saudável

Abstract

Neste estudo foram utilizadas fezes de perfis para identificar as bactérias intestinais e metabólitos que são diferencialmente representados em humanos com câncer colorretal (CRC) em comparação com controles saudáveis ​​para identificar como funções microbiana podem influenciar o desenvolvimento CRC. Amostras de fezes foram coletadas de adultos saudáveis ​​(n = 10) e pacientes com câncer colorretal (n = 11) antes da cirurgia de ressecção do cólon, da Universidade de-Poudre Saúde Hospital Vale Colorado em Fort Collins, CO. A região V4 do gene 16S rRNA foi pyrosequenced e ambos os ácidos gordos de cadeia curta e metabolitos fecais globais foram extraídos e analisados ​​utilizando cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS). Não houve diferenças significativas na estrutura da comunidade microbiana global associado com o estado de doença, mas vários gêneros de bactérias, especialmente as espécies produtoras de butirato, foram sub-representadas nas amostras de CRC, enquanto a-mucina degradante espécie,

Akkermansia muciniphila

, foi cerca de quatro vezes superior em CRC (p 0,01). quantidades proporcionalmente mais elevadas de butirato foram vistos nas fezes de indivíduos saudáveis ​​enquanto que as concentrações relativas de etilo foram mais elevadas nas fezes de pacientes de CRC. GC-MS revelou perfis de concentrações mais elevadas de aminoácidos de amostras de fezes de pacientes de CRC e superior poli e os ácidos gordos mono-insaturados e ácido ursodesoxicólico, um ácido biliar conjugado em amostras de fezes de adultos saudáveis ​​(p 0,01). Análise correlativa entre os conjuntos de dados combinados revelou algumas relações potenciais entre metabólitos de fezes e certas espécies bacterianas. Estas associações podem fornecer informações sobre as funções microbianas que ocorrem em um ambiente de câncer e vai ajudar estudos mecanicistas futuros diretos. Usando “ômicas” abordagens integradas pode ser uma ferramenta útil na identificação de grupos funcionais de bactérias gastrointestinais e seus metabólitos associados como novos alvos terapêuticos e quimiopreventivos

Citation:. Weir TL, Manter DK, Sheflin AM, Barnett BA, Heuberger AL, Ryan EP (2013) Banco Microbiome e Diferenças metaboloma entre pacientes com câncer colorretal e adultos saudáveis. PLoS ONE 8 (8): e70803. doi: 10.1371 /journal.pone.0070803

editor: Bryan A. White, da Universidade de Illinois, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de abril de 2013; Aceito: 24 de junho de 2013; Publicação: 06 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Weir et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo NIH NCI R03CA150070, Colorado Experiment Station Agricultura (CAES) e Fundação Shipley. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

um sistema gastrointestinal saudável depende de uma biota commensal equilibrada para regular processos como colheita dietético de energia [1], o metabolismo de microbiana e produtos químicos de acolhimento derivados [2], e modulação imunológica [3]. Acumulando as evidências sugerem que a presença de agentes patogénicos microbianos ou um desequilíbrio na comunidade bacteriana nativa contribui para o desenvolvimento de certos cancros gastrointestinais. A relação causal entre câncer gástrico e

Helicobacter pylori

foi estabelecida [4], o que leva à hipótese de que outros organismos associados ao hospedeiro estão envolvidos na etiologia do câncer.

Uma associação entre o cancro colorectal ( CRC) e bactérias comensais foi suspeitado por décadas. Por exemplo,

Streptococcus infantarius

(anteriormente

S. Bovis

) tornou-se diagnóstico importante depois foi reconhecido que bacteremia devido a este organismo foi frequentemente associada com doença neoplásica colorretal [5], [6] . No entanto, estudos anteriores que associam géneros de bactérias com o risco de cancro do cólon foram limitados a métodos baseados em cultura que não reflectem a complexidade da microbiota gastrointestinal [7] – [9]. Desenvolvimento de sequenciamento de alto rendimento tem facilitado levantamentos detalhados da microbiota intestinal, e um cancro colorectal mais completa e complexa (CRC) microbioma -associated está emergindo. Sobhani et ai. [10] descobriram que o Bacteroides /

Prevotella

grupo foi sobre-representadas em ambas as amostras de fezes e mucosa dos indivíduos com câncer de cólon em comparação com os seus homólogos sem câncer. Eles também descobriram que

Bifidobacterium longum

,

Clostridium clostridioforme

, e

Ruminococcus bromii

foram sub-representadas em amostras desses indivíduos e concluiu que a falta de correlação entre o estágio do tumor /size com as populações sobre-representados sugeriu um papel contributivo da bactéria no desenvolvimento do tumor. Dois estudos adicionais, publicados simultaneamente, examinou a microbiota presente na mucosa do tumor e tecido saudável adjacente de indivíduos com cancro do cólon e ambos os estudos revelaram uma super-representação de

Fusobacterium spp

[11], [12], enquanto outros têm revelou uma abundância de

Coriobacteria Comprar e outras espécies probióticas [13], [14].

A questão que permanece é se sobre-representação das determinada espécie microbiana nas fezes e amostras de mucosa é indicativo de uma contribuição papel no desenvolvimento de CRC ou uma consequência do ambiente tumoral. Embora o papel causal da biota intestinal em desenvolvimento CRC não tem sido demonstrada, não há evidências que sugerem que a indução de respostas pró-inflamatórias por comensais contribuem para a iniciação e o desenvolvimento [10] do tumor, [14]. Produção de genotoxinas e radicais superóxido DNA danificando também são mecanismos pelos quais os comensais podem contribuir para o desenvolvimento CRC [15]. Alternativamente, foi levantada a hipótese de que certas bactérias probióticas atuar como forrageiras tumorais, aproveitando um nicho ecológico criado pelas alterações fisiológicas e metabólicas no microambiente do tumor [14].

Para esclarecer o papel da biota intestinal em o desenvolvimento de CRC, será necessário ir mais além taxonômico sobre-representação e examinar as mudanças na microbioma CRC associado em um contexto mais funcional. Um parâmetro funcional importante é como comensais organismos contribuir para o fluxo de metabólitos e a repartição dos componentes da dieta. Assim, metabonómica, o estudo de alterações globais nos metabolitos em resposta a estímulos biológicos [16], está a ser aplicado para identificar e caracterizar a microbiota funcional que impulsiona alterações metabólicas associadas com diferentes dietas, genótipos, e estados de doença [17] – [19 ]. perfis de fezes de metabólitos foram validados como um meio de avaliar a atividade intestinal microbiana [20] e o presente estudo contribui para a crescente lista de micróbios do intestino no microbioma CRC, mas também utiliza uma abordagem metabonomics para identificar potenciais interacções microbioma-metaboloma.

Materiais e Métodos

h3> Declaração

consentimento

Todos os indivíduos desde informado por escrito antes de participar no estudo. Todos os protocolos de estudo foram aprovados pela Colorado State University (números de protocolo 10-1670H e 9-1520H) e Poudre Vale Hospital-Universidade de Conselhos de Revisão Institucional do Sistema Único de Saúde Colorado (números de protocolo 10-1038 e 10-1006).

Colheita e extração de DNA

As amostras de fezes foram coletadas de indivíduos saudáveis ​​(n = 11) e pacientes com câncer de cólon recentemente diagnosticados (n = 10) antes da cirurgia de ressecção do cólon (Tabela 1 nota: nem todas as amostras foram sujeitos a todas as análises. Ver Tabela 1 nota de rodapé). Os critérios de exclusão para todos os participantes incluíram o uso de antibióticos no prazo de dois meses de participação no estudo e uso regular de AINEs, as estatinas, ou probióticos. Os indivíduos que relataram distúrbios intestinais ou alergias alimentares crônica /restrições alimentares também foram excluídos do estudo. exclusão adicional para os pacientes CRC incluídos quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia. Amostras de fezes foram fornecidas para as análises antes da administração de quaisquer antibióticos pré-operatórios ou preparo intestinal. As amostras foram transportadas para o laboratório no prazo de 24 horas após a recolha pelos participantes do estudo. Amostras de fezes foram homogeneizadas, e três sub-amostras foram coletadas com cotonetes estéreis. O DNA foi extraído a partir de todas as amostras, utilizando kits de extracção de ADN (Mobio Powersoil Mobio, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante e armazenou-se a -20 ° C antes da amplificação passos.

Análise pirossequenciao

a amplificação da região V4 do gene 16S rRNA bacteriano foi realizado em triplicado utilizando iniciadores 515F e 806R de erro marcadas com 12-bp que rectifica códigos de barras de Golay [21]. Vinte reacções il contendo 5 Prime quente Master Mix (5 Prime, Inc., Gaithersburg, MD) foram amplificadas a 94 ° C durante 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 94 ° C durante 1 min, 63 ° C durante 1 min, e 72 ° C durante 1 min seguido por uma extensão final a 72 ° C durante 10 minutos. Replicar reacções de PCR de cada amostra foram combinadas e purificadas em gel utilizando o kit Gel Extraction GenElute (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), seguindo-se uma purificação adicional com grânulos AMpure (Beckman Coulter, Indianapolis, IN) e quantificadas com o PicoGreen Ensaio de ADN (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) antes de agrupamento de biblioteca. Pyrosequencing foi realizada sob contrato pela Universidade de Engencore Sequencing Facility da Carolina do Sul usando um Life Sciences GS Sistema FLX 454 com a química padrão.

Todos sequência ler edição e processamento foi realizado com Mothur Ver. 1.25 [22] usando as configurações padrão, a menos que indicado em contrário. Resumidamente, a sequência lê foram (i) cortada (bdiff = 0, pdiff = 0, qMÉDIA = 25, minlength = 100, maxambig = 0, maxhomop = 10); (Ii) alinhado com o alinhamento SILVA bacteriana-subconjunto disponível no site da Mothur (https://www.mothur.org); (Iii) filtrada para remover lacunas verticais; (Iv) rastreados para potenciais quimeras usando o método uchime; (V) classificada usando o banco de dados Genes Verdes (https://www.mothur.org) eo classificador Baysian naïve [23] incorporado em Mothur. Todas as sequências identificadas como cloroplastos foram removidos; (Vi) as sequências foram triados (otimizar = minlength-end, os critérios = 95) e filtrada (vertical = T, trunfo =.) Para que todas as sequências cobriu o mesmo espaço genético; e (vii) todas as sequências foram pré-agrupado (diff = 2) para remover o ruído pyrosequencing potencial e cluster (calc = onegap, coutends = F, method = mais próximo) em OTUs [24]. Para remover o efeito do tamanho da amostra em métricas de composição da comunidade, sub-amostras de 1.250 leituras foram selecionados aleatoriamente a partir de cada amostra de fezes. Após a sequência de agrupamento lê em OTUs (ou seja, mais próximos-vizinhos a 3% de distância genética) ou filotipos (ie, sequências correspondentes a um gênero comum nos genes verdes Banco de Dados), os sub-amostras idênticas foram ponderadas para produzir um perfil de comunidade única para cada amostra. valores independentes do tamanho da amostra para descritores da comunidade alfa diversidade como riqueza de espécies observadas (

S

obs

), as estimativas Chao1 de riqueza total de espécies (

S

Chao

), a diversidade de Shannon (

H ‘

) e uniformidade (

e

H

), e diversidade de Simpson (1-D) e uniformidade (e

D) foram determinadas por montagem de uma 3- parâmetro curva exponencial [

y

=

y0

+

a

(1-e

-bx

)] para parâmetros rarefeitas em uma faixa de 100-1250 sequência lê, onde os máximos assintótica é igual à soma de

y0

e

um

. número efetivo de espécies foram calculados como S

H = exp (H ‘) para o índice de Shannon e S

D = 1 /D para Simpson. Todos os dados de seqüência está disponível ao público através da Sequence Leia Archive (SRA) sob o número de estudo ERP002217, que está disponível no seguinte link: https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/ERP002217.

nontargeted perfil metabólico e métodos de processamento de dados

cem miligramas de amostra de fezes liofilizado foram extraídos duas vezes com 1 ml de 03:02:02 isopropanol: acetonitrilo: água centrifugado a 14.000 rpm durante 5 minutos e os sobrenadantes foram combinados. O extracto foi seco utilizando um Speedvac, ressuspensas em 50 mL de piridina contendo 15 mg /ml de cloridrato de metoxiamina, incubou-se a 60 ° C durante 45 min, sonicada durante 10 minutos, e incubou-se durante um adicional de 45 min a 60 ° C. Em seguida, foi adicionado 50 pL de N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida com 1% de trimetilclorosilano (MSTFA + 1% TMCS, Thermo Scientific) e as amostras foram incubadas a 60 ° C durante 30 minutos, centrifugada a 3000 × g durante 5 min, arrefecida à temperatura ambiente, e 80 ul do sobrenadante foi transferido para um dispositivo de vidro com 150 mL num frasco de auto-amostrador GC-MS. Os metabolitos foram detectados utilizando um GC de rastreio ultra acoplado a um Thermo DSQ II (Thermo Scientific). As amostras foram injectadas numa proporção de 1:10 duas vezes dividida em blocos ao acaso discretas. A separação ocorreu utilizando uma coluna de 30 m TG-5MS (Thermo Scientific, 0,25 mm ID, 0,25 um espessura de filme) com uma taxa de fluxo de gás de hélio de 1,2 mL /min, e o programa consistia de 80 ° C durante 30 seg, uma rampa de 15 ° C por min até 330 ° C, e uma espera 8 min. Massas entre 50-650

m /z

foram digitalizados em 5 leituras /seg após a ionização por impacto de elétrons. Para cada amostra, uma matriz de características moleculares, tal como definido pelo tempo de retenção e de massa (

m /z

) foi gerado usando software XCMS [25]. Características foram normalizados para a corrente total de iões, e a quantidade relativa de cada característica molecular foi determinada pela média da área do pico cromatográfico entre injecções replicadas (n = 2). características moleculares foram formados em grupos de pico usando software AMDIS [26], e os espectros foram selecionados no Instituto Nacional de Padrões de Tecnologia (www.nist.gov) e Golm (https://gmd.mpimp-golm.mpg.de/) bases de dados de metabólitos de identificações.

AGCC determinação.

amostras de fezes foram extraídos de ácidos graxos de cadeia curta, misturando 1 g de fezes congeladas com água acidificada (pH 2,5) e ultra-sons durante 10 min. As amostras foram centrifugadas e filtrou-se através de filtros de nylon de 0,45 um e armazenado a -80 ° C antes da análise. As amostras foram analisadas utilizando um GC de rastreio ultra acoplado a um varrimento Thermo DSQ II a partir de

m /z

50-300 a uma taxa de 5 leituras /segundo no modo de impacto de electrões. As amostras foram injectadas a uma razão de 10:01 de divisão, e a entrada foi mantida a 22 ° C e linha de transferência foi mantida a 230 ° C. A separação foi conseguida através de uma 30 m TG-WAX-se uma coluna (Thermo Scientific, 0,25 mm de diâmetro, 0,25 mm de espessura de película), utilizando um programa de temperatura de 100 ° C durante 1 min, rampa a 8 ° C por minuto até 180 ° C, realizada a 180 ° C durante um minuto, aumentada até 200 ° C a 20 ° C /minuto, e mantida a 200 ° C durante 5 minutos. fluxo transportadora Hélio foi realizada em 1,2 mL por minuto. As áreas de pico foram integrados pelo software Thermo Quan usando iões seleccionados para cada um dos ácidos gordos de cadeia curta, e áreas foram normalizados ao sinal total.

Análise estatística

Diferenças em filotipos bacterianas e metabolitos globais entre amostras de indivíduos saudáveis ​​e pacientes com câncer de cólon foram determinadas usando AMOVA e aluno da t-testes com um nível de significância de 0,01. Filotipos e metabolitos que foram significativamente diferentes entre os grupos foram aperfeiçoadas através da remoção de marcadores que tinham total de menos de 25 lê (bactérias) ou sinais de fundo limítrofes (metabolitos) ou que estavam presentes em menos de 3 amostras individuais. As concentrações de ácidos gordos de cadeia curta foram determinados em duas corridas cromatográficas separadas, assim que uma média ponderada foi calculada para cada composto quantificada e diferenças estatísticas entre as amostras de fezes de indivíduos saudáveis ​​e pacientes com cancro do cólon foram determinadas usando um modelo misto de ANOVA com experiência representativa de um efeito aleatório e estado da doença como um efeito fixo (XLSTAT 2011.1, Addinsoft Corp, Paris, França). Correlações entre metabólitos e bactérias foram determinadas usando r de Pearson com uma correlação moderada indicado por um r≥0.50 e uma forte correlação indicado por um r≥0.70.

Resultados e Discussão

Alfa e Beta Diversidade nas fezes Biota

descritores típica comunidade de diversidade alpha para os dados microbianos moleculares incluem riqueza OTU real e estimado, e os índices de diversidade da população e uniformidade. Em sistemas onde os patógenos são introduzidos (por exemplo,

Helicobacter pylori)

, não são marcadas reduções nas estimativas de diversidade e uniformidade [27] sugerindo que esses índices podem ser preditores úteis de infecção. Nós examinamos esses parâmetros em amostras de fezes de indivíduos saudáveis ​​e aqueles com CRC para ver se eles poderiam ser usados ​​como preditores de doença state.We observadas diferenças significativas na distância genética de 3% na diversidade média ou uniformidade das comunidades microbianas fezes de saudável indivíduos em comparação com aqueles com CRC (Tabela S1). A cobertura média obtida a partir de 1250 leituras por amostra foi de 84% e 86% em amostras saudáveis ​​e cancerígenas do cólon, respectivamente. A diversidade média efectiva de cada grupo sugeriu uma tendência para uma maior diversidade bacteriana em amostras de fezes de indivíduos saudáveis ​​(S

H = 63

, S

D = 20) em comparação com os de pacientes com CCR (S

H = 46

, S

D = 15); No entanto, a variação inter-individual era demasiado grande para alcançar significância estatística. Com base nestes dados, sugerimos que descritores alfa diversidade da microbiota de fezes não são indicativos do estado de doença no CRC; embora uma limitação do estudo é que apenas amostras de fezes e não mucosa tecidos foram analisados. No entanto, apesar das diferenças inerentes nas fezes e comunidades microbianas mucosas nossas descobertas são consistentes com outros relatórios publicados do total de estimativas de diversidade bacteriana e uniformidade entre CRC e fezes saudável e tecidos /mucosasamples [10].

Esta variação inter-individual também era aparente nas estimativas de diversidade beta, onde foi observado um baixo grau de similaridade na composição da comunidade microbiana global entre indivíduos como determinado usando a distância Jaccard não ponderada (J

class) para comparar a adesão da comunidade (Figura 1A) e Yue e Clayton [28] índice (Θ

YC) para comparar as estruturas comunitárias (Figura 1B). Devido a essa variação, não há padrões na composição global da comunidade foram observadas entre as amostras de fezes de pacientes com CCR e indivíduos saudáveis.

As diferenças taxonômicas entre CRC e amostras de fezes saudável

O estado da doença de estudo participantes não conduzir estrutura global da comunidade da microbiota fezes, bem como a composição e abundância relativa dos principais filos foram semelhantes, embora tenha havido uma tendência não significativa para uma maior Verrucomicrobia em amostras de pacientes com câncer de cólon (Figura 2). Havia também níveis mais elevados de Synergetes no grupo de câncer, mas isso foi impulsionado por um único indivíduo com uma proporção extremamente elevada deste filos e não era representativa de toda a população do câncer sequenciado. No entanto, ao género /espécie nível, houve uma série de OTU de que foram significativamente sub-representadas nas fezes de pacientes com câncer de cólon em comparação com indivíduos saudáveis ​​(Tabela 2). Estes incluem vários Gram-negativas

Bacteroides

e

Prevotella spp

. que foram anteriormente isolados a partir de fezes humanas, mas não estão bem caracterizados no que diz respeito ao seu papel na função intestinal ou de saúde geral. Dois dos

Prevotella

espécies identificadas não só foram sub-representadas, mas estavam completamente ausentes das amostras de câncer de cólon analisados.

Prevotella

era um géneros dominantes relatados nas fezes das crianças em uma comunidade rural do Burkina Faso, mas ausente de uma coorte de crianças italianas, e os autores do estudo a hipótese de que

Prevotella

ajudaram a maximizar a colheita de energia a partir de uma dieta à base de plantas [29]. Portanto, é possível que os níveis mais elevados de

Prevotella

na coorte saudável pode refletir diferenças na ingestão de fibras e outros compostos vegetais, em comparação com os indivíduos com cancro do cólon. Ao nível de gênero, Shen et al [30] encontrou o

Bacteroides spp.

Para ser enriquecido no tecido do cólon de indivíduos saudáveis ​​quando comparados ao tecido adenoma. Lachnospiracae e membros dos gêneros

Dorea

e

Ruminococcus

também foram relatados como previosly filotipos dominantes diferenças entre amostras de tecidos saudáveis ​​e cancerosas [13] condução. A outra OTUs que identificamos como o

Dialister spp.

E

Megamonas spp

. não tenham sido previamente relatada em associação com câncer de cólon; no entanto, diminuíram as populações de

Dialister Invisus

foram relatados na doença de Crohn [31].

H números de amostra indicam amostras de adultos saudáveis, enquanto a designação C significa amostras de pacientes com câncer de cólon.

Houve menos bactérias identificáveis ​​que estavam sobre-representados na população cancro do cólon (Tabela 3). Mais notavelmente, observou-se que as bactérias degradadoras de mucina,

Akkermansia muciniphila

, o que representou uma porcentagem relativamente grande das sequências totais, estava presente em uma proporção significativamente maior nas fezes de pacientes com câncer de cólon. Esta bactéria é um membro comum da microflora do cólon e foi recentemente mostrado para ser reduzido no síndroma do intestino irritável e a doença de Crohn [32]; no entanto, um relatório mais recente mostrou aumento da

A. muciniphila

em bolsite associada à colite ulcerativa [33]. Dois tipos de mucinas, MUC1and MUC5AC, são reportedely sobre-expresso em cancros do cólon [34], sugerindo que a nossa observados aumentos relacionados com o CRC em

A. muciniphila

populações pode ser devido a um aumento da disponibilidade do substrato.

Citrobacter farmeri

, que pode utilizar citrato como única fonte de carbono, também foi maior em amostras de pacientes de cancro do cólon, mas representado uma proporção muito menor das sequências bacterianas totais.

Citrobacter farmeri

está entre um grupo de bactérias do intestino que inclui várias espécies patogênicas como

Salmonella

e

Shigella,

e que tem arilamina

N

-acetyltransferase atividade que pode estar envolvida na ativação de carcinógenos e metabolismo de xenobióticos [35].

Idade e IMC representam outros fatores que desempenham um papel na formação das comunidades microbianas intestinais. Vários relatórios demonstraram uma correlação entre o rácio de Bacteroides para Firmicutes e obesidade [1]. Realizamos regressão linear entre a abundância relativa de cada um dos táxons que diferiram significativamente entre CRC e fezes saudáveis ​​(ver Quadros 2 e 3) e IMC e não viu correlações significativas (Tabela S2). Além disso, o envelhecimento tem sido associada com uma diminuição na anaeróbios comensais protectoras, tais como

Feacalibacterium prausnitzii,

e um aumento

E. coli

[

36

]. Nós encontramos uma correlação negativa entre a idade dos participantes e

Dorea formicagens

(R

2 = 0,354; p = 0,041) e

Ruminococcus obeum

(R

2 = 0,434 ; p = 0,020), ambos os membros do grupo de Clostridium XIVa, sugerindo que as diferenças entre coortes com relação a essas duas espécies pode ser um resultado de diferenças na idade média dos participantes em cada grupo, em vez de o estado da doença CRC. Para nosso conhecimento, uma diminuição da população de membros do grupo de Clostridium XIVa não tenha sido previamente associado com o envelhecimento, mas tem sido associado com dysbiosis relacionadas com estados inflamatórios intestinais, tais como doença de Crohn [37]. Nenhum dos outros taxa bacteriana identificados foram correlacionados com a idade (Tabela S3). Portanto, podemos concluir que a maioria dos táxons que diferiram significativamente em amostras de fezes entre grupos saudáveis ​​e CRC foi um resultado de estado da doença e não a diferenças de idade ou IMC.

cadeia curta Fatty Acid Analysis

metabólitos microbianos ácidos de cadeia curta (AGCC), particularmente butirato, são amplamente estudados relatado para ter efeitos anti-tumorigênicos [38]. Os SCFA são rapidamente absorvidos do e utilizados em tecidos do hospedeiro de modo a detecção nas fezes é normalmente considerada uma indicação da produção em excesso daquilo que pode ser utilizado pelo hospedeiro [29]. Nós e outros [10], [13] observaram que as espécies de butirato de bactérias produtoras, como

Ruminococcus spp

. e

Pseudobutyrivibrio ruminis

, foram menores em amostras de fezes de pacientes com CCR em comparação com controles saudáveis. Portanto, nós quantificamos vários ácidos graxos de cadeia curta de amostras de fezes congeladas. Os três principais SCFA produzidos como metabolitos microbianos, acetato, propionato, e butirato, foram todas detectadas como foram valérico, isobutírico, isovalérico, capróico, heptanóico e os ácidos. Entre estes, os ácidos acético e valérico foram significativamente mais elevadas em amostras de fezes de pacientes de CRC (p 0,0001 e p = 0,024, respectivamente) enquanto que o ácido butírico foi significativamente maior nas fezes de indivíduos saudáveis ​​(p 0,0001; Figura 3). Não foram observadas diferenças no ácido propiónico entre os dois grupos. Butirato é considerada como uma das mais importantes nutrientes para colonócitos normais, e por si só ou em combinação com propionato de etilo que foi mostrado para reduzir a proliferação e induzir Apotosis nos carcinomas do cólon humano [39]. Apesar de etilo é um importante SCFA para a manutenção da saúde do cólon e como uma molécula precursora para a produção de colesterol endógeno, níveis elevados desta metabolito ter sido previamente associado com CRC nos seres humanos [40]. De etilo pode ser utilizado para produzir o butirato e diferenças de proporções desses metabolitos entre CRC e amostras saudáveis ​​pode reflectir uma depleção de micróbios do cólon que pode levar a cabo esta reacção em amostras de CRC ou pode ser um resultado de degradação de butirato de acetato de metilo sob baixo pH do cólon associado com CRC. Observou-se também concentrações relativas significativamente maiores de isobutírico (p 0,0001) e ácido isovalérico (p = 0,002) em amostras de indivíduos com CRC (Figura 3). Estes dois resultados de SCFA de metabolismo bacteriano de cadeia ramificada aminoácidos valina e leucina, que também foram mais elevados em amostras de fezes de CRC (Tabela 4), e podem ser responsáveis ​​pelos aumentos significativos observados nestes dois SCFA na população CRC.

o ácido acético, ácido valérico, ácido isobutírico, e concentrações de ácido isovalérico foram proporcionalmente mais elevado, enquanto o anti-proliferativa AGCC, ácido butírico foi significativamente menor.

globais de fezes metabolitos

as amostras de fezes para permitir a avaliação das bactérias residentes no lúmen intestinal, e, portanto, as moléculas pequenas fezes são consideradas como dando origem a partir de co-o metabolismo ou a troca metabólica entre os micróbios e células hospedeiras [13]. perfil metabólico global aqui realizados em amostras de fezes liofilizados fornecidos insights sobre a relação entre as populações microbianas e metabolitos, e emprestar para a identificação de novos biomarcadores metabólicos CRC. A técnica de análise multivariada supervisionado, ortogonal Projeção para estruturas de discriminante latentes Análise (OPLS-DA), o que facilita a interpretação modelando separadamente variáveis ​​preditivas e ortogonais (não-preditivos), foi utilizado para determinar se os perfis não-alvo GC-MS foram preditivos do estado de doença do doador. O OPLS-DA demonstrado modelagem satisfatória e capacidades de previsão para este conjunto de dados (R2Y = 0,986; QY2 = 0,927), revelando uma separação distinta entre as características das fezes metabólicas dos dois grupos (Figura 4), sugerindo que a presença ou ausência de CRC é um importante fator de condução a variabilidade em metabólitos de fezes.

em comparação com controles saudáveis, análise de fezes metaboloma revelou 11 aminoácidos que mostraram um aumento de 41-80% em amostras de fezes de indivíduos com CRC (Tabela 4). Razões que poderiam explicar este aumento CRC-associado em amino concentrações de ácido podem incluir, mas não se limitar a diferenças nos padrões de consumo de proteínas, a redução induzida por inflamação na absorção de nutrientes e aumento autofagia associada com células tumorais, resultando em acúmulo de aminoácidos livres piscinas [41]. A degradação microbiana de proteínas dietéticas no cólon distai é um processo putreficative que resulta na produção de aminas tóxicas, e pode contribuir para o aumento de aminoácidos livres nos observados em amostras de fezes de CRC. Um aumento da concentração de todos os aminoácidos excepto a glutamina foi previamente relatada em tecidos tumorais do estômago e cólon em comparação com o tecido saudável [42]. Os autores hipótese de que as células tumorais podem apresentar aumento da atividade glutaminase resultando na conversão de glutamina ao glutamato. Consistente com estes resultados, também vimos um grande aumento, cerca de 76%, no glutamato, sem um aumento correspondente na glutamina em amostras de fezes de pacientes com câncer de cólon. Outro estudo recente utilizando RMN para identificar e detectar metabólitos de extratos aquosos de fezes de amostras saudáveis ​​e CRC mostraram que as amostras de CRC tinha cerca de 1,5 vezes maiores níveis de cisteína, prolina e leucina [43]. O aumento das concentrações de prolina, serina, treonina e que foram observados em amostras de CRC também poderia ser o resultado da degradação de mucinas intestinais, os quais são constituídos principalmente por glicoproteínas ricas nestes aminoácidos [44]. Isto é consistente com o enriquecimento de

Akkermansia muciniphila

, uma mucina-bactérias degradadoras, observados em amostras de fezes de CRC; embora nós vimos há fortes correlações entre a proporção relativa destas bactérias e concentrações de aminoácidos específicos.

Houve maiores níveis de glicerol, bem como vários ácidos graxos insaturados detectados nas amostras de fezes de indivíduos saudáveis. células de cancro humano tem um sistema de transporte conhecido para a absorção de glicerol, sugerindo fezes glicerol pode ser menor em CRC porque está a ser absorvido pelas células tumorais. Alternativamente, as lipases bacterianas presentes em indivíduos saudáveis ​​podem facilitar o metabolismo de triacilgliceróis e dietéticos produzidos endogenamente, resultando em produtos de degradação final de glicerol e ácidos gordos livres. Além de glicerol, ácidos gordos mais estreitamente correspondentes assinaturas metabolômicos de ácido linoleico, e estereoisómeros de ácido oleico também foram mais elevados nos controlos (Tabela 4). Finalmente, o ácido ursodesoxicólico (UDCA), um ácido biliar secundário produzido por bactérias intestinais foi aproximadamente 63% mais elevada em indivíduos saudáveis ​​em comparação com CRC. Embora vários ácidos biliares, tais como ácido lithicolic e ácido desoxicólico têm sido associados com a tumorigénese, UDCA tem demonstrado efeitos quimiopreventivos em modelos pré-clínicos e animais de CRC [45].

Análise da correlação entre os dados e microbioma metaboloma revelou associações fortes entre alguns membros da microbiota fezes e candidatos metabolitos.