Abstract

Para identificar os mecanismos moleculares associados a agressividade e os candidatos biomarcadores no cancro da bexiga, foi realizada uma SILAC (Stable Isotope Rotulagem por Amino ácidos em cultura celular) análise proteômica comparando um T24 invasivo e uma linha de células de câncer de bexiga metastático T24T derivado agressivo. Um total de 289 proteínas foram identificadas expressas diferencialmente entre estas células com alta confiança. validação e análises complementares comparação incluiu de dados SILAC proteína com rácios de expressão obtidos a partir de ARNm de microarrays de oligonucleotídeos, e imunotransferência. Cul3, uma proteína sobre-expressa em T24T, envolvido na ubiquitinação e subsequente degradação de proteínas alvo proteossómica, foi seleccionado para posterior investigação. Análises funcionais revelou que Cul3 silenciamento proliferativa diminuída, e as taxas de migração de células invasivas T24T, e restaurou a expressão de proteínas do citoesqueleto identificados para ser underexpressed em células T24T por SILAC, tais como a ezrina, moesina, filamina ou caveolin. padrões de proteínas imuno-histoquímica Cul3 realizados em tumores de bexiga manchado em microarrays de tecido (n = 284), foram associados com o estadiamento do tumor, linfonodo metástases e sobrevivência específica da doença. Assim, a abordagem SILAC identificado que Cul3 modulado o fenótipo agressivo de células T24T modificando a expressão de proteínas do citoesqueleto envolvidas no agressividade cancro da bexiga; e desempenhou um papel biomarcador para a progressão do cancro da bexiga, metástase nodal e avaliação de resultados clínicos

Citation:. Grau L, Luque-Garcia JL, González-Peramato P, Theodorescu D, Palou J, Fernandez-Gomez JM, et ai. (2013) A Análise Quantitativa proteômica descobre a relevância da CUL3 no cancro de bexiga agressividade. PLoS ONE 8 (1): e53328. doi: 10.1371 /journal.pone.0053328

editor: John Matthew Koomen, Moffitt Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 19 de maio de 2012; Aceite: 30 de novembro de 2012; Publicação: 08 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Grau et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa (SAF2009-13035) do Ministério da Educação e Cultura Espanhola (para MS-C.). J.L.L.-G. foi apoiada pelo programa “Ramón y Cajal”, ea concessão CTQ2010-18644 do Ministério da Economia e Competitividade espanhol. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga representa o quarto tumor maligno mais comum entre os homens eo 8º causa mais frequente de morte por câncer do sexo masculino [1]. Clinicamente, a cerca de 75% de carcinomas de células transicionais (TCC) são não-invasiva do músculo (TIS, Ta e T1), 20% do músculo infiltrante (T2-T4), e 5% metastática no momento do diagnóstico [1]. tumores de baixo grau são papilar e geralmente não-invasiva, enquanto que os tumores de grau elevado pode ser papilar ou não-papilar, e muitas vezes invasiva. Pacientes com diagnóstico de TCC localizada têm uma taxa de sobrevivência de 5 anos acima de 90%. No entanto, os pacientes com doença metastática regional e distante tem uma taxa de sobrevivência de 5 anos para menos de 50% e 10%, respectivamente [1]. progressão do cancro da bexiga segue passos seqüenciais complexos, não totalmente esclarecida [2] – [4]. As diferenças no comportamento agressividade têm sido descritos entre a linha celular de cancro da bexiga T24 invasiva e a variante T24T mais agressivo que se desenvolve metástases após injecção na veia da cauda [5] – [9]. Identificação de proteínas expressas diferencialmente entre estas células podem revelar os mecanismos moleculares associados com a agressividade do tumor in vitro, levando potencialmente a metástase. As proteínas que participam em tais vias podem servir como biomarcadores para identificação precoce tanto de resultados agressiva e /ou potencialmente ser terapeuticamente segmentado.

proteómica quantitativas contribui para a descoberta de alvo e biomarcadores específicos da doença candidato. Enquanto arrays de proteínas e anticorpos permitem a quantificação diferencial de proteínas conhecidas [10], [11], técnicas de espectrometria de massa para identificação de proteínas levam [12]. rotulagem isótopo estável por aminoácidos em cultura de células (SILAC) envolve a adição de (12) e C (13) aminoácidos para o meio de crescimento das células cultivadas em separado, dando origem a células contendo marcado com C “luz” ou “pesada” proteínas, respectivamente [12] – [31]. Para nosso conhecimento, SILAC não foi relatado no cancro da bexiga. Aqui, a análise quantitativa proteomic foi aplicado a células T24 e T24T para identificar proteínas e vias relacionadas com a sua agressividade diferencial seguintes nossa concepção experimental (Figura 1).

análises funcionais foram realizados para avaliar o fenótipo agressivo diferencial de T24 e as células cancerosas T24T bexiga sobre: ​​a) proliferação, B) invasão, e C migração). A média de experiências em duplicado para cada ensaio funcional destas células a vários tempos está representada em cada painel. D) Diagrama esquemático mostrando o fluxo de trabalho utilizado para os experimentos baseados em SILAC multiplexados. rotulagem interna foi realizada

In vitro

, os extractos de proteína foram fraccionadas através de SDS-PAGE, digeriu-se com tripsina em gel, e digestões com tripsina foram analisados ​​por LC-MS /MS para identificar e quantificar tanto as proteínas presentes. E) Comparação das alterações proteína identificada por SILAC foi realizada com os observados por séries de oligonucleótidos. F) A validação das alterações de proteínas identificadas por SILAC em Western blot de extractos proteicos obtidos a partir de células T24-T24T. G) Imunohistoquímica em matrizes de tecido contendo tumores de bexiga serviu para validar associações de proteínas identificadas com variáveis ​​clínico-patológicas em câncer de bexiga. H) silenciamento siRNA de proteínas identificadas e análises funcionais subsequentes e validação immunoblotting serviu para avaliar o impacto dos actos identificados no fenótipo agressivo de T24T eo regulamento de outras proteínas diferencialmente expressos identificados pelo SILAC.

Materiais e Métodos

1. A análise funcional de T24 e T24T células cancerosas da bexiga

cultura celular.

T24 foi obtida a partir da American Type Culture Collection e cultivadas tal como descrito anteriormente [32], [33]. T24T foi derivado a partir de T24 no laboratório do Dr. Theodorescu [5] – [9]. As células foram cultivadas durante 4-6 passagens e colhidos em 75% -90% de confluência. As pelotas de células foram lavadas três vezes em PBS frio e congeladas a -20 ° C antes da extracção de ARN e proteína.

ensaio de proliferação

1,2×10

4 culas por po foram semeadas em placas de 96 Bem placas, em triplicado, em DMEM contendo 10% de FBS. Após cultura durante 24, 48, 72 e 96 horas, a proliferação foi medida com o ensaio MTT (Roche, Mannheim, Alemanha).

ensaio de cicatrização de feridas.

3.5×10

5 células foram semeadas em placas de 6 poços, e uma ferida foi feita em monocamada utilizando uma ponta de pipeta estéril, uma vez que as células atingiram a confluência. Fotografias de células que invadem o ferimento foram tomadas nos horários indicados.

ensaio de invasão.

cultura de células de 24 poços placas inserções (tamanho de poro de 8 um, BD Biosciences, San José, CA) foram semeado com 2,5×10

4 T24 e T24T células, e também com as células T24T após 24 e 48 horas pós-transfecção com Cul3 siRNA (50 nM) em 500 uL de meio DMEM com 0,1% de FBS na câmara superior. O meio com FBS a 10% (500 mL) foi adicionada à câmara inferior, como um agente quimiotáctico. câmaras de matrigel invasão (BD) foram mantidos durante 24 horas numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% de CO

2 atmosfera. As células de ambos os lados da câmara de Matrigel foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 10 minutos, lavadas com PBS, coradas com 1 ug /ml de 4′-6-diamidino-2-fenilindole (DAPI: Sigma, St. Louis, MO) durante 10 minutos , e analisadas por microscopia confocal (Leica TCS-SP5, Wetzlar, Alemanha). O número de células invasoras foi avaliada com o software Imaris (plano de bits, Zurich, Suíça), calculando a percentagem de invasão como:.. Número de invadir células /número de células totais × 100

Cul3 silenciamento

Cul3 knocked-down foi realizada em T24T por transfecção transiente com Lipofectamina (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando o controle (não-alvo) pequena interferência RNA de cadeia dupla (siRNA) ea piscina inteligente siRNA dirigido contra Cul3 (ambos de Dharmacon, Waltham, MA). Cul3 silenciar transfectantes expostos a 50nM e 100 Nm de siRNA alvo foram coletados, às 24h e 48h para ensaios de proliferação, migração ou invasão, como descrito acima. Cul3 silenciamento foi confirmada por immunoblotting.

2. SILAC perfis proteína

Cultura celular e metabólica de rotulagem.

células T24 e T24T foram mantidas em lisina e arginina-empobrecido DMEM (Millipore, Billerica, MA), suplementado com FBS dialisado a 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 unidades /mL de penicilina /estreptomicina (Invitrogen) e ou de ocorrência natural abundâncias de isótopos ( “luz”) (T24) ou de isótopos estáveis ​​marcado ( “heavy”)

13C

6 lisina e

13 C

6 ácidos aminados arginina (Cambridge Isotope Labs, Andover, MA) (T24T). Os meios de cultura foi trocado a cada 2 dias, removendo metade do volume presente em cada placa e substituindo-o por meio fresco. As células foram cultivadas durante pelo menos 6 duplicações para permitir a incorporação total de aminoácidos marcados. Duas repetições SILAC grande escala (2 × 10

7 células por condição) foram realizadas. incorporação completa de

células T24T após seis divisões celulares em meio isotopicamente pesado (direta e reversa rotulagem) 13C-Arg e

13 C-Lys em T24 e foi verificada por MS de uma proteína digerir.

fracionamento de proteína.

Para reduzir a complexidade da amostra, foi realizado um processo de fraccionamento nuclear /citosol. As células foram lisadas num tampão de lise (20 mM de HEPES, pH 7,0, KCl 10 mM, MgCl 2 mM, 0,5% de Nonidet P40, Na 1 mM

3VO

4, 1 mM de PMSF, 0,15 U ml

-1 aprotinina) e homogeneizou-se por 30 movimentos num homogeneizador de Dounce. O homogenato foi centrifugado a 1500 g durante 5 min para sedimentar os núcleos. O sobrenadante foi então resedimented a 15000 g durante 5 min, e o sobrenadante resultante formou a fracção não-nuclear ou citosol. O sedimento nuclear foi lavada três vezes e novamente suspensas no mesmo tampão contendo NaCl 0,5M. O material extraído foi sedimentado a 15.000 g durante 10 min e o sobrenadante resultante foi denominado a fracção nuclear.

de SDS-PAGE em gel e a digestão.

Proteínas em citosólica e fracções nucleares foram separadas por SDS-PAGE em géis de 10% SDS-poliacrilamida. Um total de 80 ug de proteína foi carregada por pista. Após a electroforese, as proteínas foram visualizadas por coloração com azul Coomassie e a pista de gel foi cortado horizontalmente em 20 secções. bandas de gel excisado foram cortadas em pedaços pequenos e descorados em 50:50 de bicarbonato de amónio a 25 mM /acetonitrilo, desidratou-se com acetonitrilo e secou-se. Os pedaços de gel foram re-hidratadas com 30 uL de 12,5 ng /mL de solução de tripsina em bicarbonato de amónio 25 mM e incubadas durante a noite a 37 ° C. Os péptidos foram extraídos utilizando acetonitrilo e 5% de ácido fórmico, foi seca por centrifugação sob vácuo e ressuspensa em 15 ul de acetonitrilo a 2% em ácido fórmico a 0,1%. Todas as amostras foram sonicadas durante 10 min antes de análise por MS.

Nanofluxo LC-MS /MS.

A mistura de péptidos a partir de digestões com tripsina em gel (utilizando 30 ul de tripsina a 12,5 ng /mL ) foi analisada utilizando nanofluxo LC-MS /MS. Os péptidos foram carregados numa coluna de armadilha (Reprosil C

18, 3 ^ M de tamanho de partícula, 0,3 × 10 mm, 120 A de tamanho de poro, SGE) e, em seguida, eluiu-se a coluna analítica (Acclaim PepMap 100, C

18, 3 ^ M de tamanho de partícula, 75 um x 15 cm, tamanho do poro de 100 Á, Dionex, LC Packings) com um gradiente linear de 5-80% de acetonitrilo em ácido fórmico a 0,1%. A amostra foi entregue ao longo de 120 min de um ultra-1D nano-LC mais sistema (Eksigent) a uma velocidade de fluxo de 200 nL /min para um aço inoxidável nano-furo emissor (OD 150 um, ID 30 um, Proxeon, Odense, Dinamarca) . Os péptidos foram verificados e fragmentada com um ião linear espectrómetro de massa de armadilha de LTQ XL (Thermo, San Jose, CA) operado no dependente de dados ZoomScan e MS /MS modo de comutação usando os três precursores mais intensas detectados num varrimento levantamento 400-1600 u (três μscans). ZoomScan janela massa foi definido como 12 Da permitindo o acompanhamento de todo o

12C /

13 C envelope isotópica da maioria dos peptídeos duplamente e triplamente carregados. iões de carga única foram excluídos por análise de MS /MS. energia de colisão normalizado foi ajustado para 35% e de exclusão dinâmica foi aplicada durante 3 períodos mínimo para evitar íons de fragmentação repetitivas.

Identificação de proteínas e quantificação.

Criação .raw arquivos foram convertidos para arquivos .mgf para a pesquisa de banco de dados MASCOTE. Um banco de dados que contém as sequências NCBInr Homo Sapiens contendo 34180 entradas de proteína (a partir de 04-03-2008) foi pesquisada utilizando MASCOTE Software (versão 2.3 Matrix Science) para a identificação de proteínas. Critérios de pesquisa incluídos especificidade de tripsina com uma clivagem perdeu permitido, e oxidação da metionina,

13 C-Arg e

13 C-Lys como modificações variáveis. A precisão precursor mínimo fragmento de iões de massa de 1,2 e 0,3 Da, respectivamente, e uma exigência de pelo menos dois negrito vermelhos (peptídeos exclusivos) por proteína foram necessários para quantificação de proteínas. Os valores-limite para os escores MASCOTE de peptídeos e proteínas foram definidos para 39 (

p Art 0,05) e 46 (

p Art 0,01), respectivamente, para considerá-los identificações tão precisos . A taxa de falsos positivos foi calculada procurando o mesmo espectro contra os NCBInr Homo Sapiens chamariz do banco de dados randomizado. índices de quantificação relativas de proteínas identificadas foram calculados utilizando QuiXoT (versão 1.3.26). rácios /T24 SILAC T24T foram definidas pelas intensidades dos péptidos pesados ​​(C

13), dividido por as intensidades dos péptidos leves (C

12). rácios de proteínas obtido por QuiXoT foram verificados manualmente para todos os péptidos. Uma proporção de

13C

6-Arg foi convertido em

13C

5-Pro ​​levando a uma redução na intensidade do pico de péptido marcado com isótopo; esta foi corrigida para todos os péptidos que contêm um ou mais resíduos de prolina por adição a intensidade encontrados para o péptido contendo

13C

6-Arg

13C

5-Pro ​​ou

13C

6 Lis

13 C

5-Pro ​​com a intensidade do pico contendo apenas

13 C

6-Arg ou

13 C

6-Lys. Uma lista combinada de proteínas identificadas em todas as experiências foi condensada a 80% de homologia utilizando o pacote de software ProteinCenter (Proxeon Bioinformatics AS, Odense, Dinamarca), para remover os IDs redundantes, tais como sequências de humanos ortólogos, as entradas do banco de dados redundantes, e isoformas distinguíveis com base no péptido observada cobertura. Localização subcelular e os processos funcionais das proteínas identificadas por SILAC foram atribuídos com base no conhecimento biológico disponível em Gene Ontology (GO) anotações. O software Ingenuity Pathway (IPA) também foi usado para fornecer informações sobre redes biológicas [33], [34].

3. Gene Expression Profiling com Oligonucleotide Arrays

extracção de ARN.

O ARN total foi isolado utilizando TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA), seguido por purificação RNeasy. a qualidade do RNA foi avaliada com base na 260:280 rácios de absorvância, e integridade foi verificada por electroforese em gel usando o Bioanalyzer 2100 (Agilent, Palo Alto, CA) [32], [34].

matrizes de genes.

ADN complementar foi sintetizado por

in vitro

transcrição a partir de 1,5 ug do ARN total purificado utilizando um T7-oligo (dT) Primer Promotor Ensaio (Affymetrix, Santa Clara, CA), marcado com biotinilado nucleotídeos (Enzo Biochem, Farmingdale, NY), e hibridizado para testar GeneChips (Affymetrix), para avaliar a qualidade da amostra antes de hibridação para as GeneChips U133A humanos contendo 22,283 sondas que representam genes conhecidos e etiquetas de seqüências expressão (Affymetrix) [34].

a análise dos dados.

arquivos de imagens digitalizadas foram inspeccionadas visualmente para artefatos e analisados ​​usando o Affymetrix Microarray Suíte 5.0 (MAS 5.0). A expressão diferencial foi avaliada por meio de sinais como a medida principal resposta extraído para cada gene em todas as amostras, conforme determinado pelas configurações padrão do MAS 5.0. Correlações entre rácios de genes e proteínas foram analisadas pelo teste tau de Kendall. Para comparar SILAC e oligonucleotídeos matrizes resultados, a probabilidade cumulativa de resultados esperados e observados foram representados em toda a gama de relações de expressão diferencial.

4. Validação por imunotransferência

A proteína total foi extraído a partir de células de cancro da bexiga utilizando tampão de lise RIPA e quantificados com o ensaio de Bradford utilizando BSA como padrão (Ensaio de Proteína, da Bio-Rad, Hercules, CA). extractos de proteína total (50 ug) foram misturadas com tampão de amostra 5X de SDS (62,5 TrisHCl mM [pH 6,8], SDS a 2%, glicerol a 10%, 5% β-mercaptoetanol, 0,005% de azul de bromofenol) e resolvido por SDS-PAGE em 10 géis% de acrilamida. As proteínas foram electrotransferidas para membranas de PVDF (Millipore, Bedford, MC) e activação com metanol. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite seco não gordo em PBS e Tween-20 a 0,1% durante 1 hora à temperatura ambiente e incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários contra: Annexin2 (39 kDa, rato, 1:2000, # 610068 , BD Transduction Laboratories, San José, CA EUA), Bcas2 (26 kDa, rato, 1:6000, # H00010286-M01, Abnova, Heidelberg, Alemanha), L-caldesmona (80 kDa, rato, 1:100, # C56520, BD Transduction Laboratories), calreticulina (48 kDa, coelho, 1:5000, # C4606, Sigma, St. Louis, MO, EUA), Caveolin1 (20-22 kDa, rato, 1:100, # C37120, BD Transduction Laboratories) , cdc2 (34 kDa, coelho, 1:1000, # SC-954, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, EUA), CD44 (80 kDa, rato, 01:50, # NCL-CD44v3, Novocastra, Wetzlar, Alemanha) , Copine3 (38 kDa, coelho, 1:100, gentilmente cedida pelo Dr. Piris, localizado na CNIO, Madrid, Espanha), Cul3 (89 kDa, coelho, 1:100, # RB1575PCS, NeoMarkers, Fremont, CA, EUA) , Cytokeratin18 (48 kDa, rato, 1:100, # IF14, Oncogene-Merck, Darmstad, Alemanha), DDX21 (87 kDa, coelho, 1:3500, # 10528-1-AP, Proteintech, EUA), DNMT1 (183 kDa, rato, 1:100, # IMG-261, IMGENEX, San Diego, CA, EUA), dinactina p50 (44 kDa, rato, 1:100, # D74620, BD Transduction Laboratories), Dynamin (mouse, 97 kDa, 1:5000, # D25520, BD Transduction Laboratories,), EGFR (175 kDa, rato, 1:100, # GRO1, Oncogene-MERCK), Ezrin (80 kDa, rato, 1:7000, # E8897, Sigma), Filamin A (250 kDa, rato, 1:50, # NCL-FIL, Novocastra, UK), gelsolina (47 kDa, rato, 1:100, # G4896, Sigma), HSP70 (70 kDa, rato, 1:200, # SC-66048, Santa Cruz), importin 9 (116 kDa, cabra, 1:100, sc-103567, Santa Cruz), MCM6 (92 kDa, coelho, 1:200, gentilmente cedida pelo Dr. Mendez, localizado na CNIO, Madrid, Espanha), MAPK-4 (65 kDa, coelho, 1:1000, SC-68169, Santa Cruz), moesin (68-77 kDa, rato, 1:50, # MS-727-P0, NeoMarkers), MSH6 (152 kDa, rato, 1:200, # 610918, BD Laboratories transdução), nucleofosmina /B23 (32kDa, rato, 1:5000, # 18-7288, Zymed, SF, CA, EUA), NUP133 (133 kDa, rato , 1:500, # SC-101290, Santa Cruz), Rab14 (23 kDa, coelho, 1:100, # PRO-873, Avivasybio, San Diego, CA), RCC1 (44 kDa, cabra, 1:300, # SC-1161, Santa Cruz), VDAC (30 kDa, coelho, 1:100, # 4866, Cell Signaling, Beverly, MA). As manchas foram lavadas em PBS e 0,1% de Tween-20, e incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano durante 1 h à temperatura ambiente: anti-murganho (1:1000), anti-coelho (1:2000) e anti-cabra ( 1:2000, todos Dako, Glostrup, Dinamarca). A ligação do anticorpo foi visualizada utilizando um sistema de detecção quimioluminescente melhorado imunotransferência (ECL, GE Healthcare). a-tubulina (50 kDa, rato, 1:4000, # T5168, Sigma) foi utilizado como controlo de carregamento e de normalização. Imunotransfer�cias foram escaneados e analisados ​​utilizando o software ImageJ1.43u (Wayne Rasband, Instituto Nacional de Saúde).

5. A avaliação clínica da expressão de metástases relacionados biomarcadores

As amostras de tecido e microarrays.

Sete de cancro da bexiga microarrays de tecido feito à medida foram construídas na Tumor Markers Grupo incluindo triplicado ou núcleos quadriplicate (1,0 mm) dos tumores de bexiga primários (n = 284) na sequência de desenhos aleatórios. tumores embebidos em parafina para a construção de arranjos de tecidos foram recolhidos e tratados anonimamente seguindo as diretrizes de proteção éticas e legais de seres humanos após a aprovação por escrito consentimento e Institutional Review Board (IRB) protocolos correspondentes ao SAF2009-13035 projeto de pesquisa em instituições colaboradoras aprovado: Fundació Puigvert e Hospital Central de Asturias. As informações demográficas indicou a presença de 251 machos e 33 fêmeas, com uma idade média de 66,0 anos (variação: 25-81). distribuição estágio do tumor foi: pT1 (n = 87), pT2 (n = 121), pT3 (n = 48) e pT4 (n = 28), e distribuição grau do tumor foi: baixo grau (n = 58) e de alta grau (n = 226), definida de acordo com critérios de consenso [35]. Dois destes microarrays de tecido, incluindo um conjunto de 71 músculo-invasiva (pT2 +) alto grau tumores de bexiga de CTP com o estatuto de linfonodo conhecido metastático (N0 = 37, N + = 34). Clínico-patológicas e anotados de acompanhamento de informação permitidos associações de Cul3 com histopatologia e resultado.

imuno-histoquímica.

A expressão de proteínas de Cul3 foi avaliada por imuno-histoquímica em microarrays de tecido, utilizando procedimentos imunoperoxidase avidina-biotina. recuperação de antigénios (ácido cítrico 0,01%, durante 15 minutos, sob micro-ondas) foi empregue antes da incubação durante a noite a 4 ° C com o anticorpo de coelho Cul3 utilizado em imunotransferência (1:300 diluição). A ligação do anticorpo foi detectada com um anticorpo de cabra biotinilado anti-coelho secundário (1:1000, Vector Laboratories). Ausência de anticorpo primário foi usado como controlo negativo. Testículo foi utilizado como controlo positivo. Diaminobenzidina foi utilizada como cromógeno final e hematoxilina como o contraste nuclear [32] -.. [34]

Análise Estatística

Meios de resultados de dois observadores independentes de todos os núcleos de cada amostra de tumor vestidos foram utilizados para análises estatísticas. Associações de expressão Cul3 por imuno-histoquímica com o grau palco e histopatológicos do tumor foram avaliados utilizando os não-paramétricos de Wilcoxon-Mann-Whitney e Kruskall-Wallis testes [36]. Cul3 expressão foi avaliada como uma variável contínua com base no número de células que expressam a proteína no núcleo. A intensidade da coloração foi classificada como negativa (-), para baixo (+), intermediário (++) e elevado (+++). Para além da localização intracelular, também foi avaliada a se a proteína estava presente ou não na matriz extracelular que rodeia as células neoplásicas. Cul3 nível de corte para avaliação prognóstica foi selecionada com base em valores de expressão medianos entre os grupos sob análise. Associação de Cul3 com a sobrevivência específica da doença foi avaliada pelo teste de log-rank em casos com disponíveis follow-up. tempo de sobrevida específica da doença foi definida como os meses se passaram entre a ressecção transuretral ou cistectomia ea morte como resultado de uma doença (ou a última data de follow-up). Pacientes vivos no último follow-up ou perdidos para follow-up foram censurados. As curvas de sobrevida foram plotados utilizando metodologia de Kaplan-Meier [36]. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote estatístico SPSS (versão 17.0).

Resultados

Análises funcionais

in vitro

Vários aspectos agressividade de células T24-T24T foram inicialmente analisados. T24T teve taxas de proliferação significativamente mais elevados do que T24 nos quatro momentos estudados (p 0,05, Figura 1A). ensaios de invasão T24 indicou que estavam, em média, 50% menos invasiva do que as células T24T às 48h (Figura 1B). Ferida ensaios de cura revelou taxa de migração significativamente mais rápido para T24T (Figura 1C). I

n vitro

ensaios sugeriu que as células T24T teve fenótipos mais agressivos.

mudanças na abundância de proteína entre as células T24 e T24T usando SILAC

Um total de 1830 proteínas foram identificadas em os dois experimentos SILAC, a partir do qual 831 foram simultaneamente identificados em ambas as repetições e passaram os critérios estabelecidos para a quantificação de proteínas. A taxa global de descoberta de falsas foi de 2,1% estimada pelo número de sucessos contra a sequência inversa /hits total (p 0,01). O desvio médio relativo padrão (SD) dos rácios obtidos a partir de repetições foi de 0,24, indicando uma boa concordância entre os experimentos.

Em relação à distribuição rácios SILAC, a maioria das proteínas identificadas estavam dentro da faixa de relação SILAC entre 1,5 e 0,67, como esperado quando se analisa linhas celulares estreitamente relacionados em uma mistura 01:01 de proteína (Figura 2A). Usando 1,5 como a razão de limiar, 289 proteínas foram diferencialmente expressos entre as duas linhas de células, 88 dos quais foram mais abundantes no T24T. Entre as 289 proteínas diferencialmente expressas (Tabela S1), o quadro 1 inclui essas proteínas anteriormente relacionados com a bexiga metástases cancerosas, e aqueles validado por imunotransferência. A lista completa de proteínas identificadas em ambas as repetições (n = 831), utilizando SILAC é na Tabela S2.

As proteínas foram classificadas e traçados pela relação SILAC. Tal como esperado para uma mistura de 01:01, a maioria das proteínas mostrou uma proporção SILAC dentro dos pontos de corte de 1,5 e 0,67. Classificação das proteínas identificadas com base em suas anotações funcionais usando o Gene Ontology: B) Função Molecular, C) Os processos biológicos e D) componentes celulares. Estas análises foram realizadas com as 289 proteínas encontradas para ser expresso diferencialmente. Quando mais de uma atribuição estava disponível para uma determinada proteína, todas as anotações funcionais foram consideradas nas análises. Estas classificações são redundantes (mais de 100%) como proteínas poderiam ser anotado em mais de uma atribuição.

Classificação funcional das proteínas identificadas

A anotação funcional do 289 proteínas diferencialmente expressos em células T24 e T24T foi inicialmente atribuído usando o software Centro de proteína. Três tipos principais de anotações foram obtidos a partir de GO site consórcio: componentes celulares, funções moleculares, e processos biológicos (Figura 2B, C, D). Uma abordagem GOslim definido especificamente para ProteinCenter reduziu as múltiplas anotações ir para um conjunto razoável de cerca de 20 termos de alto nível que foram usados ​​para filtrar as informações em estimativas percentuais. funções moleculares principais incluíram actividade catalítica (67%) de ligação de proteínas (78%) ou. processos metabólicos (84%) e organização celular e biogênese (54%) eram processos biológicos frequentes. distribuição anotação proteína apoiou os

in vitro

ensaios funcionais descritos acima ligando reorganização celular com fenótipos migração e invasão (Figura 1). Um elevado número de proteínas localizadas no citoplasma (87%) foi encontrada em comparação com o núcleo (48%). Esta observação levou-nos a concentrar em proteínas que poderiam desempenhar um papel relevante na reorganização do citoesqueleto eo fenótipo agressivo de T24T.

Comparação dos rácios de expressão gênica e protéica

rácios de expressão de proteínas SILAC foram comparados com a expressão de ARNm fornecida por microarrays de oligonucleótidos para os candidatos identificados por ambos os métodos (N = 438) (Tabela 1, Tabela S3). Um coeficiente de correlação positiva (Kendalls tau) de 0,206 (P 0,0005) foi obtida (Figura S1A). Importante, a relação de expressão da proteína SILAC mediana foi de 0,98 para estes candidatos (intervalo: 0,16-9,44), que era semelhante à mediana de 1,02 observado para séries de oligonucleótidos (intervalo: 0,01-100,80). Excluindo dois outliers detectados por ambas as técnicas de aumento do coeficiente de correlação de 0,210 (P 0,0005, N = 438: Figura S1B). Para interpretar as diferenças entre o esperado e as correlações observadas entre o ARN e a expressão de proteínas, a probabilidade cumulativa da proporção observada para a expressão diferencial foi representada contra a proporção esperada de ambas as técnicas (Figura S1C, D). Os números em destaque as faixas mais amplas da expressão diferencial observada em séries de oligonucleótidos quando comparado com os mesmos candidatos nas análises SILAC.

Validação de SILAC identificou candidatos usando immunoblotting

Para validar proporções de proteínas identificadas expressão SILAC em ambos os replicados, immunoblotting foi realizado (Figura 3). A expressão aumentada em T24T foi observado para gelsolina, Cul3, importinas, nucleoporina e EGFR, e a diminuição da expressão foi encontrado para a ezrina, moesina, filamina, caveolin ou CD44, entre outros. As imunotransferências foram quantificadas para correlacionar com rácios de expressão obtidos por SILAC e em matrizes de genes. Com base na boa concordância destas observações para Cul3, uma proteína conhecida por estar envolvida na ubiquitinação e subsequente degradação de proteínas alvo, foi seleccionado para posteriores análises para: a) avaliar a sua relevância clínica como um candidato biomarcador para avaliar o comportamento clínico agressivo e b) para avaliar o impacto Cul3 no fenótipo agressivo de T24T e na modulação da expressão de outras proteínas diferencialmente expressos identificados por SILAC. Figura S2 mostrou a validação adicional por imunomanchas de candidatos expressos diferencialmente em células T24T em séries de oligonucleótidos que não foram quantificados por SILAC, e

vice-versa, para que os anticorpos estavam disponíveis. Não foram observadas diferenças significativas nos pesos moleculares experimentais em comparação com tamanhos previstos.

(A) A validação dos resultados SILAC de proteínas selecionadas em imunotransfer�cias de extratos de proteína das células de câncer de bexiga analisados. Os resultados comprovaram os níveis de proteínas identificadas pela abordagem proteómica, incluindo diferencialmente e não-candidatos expressos diferencialmente expressão. Os anticorpos que apresentam uma única banda predominante nos pesos moleculares esperados foram aceites: e α-tubulina foi utilizada como controlo de carregamento. GSN, gelsolina; Cul3, Cullin 3; IPO9. Importina 9; EGFR, do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico; NUP133, nucleoporina 133; HSP70, proteína de choque térmico 70 kDa; MCM6, minichromosome manutenção de componentes Complexo 6; RCC1, regulador do cromossomo Condensação 1; BCAS2, carcinoma da mama Amplified Sequence 2; DNM, Dynamin; NPM, nucleofosmina; DCTN, dinactina; Calr, calreticulina; MAPK, Mitogen-Activated Protein Kinase; DDX21, DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) caixa de polipeptídeo 21; CDC2: Cell Cycle Divisão 2; DNMT1, DNA (cytosine-5) -metiltransferase 1; MSH6, MutS homólogo 6; RAB14, GTPase Rab14; VDAC, Voltage-Dependent Anion Canal; CK18, Cytokeratin 18; CALD, caldesmona; CD44, CD44 antigénio isoforma um precursor 2; Esdras, Ezrin; MSN, moesin; ANXA2, anexina A2; CPNE3, Copine 3; FNLA, Filamin A;