:1000. anticorpo monoclonal de ratinho anti-PSA foi adquirido de DAKO (Carpinteria, CA) e usado numa diluição de 1:20. anticorpo monoclonal de coelho anti-PSA foi comprado de Abcam (Cambridge, MA) e utilizado a uma diluição de 1:200. anticorpo policlonal de porquinho da índia anti-citoqueratinas 8/18 (CK8 /18) foi adquirido a Progen (Heidelberg, Alemanha) e utilizado a uma diluição 1:100. anticorpos secundários Alexa Fluor 594 ou Alexa Fluor 488 foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA) e foram utilizados a uma diluição de 1:600.

RT-PCR

O ARN total a partir de pele humana normal e na próstata normal (ambos provenientes de um único dador) foi adquirido comercialmente (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA). A primeira cadeia de ADNc foi feita utilizando oligo dT e o Superscript II da primeira cadeia Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo as instruções do fabricante. A PCR foi realizada utilizando Platinum PCR Supermix (Invitrogen, Carlsbad, CA) e iniciadores para os transcritos de interesse (resumidas na Tabela S1). O seguinte protocolo de PCR foi usado: Etapa 1: 94 ° C durante 3 min; Passo 2: 94 ° C durante 30 seg, 56 ° C durante 45 seg, 72 ° C durante 2 min; Passo 3: 72 ° C durante 10 min; repita o passo 2 para 34 ciclos. Os produtos de PCR foram sujeitos a electroforese num gel de agarose /1X TBE a 1% contendo brometo de etídio e visualizada utilizando electroforese Kodak Documentação e Analysis System 120 Câmara (Kodak, Rochester, NY).

qRT-PCR

O ARN foi colhido a partir de linhas celulares de interesse, tal como descrito. A primeira cadeia de ADNc foi feita utilizando oligo dT e o SuperScript III da primeira cadeia Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo as instruções do fabricante. qRT-PCR foi realizado numa máquina de Stratagene Mx3005P e analisados ​​utilizando o software Stratagene MXPRO QPCR (Stratagene, Santa Clara, CA). Todas as reacções foram realizadas utilizando QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen, Valencia, CA), iniciadores de 200 nm (resumidos na Tabela S1), e 10 ng de cDNA num volume de reacção de 20 uL. A seguinte reacção de PCR foi usado: Etapa 1: 95 ° C durante 10 min; Passo 2: 95 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 1 min; repita o passo 2 para 40 ciclos. Todas as amostras foram analisadas em quadruplicado, e as amostras foram normalizados contra um controle interno, β-actina endógeno.

Tecidos Imunofluorescência-congelados e linhas celulares

lâminas de tecido da próstata humana normal congelado, correspondentes a prostática de transição zona com confirmação histológica áreas de glândulas normais de pacientes foram utilizados para caracterizar os anticorpos para detectar a expressão desmogleínas. As linhas celulares foram crescidas em lamelas de vidro (Fisher, Pittsburgh, PA), em 6 placas de poços de cultura de tecidos (BD Falcon, Bedford, MA). Apresentações /lamelas foram fixadas em metanol frio a 100% durante 15 min a -20 ° C seguido de acetona fria de fixação de 100% durante 2 min a -20 ° C. As lâminas /lamelas foram lavadas em solução salina tamponada com fosfato 1X (PBS), com agitação, permeabilizadas com 1% de Triton-X100 em PBS 1X à temperatura ambiente durante 5 minutos, e lavadas de novo em PBS 1X com agitação. As lâminas /lamelas foram incubadas em 0,1% de Triton X-100/1% de albumina de soro bovino (BSA) /PBS 1X bloco à temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de incubação do anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, diapositivos /lamelas foram lavadas em PBS 1 X, com agitação, em seguida, uma diluição de anticorpo secundário 1:600, quer Alexa Fluor 594 ou Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA), foi adicionado e diapositivos /lamelas foram incubadas à temperatura ambiente durante 45 min. Slides /lamelas foram então lavadas em PBS 1 X com agitação, imerso brevemente em água e montado usando Vectashield meio de montagem com DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA).

Análise por imunofluorescência de Tissue Microarray (TMA) Secções

TMA foram construídos como se segue: hematoxilina Eosina secções coradas de espécimes (FFPE) prostatectomia embebidos em parafina fixadas em formalina foram revisados ​​para identificar áreas viáveis, morfologicamente representativos de glândulas prostáticas normais e adenocarcinoma acinar do qual poderiam ser tomadas amostras do núcleo da agulha. De cada amostra, em triplicado núcleos dos tecidos adjacentes, com diâmetros de 0,6 mm foram perfurados e vestiu em um bloco de parafina receptor utilizando um instrumento de precisão (Beecher Instruments, MD). Todos os golpes foram obtidos a partir de um foco com a maior pontuação de Gleason, e a maioria dos golpes foram retirados do nódulo tumoral dominante – definido como o maior nódulo com a maior pontuação Gleason e estágio em uma amostra de prostatectomia específicos. Follow-up de dados para todos os casos em relação evidência de recorrência biológica estava disponível para este estudo. secções de cinco micrômetros consecutivos destes blocos de TMA foram utilizados para análise de imunofluorescência, e a primeira seção foi corado com Hematoxilina Eosina para servir como um modelo para a morfologia. As lâminas foram desparafinadas e re-hidratadas, e a recuperação de antigénio foi realizado por lâminas de aquecimento num vaporizador em tampão citrato, pH 6,0 durante 15 minutos. As lâminas foram então lavadas uma vez em PBS 1X. As lâminas foram incubadas em 0,1% de Triton X-100 /BSA a 1% /soro de bloqueio 1X PBS à temperatura ambiente durante 1 hora seguido por incubação do anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, lâminas foram lavadas em PBS 1 X, com agitação, em seguida, uma diluição de anticorpo secundário 1:600, quer Alexa Fluor 594 ou Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA), foi adicionado e as lâminas foram incubadas à temperatura ambiente durante 45 min . As lâminas foram então lavadas três vezes em 1X PBS + 0,1% de Triton X com agitação, lavou-se três vezes em 1X PBS, brevemente imersa em água e montados utilizando meio de montagem Vectashield com DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). CK8 /expressão 18 foi utilizado para identificar todas as áreas epiteliais (tanto de tumor e as glândulas normais) nos núcleos e a expressão das proteínas de interesse foi marcado por determinação da percentagem de células de tumor com imunorreactividade por núcleo de tecido (de 0% a 100% ), sem ter em conta a intensidade do sinal. A avaliação foi realizada por um uropathologist (MCM) seguinte metodologia previamente utilizados: áreas tumorais no núcleo foram identificados primeiro por DAPI, confirmou-se pela presença de CK8 /18 e, em seguida, marcado por estabelecimento de uma percentagem de células de tumores com expressão de membrana de DSG2 [ ,,,0],34] foram então usados ​​.Os valores médios dos núcleos representativos de cada amostra para análise estatística. Um corte positiva de 60% foi usado para realizar análises estatísticas de correlação com características clínico-patológicas e sobrevivência como este foi o valor da expressão média aproximada observados para DSG2 nesta coorte de câncer de próstata, como já relatado na literatura [35].

prostate cancer Cohort e clínico-patológico Características

neste estudo analisou uma coorte de 414 pacientes diagnosticados com câncer de próstata primário. características clínico-patológicas destes pacientes estão resumidos na Tabela 1. A média de idade no momento do diagnóstico foi de 61 anos (variação: 41-74.7 anos). A maioria dos pacientes eram brancos (56%) ou Africano-Americano (43%). O seguimento médio foi de 56,8 meses (variação: 1.4-123.6 meses). Apenas 98 (24%) dos pacientes mostraram uma recaída bioquímica, definidos como tendo duas detectáveis ​​aumento dos níveis de PSA consecutivos ( 0,2 ng /ml) quatro semanas ou mais após a cirurgia. curvas de sobrevida livre de recorrência bioquímica correspondentes aos fatores de risco clínico-patológicas bem conhecidos, tais como PSA pré-cirúrgica, estágio patológico, Gleason Score, angiolinfática Invasion e Perineural Invasion, são apresentados na Figura S1.

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada usando SPSS v18.0 (IBM, Armonk, NY). O teste t de Student foi utilizado para comparar a expressão da proteína de interesse no cancro da próstata primário e no tecido da próstata normal. de correlação de Spearman foi utilizado para analisar a correlação entre as proteínas de interesse e características clínico-patológicas. sobrevida livre de recidiva bioquímica foi analisada utilizando curvas de sobrevida de Kaplan-Meier e as curvas foram comparadas pelo teste de log-rank. A análise multivariada incluindo a expressão DSG2 e os parâmetros clínico-patológicas foi realizada utilizando Cox modelo de riscos proporcionais. A

P

-valor ≤0.05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Desmogleínas são especificamente expressos em células luminais do normal próstata humana

Como o expressão de desmogleínas na glândula da próstata não tinha sido caracterizado até à data, que começou este estudo examinando o perfil de expressão de desmogleína completo no tecido da próstata humana normal, utilizando RT-PCR e análises de imunofluorescência. A análise por RT-PCR mostrou que a maioria das desmogleínas podia ser prontamente detectada na próstata humana normal, ao nível do ARN, com a excepção de

Dsg1

que apresentou apenas fraca expressão de ARNm (Figura 1A). Análise por imunofluorescência revelou que apenas a expressão de DSG2 e DSG4 poderia ser facilmente e consistentemente detectado no epitélio da próstata ao nível da proteína (Figura 1B-C), enquanto que Dsg1 e Dsg3 não foram demonstrável no epitélio da próstata normal (Figura S2).

(a) clara expressão do mRNA pode ser detectado para a maioria dos desmogleínas, com exceção de

Dsg1

que mostra a expressão única de desmaio. (B-C) imunofluorescência Representante análises de DSG2 (B) e DSG4 (C) na fronteira de células do epitélio glandular da próstata humana normal. ampliação original: 200x. Barras de escala correspondem a 100 mm.

Tendo estabelecido a expressão de desmogleínas na próstata humana normal, que teve como objetivo determinar a expressão específica tipo de célula de DSG2 e DSG4. O tecido glandular da próstata é composta de condutas e acini que são revestidas por um epitélio cúbico simples virada para o lúmen das glândulas. Em adição a este componente secretor, duas outras células especializadas são parte integrante das estruturas glandulares da próstata, isto é, as células basais e das células neuroendócrinas [36], [37]. células luminais secretam, entre outras moléculas, antigénio específico da próstata (PSA) e representam a principal unidade funcional do órgão. Estas células formam uma camada contínua que se encontra na parte superior das células basais. As células basais são caracterizados por a expressão das citoqueratinas de elevado peso molecular (CKs) – tais como CK14 – e p63. Dispersos por todo o acini é a terceira população de células, as células neuroendócrinas, a origem e função do que na próstata normal, ainda não estão bem definidos.

Co-imunofluorescência análise foi realizada para examinar a localização de DSG2 e DSG4 CK14 com marcador específico de células basais, bem como a proteína específica luminal, PSA. A análise de co-imunofluorescência de DSG2 e CK14 mostra que DSG2 é robusta expressa nas células luminais da próstata e que essa expressão raramente se co-localiza com a de expressão CK14 basal (Figura 2A-C). Análise de DSG2 e PSA expressão revelaram a co-localização de ambas as biomarcadores nas células luminais (Figura 2D-F). A expressão de DSG4 foi muito semelhante ao de DSG2, mostrando forte expressão nas células luminais, raramente co-localizar com expressão basal CK14 (Figura 2G-I), mas a co-localização de expressão com PSA luminal (Figura 2J-G). Além disso, a expressão de DSG2 mostraram co-localização quase completa com a de DSG4, com a maioria das células luminais mostrando um mesmo nível de expressão de ambas as desmogleínas e algumas células mostrando um nível de expressão ligeiramente mais elevada para um em relação ao outro (Figura 2M- O). Tomados em conjunto estes resultados ilustram que a expressão de DSG2 DSG4 e está principalmente restringida às células luminais das glândulas epiteliais da próstata humana.

(A-C) DSG2 é expresso nas células luminais das glândulas prostáticas e esta expressão raramente co-localiza com expressão CK14 basocelular. (D-F) DSG2 co-localiza com a expressão do PSA no compartimento luminal da glândula. (G-I) DSG4 também se expressa nas células luminais e raramente se co-localiza com a expressão CK14 de células basais. (J-L) expressão DSG4 co-localiza com expressão PSA celular luminal. (M-O) a expressão de DSG4 mostra também co-localização quase completa com a de DSG2 nas células luminais. ampliação original: 200x. Barras de escala correspondem a 100 mm.

DSG2 é expressa em linhas celulares de cancro da próstata humano

Depois de ter caracterizado a expressão de desmogleínas em tecido da próstata humana normal, queríamos focar DSG2 para o resto do estudo como este é o mais amplamente expresso desmogleína isoforma – que mostra a expressão ubíqua em todos os tecidos que formam desmosome. Na sequência da nossa descoberta anterior que DSG2 é expresso no epitélio normal da próstata humana, nós então perguntado se esta proteína também é expresso em linhas celulares de cancro da próstata humana. Para analisar esta questão, de qRT-PCR foi realizada em RNA extraído de três linhas comercialmente disponíveis e bem caracterizados humano metastático de células de cancro da próstata (Figura 3A). As linhas celulares de cancro utilizadas para esta parte do estudo incluem a linha de células de LNCaP, que foi derivado a partir de um cancro da próstata com metástase para o nódulo linfático; a linha celular PC3, que foi derivado a partir de um cancro da próstata com metástase para o osso; e a linha de células DU145, que foi derivado a partir de um cancro da próstata com metástase no cérebro [38] – [40]. A linha de células BPH-1 serviu como um controlo para este estudo, uma vez que é uma linha imortalizada, não tumorigénicas da próstata epitelial de células derivadas de um doente com hiperplasia prostática benigna, um estado não relacionada com a transformação maligna da próstata [41]. Os resultados desta análise de qRT-PCR mostrou que

DSG2

é expresso a diferentes níveis em todas as linhas celulares examinadas. Curiosamente, a expressão de

DSG2

é maior em todas as linhas de células de cancro da próstata metastático examinados do que no controlo não-tumorigénico BPH-1.

(A), a expressão é detectada em DSG2 todas as linhas celulares examinadas, incluindo a linha de células de próstata normais imortalizadas BPH-1. Os dados são representados como média ± DP. ** P 0,01; *** P 0,001. (B-E) DSG2 é expressa na fronteira celular de células LNCaP e DU145; no entanto, a expressão de borda de célula não é detectado em células PC3 com apenas algumas células mostrando fraco, punctata e coloração difusa (inserção de ampliação; mostrado em 2.5X). ampliação original: 200x. As barras de escala corresponde a 100 um.

Em seguida, a análise de imunofluorescência foi utilizado para examinar a expressão de DSG2 nestas linhas celulares de cancro da próstata metastático humano ao nível da proteína (Figura 3B-E). Expressão celular de fronteira DSG2, foi detectada em células LNCaP e DU145 BPH-1. No entanto, as células PC3 faltava a expressão de DSG2 na fronteira da célula, enquanto que uma pequena população de células mostrou apenas uma coloração granular difuso para DSG2 no citoplasma (ver inserção ampliação na Figura 3D). Estes resultados são consistentes com e refinar ainda mais os resultados de um estudo prévio de Lang

et al.

Em que foi utilizado um anticorpo específico para ambos Dsg1 e DSG2 para examinar expressão desmogleínas em LNCaP, PC3, e as células DU145 [ ,,,0],29], [42]. Os resultados da análise de imunof luorescência de qRT-PCR e mostram que a expressão de

DSG2

está presente em todas as linhas celulares de cancro da próstata e que, em duas das três linhas de células de cancro da próstata examinados, DSG2 localiza no limite da célula sugerindo que a formação desmossomal é mantida em linhas celulares de cancro da próstata metastático mais examinou

in vitro

.

a DSG2 Fenótipo Baixa está associada a progressão tumoral em doentes com primário da próstata Carcinoma

como mencionado anteriormente, enquanto que a perda de expressão da caderina clássica tenha sido descrita em cancro da próstata, até à data, a expressão de caderinas desmossômicas em amostras de tecido de carcinoma da próstata não foi relatada. Para avaliar a percentagem de células positivas para a expressão DSG2 no carcinoma da próstata, em comparação com o tecido normal da próstata, análise de imunofluorescência da expressão DSG2 foi realizada sobre o carcinoma da próstata TMA (

N

= 414), bem como da próstata normal de TMA (

n

= 50). Além de um anticorpo para a proteína de interesse, um anticorpo para CK8 /18 – citoqueratinas encontrados tanto em próstata normal, luminal células epiteliais e células de adenocarcinoma -. Também foi incluído em cada TMA como um meio para identificar as células epiteliais em cada amostra

Uma diminuição significativa na percentagem de células positivas para a expressão DSG2 foi encontrado em carcinomas da próstata, em comparação com próstata normal (Tabela 2 e Figura S3). epitélio da próstata normal foi caracterizado por uma elevada percentagem de células positivas para a expressão DSG2 (expressão de 81,1%, média de 84,5% média), enquanto que amostras de tumores de próstata demonstraram uma porcentagem significativamente menor de células positivas DSG2 (média de expressão de 57,5%, média de 66,7%;

P

= 0,0002). Um valor de corte de expressão celular positiva DSG2 60% foi utilizada, tal como este foi o valor médio aproximado de expressão observada para DSG2 na coorte de cancro da próstata, e a mediana foi anteriormente e amplamente utilizado para efectuar análises de sobrevivência [35]. Usando este valor de cut-off, observou-se que 96% das amostras de tecido de próstata normais foram considerados positivos para DSG2, em comparação com apenas 46% dos espécimes de carcinoma da próstata estudados. Notavelmente, a quantidade de células que eram positivas para a expressão de borda de célula de DSG2 foi geralmente mais elevada em áreas bem diferenciadas do tumor, enquanto a quantidade de células que apresentam esta expressão era frequentemente muito mais baixa em áreas pouco diferenciadas do tumor (Figura 4A-L ), um achado que foi ainda validado por correlação de Spearman (Tabela 3).

(a-L) a análise de imunofluorescência Representante da DSG2 e CK8 /18 no câncer de próstata. (D, E-H) TMAs mostrando a expressão alta DSG2 na borda da célula de áreas bem diferenciadas do tumor (painel D, dentro linha tracejada amarela). (D, I-L) TMA mostrando baixa expressão DSG2 em áreas pouco diferenciadas do tumor (painel D, mostrado na parte restante do tumor fora da linha tracejada amarelo). ampliação original: 200x. As barras de escala corresponde a 100 um. (M) Os pacientes que expressam níveis mais elevados de DSG2 tiveram uma sobrevida significativamente maior de recorrência livre do que aqueles que expressam níveis mais baixos de DSG2 (

P

= 0,01).

a correlação entre a expressão de DSG2 e as características clínico-patológicas mais comumente associada com um fenótipo agressivo câncer de próstata, incluindo a concentração sérica de PSA pré-cirúrgica, Gleason Score, e patológicos Stage foi então analisada através da correlação de Spearman (Tabela 3). Curiosamente, houve uma correlação negativa significativa entre a expressão DSG2 e concentração PSA pré-cirúrgico, bem como Gleason Score. Estes resultados revelaram que um fenótipo de expressão DSG2 low-to-negativo foi associado com níveis de concentração PSA aumentou soro pré-cirúrgicos, bem como com altos escores de Gleason.

Diminuição DSG2 Expression é um fator independente associado com um Pobre Resultado clínico em doentes com primário da próstata carcinoma

Depois de examinar a correlação entre fenótipo DSG2 e fatores de risco clínico-patológico de carcinoma da próstata, o próximo determinar se a expressão DSG2 está associada com sobrevida livre de recidiva bioquímica. Curiosamente, os pacientes cujos tumores expressaram ≥ 60% DSG2 teve uma sobrevida maior recorrência livre do que aqueles que expressam 60%, ea diferença entre os dois grupos foi estatisticamente significativa (Figura 4 M,

P

= 0,01). foi observada em pacientes com 60% de expressão DSG2 fenótipo, enquanto aqueles com ≥60% fenótipo expressão DSG2 não atingiram o tempo médio para a bioquímica: A mediana do tempo para recorrência bioquímica de 103,7 meses (87.7-119.8 meses IC 95% de intervalo) recorrência após um tempo de seguimento de 123,6 meses. Mais importante, quando foi realizada uma análise multivariada, observou-se que a expressão DSG2 era um fator independente de recorrência bioquímica (HR = 1,579,

P

= 0,050), bem como as características clássicas clínico-patológico: Gleason Pontuação e patológicos Stage (Tabela 4). Tomados em conjunto, estes resultados mostram que a expressão reduzida DSG2 é um biomarcador independente associado com uma recorrência bioquímica mais curto no cancro da próstata, revelando assim a utilidade clínica potencial de DSG2 como um biomarcador prognóstico da agressividade do tumor para os pacientes afectados com esta doença que ocorrem com frequência.

Discussão

os resultados apresentados neste estudo fornecem a primeira caracterização molecular de expressão desmogleínas na próstata humana normal, caracterização de DSG2 em linhas celulares de cancro da próstata metastático, e a primeira análise de expressão DSG2 em amostras de tecido de carcinoma prostático primário. Os resultados aqui relatados mostram que enquanto a maioria dos desmogleínas são distintamente expressa na próstata humana, no nível de ARN, apenas a DSG2 e DSG4 são identificados de forma consistente a um nível elevado na próstata humana normal, ao nível da proteína.