Abstract

YM155, que inibe a survivina proteína anti-apoptótica, é conhecido por exercer efeitos anti-tumorais em vários tipos de câncer, incluindo câncer de próstata e pulmão. No entanto, existem alguns relatos que descrevem o efeito inibidor de YM155 em cancros pancreáticos humanos que expressam altamente survivina. Aqui, nós testamos os efeitos de YM155 sobre uma variedade de linhas celulares de cancro, incluindo células de cancro do pâncreas. Descobrimos que YM155 exerce um efeito anti-proliferativo em células de cancro do pâncreas, induzir a morte de células através da supressão de XIAP (inibidor ligada ao X de apoptose), bem como survivina sem afectar as proteínas anti-apoptóticas Bcl-xL ou Mcl-1. YM155 crescimento do tumor também inibiu

In vivo

, reduzindo o tamanho da linha celular de cancro pancreático MiaPaCa-2 xenoenxertos de 77,1% no dia 31. As análises de transferência de Western mostrou que ainda YM155 downregulated phosphoinoside 3-quinase expressão (PI3K) e reduzido os níveis de quinase fosforilada (activada) regulada por sinal extracelular (ERK) e STAT3 (transdutor de sinal e activador da transcrição 3) em células PANC-1. Curiosamente, também descobrimos que YM155 regulada negativamente o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), em várias linhas celulares de cancro e induziu a fosforilação do EGFR e ubiquitinação do EGFR em células PANC-1. YM155 modestamente também promoveu a ubiquitinação da survivina e XIAP. Portanto, YM155 age através da modulação de EGFR e expressão survivin para reduzir posteriormente a sobrevivência. Sugerimos que YM155 tem potencial como agente terapêutico no tratamento de cancro pancreático

citação:. De Na Y-S, Yang S-J, Kim S-H, Jung K-A, Lua J-H, Shin J-S, et al. (2012) YM155 Induz EGFR Repressão em células de cancro do pâncreas. PLoS ONE 7 (6): e38625. doi: 10.1371 /journal.pone.0038625

editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Alemanha |

Recebido: 10 de novembro de 2011; Aceite: 12 de maio de 2012; Publicado: 18 Junho 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Na et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios da Coreia do Saúde 21 R D do Projeto, Ministério da Saúde, Bem-Estar e Assuntos da família, República da Coreia (A062254). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de pâncreas é uma doença maligna altamente agressivo. Apesar dos avanços terapêuticos, o prognóstico de pacientes com câncer de pâncreas é extremamente pobre. O mau prognóstico de pacientes com câncer pancreático é atribuível à tendência desse tipo de câncer a responder mal à quimioterapia. Embora a gemcitabina análogo de nucleosídeo é atualmente o agente quimioterápico padrão usado em câncer pancreático, o seu benefício de sobrevivência é agentes terapêuticos insatisfatórios e romance são desesperadamente necessários [1].

A sobre-expressão de survivina, o menor membro (16,5 kDa) do inibidor de apoptose (IAP) da família de proteínas, tem sido relatado para ser importante no desenvolvimento e progressão do cancro pancreático [2], [3]. Survivina contém uma repetição único baculovirus IAP (BIR) e interage com proteínas cromossómico de passageiros, NES (nestina), quinase Aurora B, SMAC /DIABLO, CDK1 (cinase dependente de ciclina 1), PKA (proteína cinase A), de XIAP, e calor proteína de choque (HSP) -90 [2], [3]. Survivina localiza-se no citoplasma, mitocôndrias e núcleos, e é expressa ubiquamente em estágios embrionários, mas não é detectável em tecidos adultos normais terminalmente diferenciadas [2], [3]. Patologicamente, survivin é sobre-expresso em muitos cancros humanos, incluindo o cancro do pâncreas [2], [3]. Como survivina é altamente expresso em tecidos tumorais pancreáticas, mas não em tecidos normais do pâncreas, é um alvo atractivo para o desenvolvimento de medicamentos contra o cancro pancreático [4].

YM155, um inibidor de molécula pequena de survivina desenvolvido pela Astellas Pharma , Inc., que está actualmente a ser submetido a ensaios clínicos, suprime a transactivação de survivina através da ligação directa ao seu promotor [5]. YM155 foi examinada em vários tipos de células de cancro, incluindo melanomas e linfomas, bem como próstata, pulmão e cancros da mama [6]. modelos de xenoenxerto também demonstraram a eficácia anticancerígena de YM155 em combinação com compostos de platina [7] ou o docetaxel [8], bem como em monoterapia [9].

O receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), que é sobre-expresso em vários cancros e tem sido investigada em relação ao prognóstico do cancro [10], [11], [12], é conhecida por ser um factor importante na progressão do cancro pancreático [13]. A ligação de um ligando ao EGFR promove mudanças conformacionais que induzem a dimerização do receptor, resultando em autofosforilação de tirosina e a activação do receptor. Os sinais de EGFR activados através de resíduos de tirosina fosforilados para estimular a múltiplas vias, incluindo a proteína quinase activada por mitogénio (MAPK), fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /Akt, transdutores de sinal e activadores da transcrição (STAT), fosfolipase C, e src /focal quinase de adesão (/FAK Src) vias. A activação de sinalização de EGFR desempenha um papel importante na promoção da proliferação e sobrevivência; Por outro lado, a interrupção do EGFR promove a apoptose. terapêutica alvo EGFR, tal como erlotinib, têm sido desenvolvidos para o tratamento de cancro pancreático.

YM155 demonstrou actividade antitumoral em linhas celulares de cancro pancreático [14]. Por outro lado, em células de cancro da mama, a expressão de survivina foi reportado ser regulada pelo EGFR através da via PI3K /AKT, uma outra via importante em cancros pancreáticos [15]. Portanto, parece possível ter o efeito de YM155 em EGFR e sua sinalização a jusante em células de cancro do pâncreas porque survivin é regulada com EGFR.

Neste estudo, foram avaliados os efeitos anticancerígenos de YM155 em linhas celulares de cancro do pâncreas e xenoenxertos. Além disso, foi investigado o efeito de YM155 em EGFR, PI3K, ERK, e expressão da STAT3 YM155 para determinar se afecta as vias EGFR /PI3K /STAT3. Investigou-se também o efeito de YM155 sobre a expressão de outros membros da família IAP relacionado com proteínas anti-apoptóticas e pro-apoptóticas em linhas celulares de cancro pancreático.

Resultados

células de cancro do pâncreas são sensível à YM155

para investigar a capacidade anti-proliferativa de YM155 em várias linhas celulares de cancro, nós medimos IC

50 valores para o YM155 em pancreático, gástrico e colorectal células cancerosas (Tabela 1 e Tabela S1) . O IC

50 valores para o YM155 em pancreática, gástrica, e linhas celulares de cancro colorrectal foram 3,7-30,3, 1,4-140,8, e 8,7-370,0 nM, respectivamente. Assim, YM155 é eficaz no pâncreas, gástrico, e células de cancro colorrectal.

Para determinar o efeito do inibidor de YM155 survivina sobre a expressão de XIAP e de survivina, um outro membro da família de IAP, foi realizada western blot em linhas celulares de cancro pancreático e gástrico (Fig. 1A e Fig. S1). Em concentrações elevadas, YM155 diminuíram significativamente a expressão de survivina em PANC-1, MiaPaCa-2, BxPC-3, linhas celulares KATOIII, e MKN45. YM155 foi notavelmente mais potente em células PANC-1, em que a diminuição da expressão de survivina a uma baixa concentração (10 nM). YM155 também inibiu a expressão de XIAP em linhas celulares de cancro pancreático e gástrico, excepto para células MKN45; nestas células, YM155 não teve qualquer efeito perceptível sobre os níveis de XIAP. Em conformidade com as observações anteriores [9], [16], YM155 mostrou pouco efeito sobre a expressão das IAP, cIAP1 e cIAP2, em linhas de células do cancro do pâncreas (Fig. S2).

A, Concentração dependente efeitos de um tratamento de 24 horas com YM155 sobre a expressão de XIAP e de survivina em PANC-1, MiaPaCa-2, e as células BxPC-3 foram determinados por Western blotting. B, o efeito de YM155 sobre a expressão de XIAP foi comparada com a de survivina knockdown por Western blotting. células PANC-1 foram tratados com o YM155 durante 24 horas ou transfectadas com 40 nM de ARNsi (siSurvivin, siXIAP, e mexidos siARN) durante 48 horas. *, Não específica. C, efeitos dependentes da concentração de YM155 sobre a expressão de anti-apoptótica (Bcl-xL e Mcl-1) e pró-apoptótica de proteínas (bid e mau) foram examinados em PANC-1, MiaPaCa-2, e as células BxPC-3 .

para determinar se a regulação negativa induzida YM155 de expressão XIAP é devido à redução da expressão de survivina, nós derrubado survivina em PANC-1 com siRNA (siSurvivin) e expressão de XIAP avaliada por Western blot (Fig . 1B). O nível de proteína XIAP diminuiu em maior extensão, após exposição a 10 nM YM155 do que em células transfectadas com siSurvivin, sugerindo que a diminuição induzida em níveis YM155 XIAP não ocorre através da regulação negativa de survivina. Survivina tem sido relatado para ter locais de ligação para XIAP [2]. Para examinar o efeito de YM155 em interacções survivina-XIAP, que imunoprecipitada survivina e depois sondado imunoprecipitados por transferência de Western com um anticorpo contra XIAP (Fig. S3). Tratamento de PANC-1 de células com 100 nM de YM155 durante 6 horas não teve nenhum efeito sobre os níveis de survivina ou de XIAP, mas inibiu ligeiramente a interacção de survivina com XIAP, sugerindo que YM155 afecta a montagem do complexo de survivina-XIAP em alguma extensão .

investigou-se também os efeitos de YM155 sobre a expressão das proteínas anti-apoptóticas e pro-apoptóticas em linhas celulares do cancro do pâncreas (Fig. 1C). Não houve alteração na Bcl-xL ou níveis de Mcl-1 após tratamento com YM155. YM155 induziu uma diminuição dependente da concentração no Bid, p-Bad, e os níveis de ruim em linhas celulares de cancro mais pancreáticas; a exceção foi Bid, que não foi afetada em células BxPC-3.

YM155 induz a regulação negativa da PI3K, p-ERK, e p-STAT3

Porque YM155 suprimida a expressão de XIAP, examinamos se YM155 afectou a expressão de outros componentes de sinalização em células de cancro do pâncreas. O tratamento de células MCF7 que sobre-expressam HER2 com o inibidor de PI3K LY294002 ou ERK1 U0126 inibidor /2 foi avaliado para regular negativamente a survivina [17]. Um inibidor de STAT3 foi também relatada para suprimir a expressão de survivina [18]. Com base nestes relatórios, foram investigados os efeitos do YM155 em PI3K, ERK, e STAT3 em células PANC-1 (Fig. 2), que tínhamos encontrado para ser o mais YM155-sensível das linhas de células pancreáticas testados. O tratamento destas células com YM155 em concentrações de 10 nM e acima diminuiu PI3K (Fig. 2A), P-ERK (Fig. 2B), e p-STAT3 (Fig. 2C) em comparação com os níveis em células tratadas com siSurvivin. O inibidor de PI3K LY294002 e MEK1 /2 AZD6244 inibidor foram utilizadas como controlos para analisar os níveis de PI3K, ERK fosforilada e survivina. Examinámos também os efeitos de YM155 sobre a expressão da PI3K membros da família p110α, p110β, classe III, p85, e p-p85 em PANC-1, MiaPaCa-2, e as células BxPC-3, e descobriram que todas foram reduzidos por 100 nM YM155 em todas as três linhas de células (Fig. S4). Além disso, a fosforilação da Akt, que é um efector a jusante de PI3K, foi também reduzida por YM155 (100 nM) nestas linhas celulares do cancro do pâncreas. Akt é conhecida por promover a sobrevivência celular através da fosforilação de Bad [19], [20]. Por conseguinte, uma redução sob a forma fosforilada de Akt induz uma diminuição da p-Bad, como mostrado na Figura 1C, resultando em morte celular.

A, os níveis de PI3K e survivina foram analisados ​​por transferência de Western após tratamento com YM155 ou LY294002 30 uM (controlo) durante 24 horas, e 48 horas após a transfecção com 40 nM de ARNsi. B, os níveis de ERK fosforilada e expressão de survivina foram determinados por Western blotting após o tratamento durante 24 horas com YM155 ou 500 ng de AZD6244, e 48 horas após a transfecção de 40 nM de ARNsi. C, os níveis de STAT3 fosforilado e expressão de survivina foram analisados ​​por transferência de Western, após um tratamento de 24 horas com YM155 e 48 horas após a transfecção de 40 nM de ARNsi.

YM155 regula negativamente a expressão de EGFR

Como YM155 regula negativamente PI3K, p-ERK, e p-STAT3, que são mediadores a jusante de EGFR de sinalização [21], [22], [23], analisou-se o YM155 afecta a expressão de EGFR (Fig. 3). Como esperado, o tratamento com EGF aumentou a fosforilação do EGFR. É interessante notar, no entanto, os níveis de p-EGFR, bem como EGFR totais em células PANC-1 foram significativamente menores após exposição ao YM155 na presença de EGF (Fig. 3A). Estes resultados sugerem que os níveis reduzidos YM155 p-EGFR por meio de uma diminuição nos níveis de EGFR. Cetuximab, utilizado como um controlo positivo, também diminuiu p-EGFR na presença de EGF. Uma outra análise dos efeitos de YM155 sobre a expressão de EGFR em várias linhas celulares de cancro revelou que YM155 induziu uma redução dependente da concentração nos níveis de EGFR no pâncreas (PANC-1, MiaPaCa-2, e BxPC-3), colo-rectal (HCT116), próstata (PC3), e do pulmão (H460) linhas celulares de cancro; Foram observados efeitos semelhantes em células de câncer gástrico KATOIII mas não em células cancerosas gástricas MKN45 (Fig. 3B e Fig. S5).

A, células PANC-1 foram estimuladas com 100 ng /ml EGF durante 10 minutos antes incubação com ou sem YM155 durante 6 horas. Cetuximab (CTX; 100 ng /mL durante 1 hora) foi utilizada como um controlo. Níveis de fosforilada (Y1068) EGFR e EGFR totais foram analisados ​​por transferência de Western. B, YM155 diminuiu a expressão de EGFR em uma maneira dependente da concentração em PANC-1, MiaPaCa-2 (manchas cortadas; blots de comprimento total são apresentados na Fig S5A.), E células BxPC-3. O rácio de expressão EGFR:actin em comparação com o controlo é mostrado para cada pista (utilizando o software v2.3 multi-Gauge). C, survivina e expressão do EGFR foram detectadas nas fracções subcelulares de células PANC-1 por Western blotting. Citoplasmático (cito) e fracções nucleares (nu) foram isolados após a exposição ao YM155 durante 24 horas. Aldolase (citoplasmático) e H3 (nuclear) serviram como marcadores para a pureza das fracções subcelulares. Total de lisados ​​(total) foram analisados ​​simultaneamente. D, YM155 (10 nM) induziu a acumulação nuclear de EGFR. células PANC-1 foram coradas com anti-EGFR, anti-Alexa Fluor 488, DAPI e após o tratamento YM155. Barras de escala:. 10 um

Foram examinados os efeitos de YM155 em survivina e localização EGFR examinando os níveis de fração subcelulares (Fig. 3C); YM155 reduziu os níveis de survivina em ambas as fracções nucleares e citoplasmáticos de células PANC-1. níveis de EGFR foram reduzidos na fracção citoplasmática, mas EGFR acumulada na fracção nuclear. A acumulação nuclear de EGFR induzida por 10 nM de YM155 foi confirmada por microscopia confocal (Fig. 3D). Porque YM155 (10 nM) não teve qualquer efeito sobre os níveis de EGFR em lisados ​​totais, esta condição pode reflectir a translocação nuclear de EGFR. Colectivamente, estes dados indicam que o YM155 reduz os níveis de survivina citoplasmática e nuclear, e sugerem que o YM155 promove a translocação nuclear de EGFR.

YM155, que inibe a actividade do promotor de survivina, induz a degradação do EGFR, XIAP, e survivina

EGFR Para determinar se é o alvo da acção YM155, examinámos o efeito de YM155 sobre a viabilidade celular PANC-1 após knockdown siRNA mediada por EGFR (Fig. S6A). Western blot revelou que siSurvivin e siEGFR eficazmente derrubado survivina e EGFR, respectivamente, como se mostra por transferência de Western, e as percentagens de células viáveis ​​foram de aproximadamente 66% e 75%, respectivamente. A adição de YM155 reduziu a viabilidade das células em células survivin- ou knockdown-EGFR a um grau semelhante ao observado nas células de controlo transfectadas com ARNsi mexidos. YM155 actua como um inibidor de transcrição de survivina, reduzindo a actividade do promotor de survivina de uma maneira dependente da concentração, em células PANC-1 (Fig. S6B). Devido a isso a inibição de transcrição da survivina, YM155 acção pode ser pouco afectado por knockdown de survivina. Por extensão, as reduções semelhantes da viabilidade celular por YM155 observada em EGFR-knockdown e controlo (mexidos siARN) células pode ser devida a uma redução no nível de survivina por YM155.

Para determinar se a diminuição do nível de EGFR depois tratamento YM155 foi devido a uma diminuição da produção ou aumento da degradação, foram analisados ​​os níveis de transcrição, utilizando em tempo real de RT-PCR (Fig. 4A) e avaliou o efeito de degradação de proteínas YM155 em ciclohexamida utilizando o inibidor de síntese de proteínas (Fig. 4B) em PANC- 1 células. Como esperado com base no seu efeito inibitório sobre o promotor de survivina, YM155 diminuição dos níveis de transcritos de survivina. No entanto, os níveis de transcritos de XIAP foram aumentadas, um efeito que pode ser uma resposta compensatória à diminuição dos níveis de proteína XIAP. Ou seja, para se proteger de apoptose, as células podem upregulate XIAP, outra proteína IAP, quando survivina expressão é diminuída, mas a degradação da proteína XIAP por YM155 pode resultar em aumento da transcrição XIAP como um mecanismo compensatório. níveis de transcrição de EGFR foram aumentadas em 10 nM YM155, mas foram reduzidos em 100 nM YM155. Uma análise das alterações nos níveis de proteína ao longo do tempo, na ausência de síntese de proteínas (isto é, na presença de cicloheximida) mostrou que a survivina, EGFR, e de XIAP foram degradados mais rapidamente nas células PANC-1 tratadas com YM155 do que no controlo (cyclohexamide- apenas) células. Os efeitos de 100 nm YM155 sobre a expressão de survivina, EGFR, e de XIAP em células as PANC-1 ao longo do tempo foram investigados (Fig. S7). O tratamento de 8 horas reduziu significativamente os níveis de survivina. Portanto, a survivina pode ser um gatilho para a apoptose subsequente. Colectivamente, estes dados revelam que os YM155 diminuiu a produção de survivina e EGFR (dose elevada, 100 nM) e aumentou a degradação da survivina, XIAP, e EGFR.

, Após o tratamento de PANC-1 com as células YM155 durante 24 horas, a survivina, os níveis de EGFR, e de XIAP de ARNm foram determinados utilizando em tempo real de RT-PCR. B, survivina, EGFR, e XIAP níveis em células PANC-1, após tratamento com 50 ug /ml de ciclo-heximida (CHX) na ausência ou na presença de 100 nM de YM155 para os períodos indicados foram examinados por transferência Western. A proporção de survivina, EGFR, ou expressão XIAP:actin em comparação com o controlo é mostrado para cada pista. *, Inespecífica.

YM155 induz a fosforilação de EGFR, e ubiquitinação do EGFR

Para determinar se YM155 efeitos sobre EGFR, XIAP e degradação survivina foram proteasome-, lysosome- ou caspase dependente, foi realizada a transferência de Western em células PANC-1, após tratamento com o inibidor de proteassoma MG132, a cloroquina inibidor lisossoma, ou o inibidor de caspase z-VAD-fmk (Fig. 5A). A adição de cloroquina para células PANC-1-tratados YM155 embotada a diminuição do EGFR, XIAP, e os níveis de survivina, ao passo que MG132 e Z-VAD-fmk não foram eficazes, sugerindo que a meia-vida mais curta destas proteínas na presença de YM155 foi relacionadas com a degradação lisossómica melhorada. Resultados semelhantes foram observados em células de MiaPaCa-2 (Fig. S8). A seguir, determinado se o YM155-induzida, degradação dependente de lisossoma foi associada a ubiquitinação do EGFR, XIAP, e survivina (Fig. 5B). experiências de imunoprecipitação revelou um aumento claro no EGFR ubiquitinadas após o tratamento com o YM155 (100 nM) durante 6 horas, e um aumento modesto em survivina e XIAP ubiquitinação. Portanto, YM155 induz ubiquitinação do EGFR, survivina e XIAP.

A, YM155 induzida a degradação lisossómica de EGFR, XIAP e survivin em células PANC-1. células PANC-1 foram tratadas com 100 nM de YM155 (YM), 10? M MG-132 (MG), 50 uM de cloroquina (CQ), ou 30 uM de Z-VAD-fmk (Z-VAD) sem ou com YM155 durante 24 horas . Os rácios de EGFR, XIAP, ou survivina expressão de actina em comparação com o controlo são mostrados para cada pista. ctrl, controle; M + Y, MG-132 + YM155; C + Y, cloroquina + YM155; Z + Y, Z-VAD-fmk + YM155. B, PANC-1 As células tratadas com 100 nM de YM155 durante 6 horas foram imunoprecipitados (IP) com os anticorpos contra o EGFR, survivina ou de XIAP, e analisados ​​por transferência de Western para a ubiquitina. C, O tempo de curso de fosforilação do EGFR em Y1045 em células PANC-1, após tratamento com o YM155 (100 nM) é mostrado.

A forma Y1045 fosforilado do EGFR é conhecido por interagir com o E3 ligase de ubiquitina-proteína c-Cbl, que tem como alvo EGFR para o lisossoma pela degradação posterior [24]. Porque YM155 EGFR induzida ubiquitinação, examinámos a fosforilação do EGFR como uma função do tempo após o tratamento com o YM155 por sondagem para pY1045-EGFR por Western blot (Fig. 5C). Estas experiências mostraram um decréscimo claro na pY1045-EGFR após exposição a YM155 durante 105 minutos ou mais. Estes resultados sugerem que YM155 modula Y1045-fosforilação de EGFR.

YM155 exibiu efeitos anti-tumorais contra o câncer de pâncreas

in vivo

Para avaliar os efeitos anti-tumorais de YM155 em câncer de pâncreas

in vivo

, utilizamos um modelo de tumor xenoenxerto MiaPaCa-2 pancreático linha de células, medindo o volume do tumor e peso corporal (Fig. 6A e 6B). Em MiaPaCa-2 xenoenxertos, o crescimento tumoral foi inibido por 77,1% no dia 31 após o tratamento com infusão contínua de YM155 (p 0,001, YM155 comparativamente com o veículo). O peso corporal não foi significativamente diferente entre os grupos não tratados e YM155-tratados. grupo tratado com YM155 no dia 31 tinham pesos dos tumores menores do que os animais tratados com veículo (Fig. 6C). YM155 induzida a regulação negativa do EGFR, a survivina, e expressões XIAP em tumores de xenoenxerto (fig. 6D). Estes resultados indicam que YM155 exerce um efeito significativo anti-tumor contra o câncer pancreático

in vivo

.

Efeitos de YM155 no crescimento do tumor (A) e do peso corporal (B)

in vivo

foram avaliados em MiaPaCa-2 xenoenxertos (veículo, n = 6; YM155, n = 8). O volume do tumor foi determinado nos tempos indicados após o início do tratamento. YM155 foi administrado na dose de 50 mg /kg. O

in vivo

programação experimental de YM155 é indicada na parte inferior de cada gráfico. Dia 0 indica o momento em que os tumores subcutâneos atingiram um tamanho de 100 mm

3 e administração de YM155 foi iniciado. A análise estatística dos efeitos de YM155 sobre o tamanho do tumor foram feitas por meio de testes de Mann-Whitney (* P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, YM155 comparativamente com o veículo). C, tamanhos médios de tumor são descritos para cada grupo no dia 31. D, imuno-histoquímica analisa em tumores de xenoenxerto no dia 31 após o tratamento YM155 foi realizada utilizando anticorpos contra o EGFR, survivina, e XIAP e coradas com H . E

Discussão

no presente estudo, investigamos os efeitos do YM155 inibidor survivina em survivina, XIAP e expressão de EGFR em linhas celulares de cancro do pâncreas. Os nossos dados mostram que o YM155 afecta a expressão de ambos o EGFR e survivina e, assim, reduz a sobrevivência. Embora os estudos anteriores sugeriram que YM155 bloqueia especificamente a expressão de survivina em células de cancro da próstata e células de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), sem afectar outras proteínas [9], [16], os nossos dados de células de cancro do pâncreas e gástricas excepto células MKN45 sugerem de outra forma. No entanto, como os seus efeitos no câncer de próstata ou de células NSCLC, efeitos YM155 na expressão de XIAP em células MKN45 foram quase não detectado. Tal expressão diferencial tipo celular de algumas proteínas pode refletir respostas específicas de linha de células de células de câncer de pâncreas ou gástricas para YM155. Em conformidade com as observações anteriores, verificou-se que as células PANC-1 eram os mais susceptíveis à YM155 entre as linhas celulares de cancro pancreático [6]. células PANC-1 são conhecidas por expressar níveis mais elevados de ARNm de survivina que as outras duas linhas celulares de cancro pancreático [25]. Buck et ai. relataram que o nível de expressão do EGFR é mais elevada em células PANC-1 do que nos MiaPaCa-2 células [25]. células PANC-1 que expressam níveis elevados de AKT total e activado ter sido referido como exibindo prisão significativa do ciclo celular e apoptose, quando PI3K /AKT é inibido, em comparação com as outras duas linhas celulares de cancro pancreático [26], [27]. PI3K /AKT é regulada pelo EGFR [28]. Portanto, o efeito de YM155 em EGFR em células PANC-1 pode ser associada com AKT. Além disso, a expressão elevada de survivina e EGFR pode ser citoprotector e correlacionam com a susceptibilidade YM155. No entanto, é necessário um estudo mais aprofundado para investigar se a susceptibilidade das células à YM155 está associado a alterações específicas de linha de celular em genes tais como EGFR ou survivina. Neste estudo, nós mostramos que YM155 inibe o crescimento do tumor em MiaPaCa-2 xenotransplantes Portanto, a combinação de YM155 com gemcitabina é também digno de investigação no cancro pancreático.

YM155 está passando atualmente ensaios clínicos [29]. Fase II dos ensaios de YM155 sugeriu a actividade e tolerabilidade em doentes com melanoma e cancro avançado refractário não-pequenas do pulmão de células [30], [31]. As doses testadas YM155 em fase pré-clínica através da determinação da dose máxima tolerada (DMT) ou estudos farmacocinéticos são aplicáveis ​​aos contextos clínicos. Um ensaio clínico pode ser projetado com base no

in vitro

e

in vivo

eficácia de YM155. Com base em nossos dados pré-clínicos, YM155 vale a pena investigar mais em pacientes com câncer de pâncreas.

Em nosso estudo, YM155 não mudou Bcl-XL ou níveis Mcl-1. Os resultados para a Bcl-xL estão de acordo com observações anteriores [9], enquanto que aqueles para o LCM-1 foram em contraste com aqueles de um relatório anterior [32]. Tang et al. relataram que regula negativamente YM155 Mcl-1, em vários tipos de células cancerosas, mas não em células de cancro pancreático. Isso pode refletir as respostas específicas de linha de células de células do cancro do pâncreas YM155. Enquanto YM155 induziu uma diminuição dependente da concentração no Bid, p-Bad, e os níveis de Bad na maioria das linhas celulares de cancro do pâncreas, Bid não foi afetada em células BxPC-3. Estes resultados indicam que os níveis de proteínas YM155 afecta apoptóticas, um resultado que contrasta com os relatórios anteriores [9].

estudo anterior que mostrou uma fosforilação do EGFR foi induzida por radiação ionizante de uma maneira independente do ligando e de radiação ionizante ou cisplatina, sem EGF transporte EGFR induzida no núcleo [33]. Eles mostraram que o mecanismo de importação de EGFR induzida por radiação para dentro do núcleo foi associada com um α carioferina. No entanto, não sabemos o mecanismo exato de translocação nuclear de EGFR por YM155 sem EGF ainda. Assim, são necessários mais estudos para descobrir o mecanismo pelo YM155 na translocação nuclear de EGFR. Liccardi et ai. relataram que a translocação nuclear de EGFR é importante na modulação da reparação de danos no DNA após quimioterapia [34]. Neste estudo, 10 nM YM155 induzida translocação nuclear de EGFR e EGFR aumento dos níveis de transcrição. EGFR transloca para o núcleo, onde o EGFR pode activar os genes associados com a reparação como um factor de transcrição [35]. No entanto, concentrações mais elevadas de YM155 (100 nM) reduziu os níveis de transcritos de EGFR e EGFR degradação reforçada. Portanto, o aumento da transcrição e translocação do EGFR em concentrações baixas (10 nM) de YM155 pode proteger as células da apoptose, enquanto que as concentrações elevadas (100 nM) diminuem a sobrevivência das células, reduzindo a transcrição e aumentando a degradação do EGFR EGFR.

Levkowitz et ai. informou que a ligação de EGF ao EGFR provoca a degradação do EGFR através da ligação com c-Cbl na pY1045-EGFR [36]. Ahsan et ai. relataram fosforilação do EGFR, ubiquitinação e degradação na citotoxicidade induzida por cisplatina [37]. Pangbum et al relataram que o sulindac metabolito também induz a ubiquitinação do EGFR [38]. Da mesma forma, verificou-se que a fosforilação de EGFR, e ubiquitination EGFR e degradação depois foram induzidos tratamento com YM155. No entanto, é necessária investigação adicional para investigar E3 ubiquitina ligase para YM155.

XIAP foi relatado para induzir a regulação negativa da survivina através XAF1 (XIAP fator associado 1) [39]. XIAP também foi identificado como um co-factor de survivina na inibição da apoptose [40]. Survivina libertado de mitocôndrias em resposta a estímulos apoptóticos interage com XIAP através de um sítio de ligação correspondente para XIAP Lys15-Met38, resultando em maior estabilidade contra XIAP ubiquitinação /degradação proteossómica e inibição da apoptose [41], [42]. Fosforilação da survivina no citoplasma inibe a montagem do complexo survivin-XIAP, abolindo a sua função anti-apoptótica [41]. Os nossos resultados mostraram que o efeito de YM155 sobre a expressão de XIAP diferiam no contexto de knockdown survivina. YM155 induziu um aumento nos níveis de transcrição XIAP e promoveu a degradação da proteína XIAP. YM155 diminuiu a interacção de survivina com XIAP, ligeiramente aumentada ubiquitinação de XIAP e induziu degradação lisossómica de XIAP. Portanto, YM155 afeta a degradação de XIAP, bem como survivin, e interfere com a montagem do complexo survivin-XIAP. A diminuição induzida em níveis YM155 XIAP é improvável devido a uma redução nos níveis de survivina. Neste estudo, nós não examinamos fosforilação de survivin por YM155 ou investigar outros fatores que podem afetar o complexo survivin-XIAP. Assim, estudos adicionais em profundidade mecanísticos sobre YM155 modulação de XIAP deve ser realizada.

Em conclusão, observou-se que o YM155, conhecido como um inibidor de survivina, promove a regulação negativa da PI3K, p-ERK, e p-STAT3 através da degradação do EGFR nas células de câncer pancreático. Nossos dados sugerem que YM155 tem potencial terapêutico em câncer de pâncreas e dar apoio aos ensaios clínicos de YM155 neste contexto.

Materiais e Métodos

linhas celulares, compostos, plasmídeos, e anticorpos

as linhas de células de cancro pancreático humano PANC-1, MiaPaCa-2, e BxPC-3 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, USAA). YM155 foi obtida a partir de Pharmaceuticals Hanmi (Seoul, Coreia). Outros reagentes utilizados incluem o LY294002 (Calbiochem, Darmstadt, Alemanha), AZD6244 (Chemizon Coreia), MG132 (Calbiochem), a cloroquina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), Z-VAD-fmk (R D Systems, MN, EUA ), ciclo-heximida (Sigma-Aldrich), factor de crescimento epidérmico (EGF; Daewoong Pharmaceuticals, Coreia), e cetuximab (Merck Coreia). Os anticorpos primários contra os seguintes proteínas foram utilizados para análises de Western blot: a survivina (Abcam, Cambridge, MA, EUA); XIAP (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA); ubiquitina e β-actina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); EGFR, fosfo (p) -EGFR (Y1068, Y1045), Bcl-xL, Mcl-1, Bid, p-Bad (S112), Bad, PI3K, ERK, p-ERK (T202 /Y204), STAT3, p- STAT3 (Y705), aldolase, e H3 (Cell Signaling, Danvers, MA, EUA). proteínas imunorreactivas foram detectadas utilizando anticorpos secundários em espécies apropriadas peroxidase de rábano conjugada. Alguns materiais são descritos em Materiais e Métodos S1.

ensaio de viabilidade celular e siRNA transfecção

A viabilidade celular foi determinada utilizando um kit de contagem celular-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japão), de acordo com a as instruções do fabricante. Três experimentos independentes foram realizadas em duplicata. concentrações inibitórias cinquenta por cento (IC

50s) foram determinados utilizando GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego).