Abstract

Fundo Visa

incidência de câncer colorretal e as mortes são reduzidas pela detecção e remoção de início de carreira, neoplasia tratável, mas falta-nos biomarcadores sensíveis tanto para o câncer e adenomas pré-invasivas comprovada. Os objetivos deste estudo foram determinar se adenomas e cancros exibem padrões característicos de expressão de biomarcadores e de explorar se um biomarcador (e validado) descobriu-tecido é diferencialmente expressos no plasma de pacientes com adenomas colorretais ou câncer.

Métodos

biomarcadores de ARN candidatas foram identificadas por análise de oligonucleotídeo microarray de espécimes colorectal (222 normal, 29 de adenoma, 161 adenocarcinoma e 50 colite) e validado em uma coorte anteriormente não testada de 68 espécimes colorectal usando um oligonucleotídeo de design personalizado microarray. Um biomarcador validado,

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, foi analisada utilizando qRT-PCR em RNA extraído plasma de 20 controles colonoscopia confirmou saudáveis, 20 pacientes com adenoma, e 20 com câncer.

Resultados

análise Genome-wide descoberto assinaturas de expressão gênica reprodutíveis para ambos os adenomas e cancros em comparação aos controles. 386/489 (79%) do adenoma e 439/529 (83%) dos biomarcadores adenocarcinoma foram validados em tecidos independentes. Foram também identificados genes expressos diferencialmente em adenomas em comparação com o cancro.

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foi seleccionado para posterior análise com base em consistentes sobre-regulação na neoplasia, estudos anteriores e seu interesse como um gene descaracterizado. Plasma

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níveis de RNA foram significativamente maiores em pacientes com qualquer câncer ou adenoma (31/40) em comparação com controles sem neoplasia (6/20).

Conclusões

neoplasia colorretal apresenta padrões característicos da expressão do gene.

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é diferencialmente expressos em tecidos neoplásicos e

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transcrições são mais abundante no plasma dos pacientes com câncer ou adenoma em relação aos controles

Citation:. LaPointe LC, Pedersen SK, Dunne R, Brown GS, Pimlott G, Gaur S, et al. (2012) Descoberta e validação de biomarcadores moleculares para colorectal adenomas e câncer com o Application a exames de sangue. PLoS ONE 7 (1): e29059. doi: 10.1371 /journal.pone.0029059

editor: Libing Song, Sun Yat-sen University Cancer Center, China

Recebido: 30 de maio de 2011; Aceito: 20 de novembro de 2011; Publicação: 19 de janeiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 LaPointe et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi co-financiado pela Universidade Flinders da Austrália do Sul e da Commonwealth Scientific and industrial Research Organisation (CSIRO) da Austrália. Drs. Dunne, Molloy e Brown são empregados por CSIRO. Esses financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. O financiamento também foi fornecido pelo Clinical Genomics Pty Ltd., uma empresa envolvida na descoberta e comercialização de biomarcadores para o câncer colorretal. Drs. LaPointe, Pedersen, Gaur, McEvoy e Thomas são empregados por Clinical Genomics Pty Ltd e Prof. Young é um consultor pago of Clinical Genomics Pty Ltd. O financiador, assim, desempenharam papéis no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar, e preparação do manuscrito. Sra Pimlott e Dr. Wattchow têm nada a revelar

Conflito de interesses:. Este trabalho foi co-financiado pelo Clinical Genomics Pty Ltd, uma empresa envolvida na descoberta e comercialização de biomarcadores para o câncer colorretal. Drs. LaPointe, Pedersen, Gaur, McEvoy e Thomas são empregados por Clinical Genomics Pty Ltd. Prof. Young é um consultor pago of Clinical Genomics Pty Ltd. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas sobre dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

o câncer colorretal é tratável se detectado e removido numa fase inicial com 95% dos pacientes sobrevivem além de cinco anos [1]. Existe evidência crescente de que a remoção de lesões pré-invasivas colorrectais, isto é, adenomas, por polipectomia reduz a incidência de, e a mortalidade de, cancro colo-rectal [2] – [4]. Consequentemente, prevenção do câncer colorretal, removendo adenomas detectados na triagem é cada vez mais enfatizada como um importante objectivo do rastreio do cancro colo-rectal. testes de rastreio simples atualmente disponíveis, no entanto, estão abaixo do ideal para a detecção de adenoma, embora os testes imunoquímicos fecais para globina estão muito melhor em comparação com os testes anteriores [5] – [7]. programas de rastreio da população pode ser melhorado se um exame de sangue conveniente estavam disponíveis que é sensível e específico para ambos os primeiros estágios, mais tratáveis ​​de câncer colorretal e também sensível para adenomas pré-invasivos. Tal teste facilitaria uma abordagem de triagem racional, permitindo-nos para direcionar recursos colonoscopia para aqueles indivíduos que são susceptíveis de obter maior benefício do procedimento invasivo [8].

padrões de expressão gênica estão mostrando cada vez mais promissor para identificação de candidatos a biomarcadores para o câncer colorretal, mas estes candidatos muitas vezes carecem de validação adequada e pouca informação está disponível para biomarcadores que também são sensíveis para adenomas. biomarcadores putativos resultantes da investigação baseado em descobertas devem ser rigorosamente validados se eles estão a ser clinicamente útil [9] – [12]. Validação, isto é testar a hipótese de que os candidatos a biomarcadores são indicadores genuínos de um fenótipo, idealmente faz uso de um grupo de pacientes clinicamente que é independente da coorte descoberta. Além disso, a correlação entre os padrões de expressão genética no tecido e detecção de biomarcadores no sangue não foi bem definido.

Os objetivos deste estudo foram determinar se adenomas e cancros exibem padrões característicos de expressão de biomarcadores e de explorar se um tecido -discovered (e validado) biomarcador é expresso diferencialmente no plasma de pacientes com cancro colorectal adenomas ou. É dada especial atenção aos padrões de expressão adenoma como biomarcadores adenoma têm sido largamente ignorado na literatura.

Nós perseguido o nosso objectivo para descobrir biomarcadores sensíveis para ambos os adenomas colorretais e câncer, seguindo uma estratégia de três fases da descoberta, a validação e testes de ensaio clínico. Primeiro, os dados de microarranjos de alta-dimensional expressão gênica foram analisadas para descobrir biomarcadores candidatos em ambos os tipos de câncer e adenomas da colorectum. Para em seguida, validar os candidatos de expressão de genes, um microarray de oligonucleótido desenhado por encomenda ( “Adenoma Biomarcador Gene Chip”) foi concebida e fabricada para incluir uma ampla variedade de marcadores hipotéticos encontrados durante a fase de descoberta, bem como marcadores seleccionados a partir da literatura. biomarcadores candidatos foram validados usando o Adenoma Biomarcador Gene Chip em um conjunto independente de espécimes neoplásicas. Por fim, a utilidade clínica potencial de um biomarcador neoplasia colorrectal validado-tecido promissor foi medida em RNA extraído do plasma de doentes de adenoma e cancro colo-rectal e os controlos saudáveis ​​colonoscopia confirmada. Este processo sequencial segue as duas primeiras fases de uma avaliação de cinco estágios de biomarcadores proposta por Pepe et al [13].

Resultados

Neoplásicas vs. não-neoplásica transcriptoma

Dos 44,928 sondas analisadas pela diferença expressão do gene, observamos 11.183 (24,9%) de sondas a serem diferencialmente expressos em tecidos neoplásicos relativos aos tecidos não neoplásicas incluindo espécimes col�icos. Para comparação, observou-se 2,701 (6,0%) do mesmo modo de sondas diferencialmente expressos entre os extractos de tecido (Tabela 1) Normal (n = 222) e colite (n = 42). Estes dados de expressão também foram analisados ​​no nível de genoma completo usando análise de componentes principais (PCA) (Figura 1). A maior fonte de mudança de expressão observada nestes 454 microarrays (como evidenciado por ambos significam mudança de expressão e o enredo PCA) correlacionada com a presença ou ausência de neoplasia. Este efeito fenotípico foi independente da colite se os tecidos não neoplásicas exibiram e também independente de saber se os tecidos neoplásicos foram adenomatosa ou canceroso

(A) conjunto de dados Descoberta microarray:. 222 normal, preto; 42 colite /IBD, verde; 29 adenomas, azul; e 161 adenocarcinomas, vermelho. (B) conjunto de dados de validação microarray: 30 normal, preto; 19 adenomas, azul; e 19 adenocarcinomas, vermelho.

Com a introdução de um requisito para uma mudança de duas vezes na intensidade do sinal entre os tecidos neoplásicos e não-neoplásicos, o número de sondas diferencialmente expressos caiu de 11.183 para 446 (Tabela 1). Assim, apenas 4,0% dos conjuntos de sondas diferencialmente expressos (1,0% de conjuntos de sondas global) demonstraram mudança de expressão de pelo menos duas vezes. Curiosamente, enquanto o número de conjuntos de sondas exibindo uma resposta diferencial de qualquer magnitude foi aproximadamente igualmente divididos entre conjuntos de sondas com o aumento da expressão em tecidos neoplásicos (6,227; 55%) e conjuntos de sondas com a diminuição da expressão (4,956; 44%), após a aplicação do dois-dobra o critério do número de conjuntos de sondas sub-expressos com a diminuição da intensidade em tecidos neoplásicos foi muito maior do que o número de conjuntos de sondas com maior intensidade, 338 (76%) em comparação com 108 (24%), respectivamente. A tendência foi observada em ambos os não-neoplásica contra o adenoma e não-neoplásica contra comparações com câncer. Por outro lado, a comparação das amostras normais e colite mostraram aproximadamente o mesmo número de genes com maiores (60) e níveis mais baixos (73) entre os fenótipos de expressão. Entre adenoma e câncer, no entanto, houve consideravelmente mais genes up-regulamentados (145) no câncer de contra baixo regulamentadas (43). Um resumo das alterações de expressão diferencial por fenótipo é mostrada na Tabela 1 e uma lista de genes validados cima e para baixo regulados positivamente em cancros em comparação com adenomas são mostrados nas Tabelas S1 e S2, respectivamente.

sondas que revelou diferencial expressão entre neoplásicas (adenomas e cancros) e tecidos não-neoplásicas (normais e colite) foram mapeados para símbolos de genes putativos utilizando os ficheiros de anotação de microarray mais recentes. 108 conjuntos de sondas elevados em tecidos neoplásicos por, pelo menos, de duas vezes, foram mapeadas para os símbolos 97 e 338 genes diminuiu sondas foram mapeados para 264 símbolos de genes (Tabela S3).

genes específicos de Fenótipo

A conjuntos de genes diferencialmente expressos foram adicionalmente analisados ​​utilizando um novo método de análise por nós desenvolvido para prever transcritos que podem ser expressos em um fenótipo (por exemplo, neoplasia), mas não na outra (por exemplo controlos saudáveis). Ao aplicar esta metodologia, 23 alvos de sondas foram identificados como candidatos putativos para a expressão de genes específicos-neoplásica, ou seja, hipoteticamente comutada-on em tecidos neoplásicos, mas desligado nos controles não-neoplásicas. Além disso, 35 genes foram identificados como candidatos para a expressão em apenas tecidos não-neoplásicas, isto é, com comutação de em em tecidos não-neoplásicas mas desligado em tecidos neoplásicos. Um exemplo de um conjunto de sondas que exibe um padrão de resposta específica prototípico-neoplásica é mostrado na Figura 2A, e a lista completa de conjuntos de sondas correspondentes a comutação de em hipoteticamente e desligado genes é mostrado nas Tabelas S4 e S5, respectivamente.

(A) conjunto de dados Descoberta, 222 normal, preto; 42 IBD, verde; 29 adenomas, azul; 161 adenocarcinomas, vermelho. (B) conjunto de dados de validação: 30 normal, preto; 19 adenomas, azul; 19 adenocarcinomas, vermelho. Eixo Y:. Intensidade de sondas Normalizada (log2)

Custom “Adenoma Biomarcadores” gene chip

O enredo PCA dos dados de identificação (Fig 1A) mostra uma forte vs. neoplasia segregação não neoplasia envolvendo os dois primeiros eixos principais componentes, com os adenomas e câncer agrupados. Para os dados de validação (Fig 1B), o primeiro componente principal que confirma a maior fonte de variação entre estes conjuntos de sondas é a presença ou ausência de neoplasia. O segundo componente principal, no entanto, mostra que os adenomas são agrupadas separadamente das amostras de cancro.

A validação de biomarcadores candidatos para neoplasia colorretal

dos 108 conjuntos de sondas cujos alvos foram hipótese de ser excessiva expressa por, pelo menos, duas vezes em tecidos neoplásicos descoberta, 103 conjuntos de sondas (95%) estavam elevados nos tecidos neoplásicos de validação (

P

≤0.05, MHT), e destas, 92 (85%) foram elevados em pelo menos de 2 vezes. Da mesma forma, 297 dos 338 (87%) alvos de sondas hipótese de ser sub-expressos em tecidos neoplásicos também foram sub-expresso nos experimentos de validação (

P

≤0.05, MHT); em espécimes neoplásicas, 247 (73%) destes genes exibiu metade ou menos da expressão observados em tecidos de controlo normais. resultados de validação por contraste fenótipo são apresentados na Tabela 2. Uma lista de validado para cima e para baixo-regulados de sondas é mostrado nas Tabelas S6 e S7, respectivamente.

ensaio de PCR quantitativo para medir níveis de ARN de biomarcadores em tecido ou plasma

um dos conjuntos de sondas mais diferencialmente regulados positivamente em ambos a descoberta (Fig 3A) e de validação (Fig 3B) detectados transcritos de

KIAA1199, um gene de função desconhecida. No conjunto de dados de validação, de sondas 1008852-HuGene_st (

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) foi expressa mais de 25 vezes maior em colorectal neoplasia em relação aos controles não-neoplásicas (Tabela S6). Estes resultados confirmam relatórios anteriores, que constatou que

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mRNA pode ser um biomarcador candidato para adenoma colorretal [14]. Com base em nossa observação repetida de expressão diferencial em tecidos neoplásicos, a evidência antes de expressão regulado para cima em ambos os adenomas e cancros eo fato interessante que

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não tenha sido previamente caracterizado, em termos de estrutura ou função, escolheu

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para testar a ideia de que os padrões de expressão tecido pode ser refletido no sangue. Para explorar ainda mais o potencial biomarcador de

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foi elaborado um ensaio de PCR em tempo real para detecção de transcritos de RNA derivados deste lugar.

(A)

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expressão medido através de sondas 212942_s_at no conjunto de dados a descoberta de 454 amostras de tecidos colo-rectais (eixo X indexado pelo fenótipo); Norm: 222 amostras normais, preto; IBD: 42 espécimes ‘colite’, verde; ADE: 29 adenomas, azul; CA: 161 espécimes de cancro, vermelho. Eixo Y: intensidade de sondas normalizada (log2). (B)

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expressão medido através de sondas 1.008.852-HuGene_st no conjunto de dados de validação em 68 amostras de tecido colorretal. Eixo dos x; Norm: 30 espécimes normais de tecido do cólon, preto; ADE: 19 adenomas, azul; CA: 19 espécimes de cancro colorrectal, vermelho. Eixo Y: intensidade de sondas normalizada (log2). (C) Um quantitativo em tempo real SYBR verde-

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ensaio de PCR aplicado a extractos de ARN utilizadas para a validação de dados microarray: 30 normal, preto; 21 adenomas, azul; 20 cancro colorectal, espécimes vermelhas. Os dados são valores médios de duplicatas, normalizados contra HPRT1 e descritos como valores delta-delta-Ct. Note-se que três amostras neoplásicas adicionais estavam disponíveis para os experimentos de PCR que não foram testadas por microarray personalizado.

Em primeiro lugar, uma base SYBR verde-PCR em tempo real para o

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foi usado para confirmar os dados tecido validação microarray; os resultados estão em boa concordância com os dados de microarranjos para este gene (Fig 3C). Em seguida, os níveis de transcrição

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(e

GAPDH

controle) foram medidos em RNA extraído a partir da fracção de plasma de 40 pacientes com neoplasia colorretal (adenoma ou adenocarcinoma) e 20 controles saudáveis ​​(todas as categorias tendo foi confirmada pelos achados patológicos clínicos), utilizando comercialmente disponível ensaios TaqMan qPCR.

GAPDH

transcritos de RNA foram detectados em todas as amostras de plasma 60 testados (Fig 4A) e moderadamente mais altos

GAPDH

níveis de RNA foram observadas em amostras de plasma de pacientes diagnosticados com adenomas colorretais ou câncer em comparação com dadores saudáveis (não significativo, os valores de p 0,05). Concentrações mais elevadas de

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transcritos de RNA foram detectados em plasma de pacientes com neoplasia colorectal do que no plasma de controlos saudáveis ​​(Figura 4B).

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RNA foi detectado no plasma de 31 dos 40 (77,5%) pacientes com neoplasia colorretal e em 6 dos 20 (30%) pacientes sem neoplasia.

(A )

GAPDH Comprar e (B)

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níveis de RNA no plasma de 20 indivíduos saudáveis ​​(preto) e de 20 pacientes com adenomas de cólon (azul) e 20 pacientes com CCR (vermelho). Os dados são valores Ct médios (triplicados) normalizados para as diferenças de rendimento de extração e descritos como diferenças fold-mudança relativa à expressão médio medido em 20 indivíduos normais. Os valores de P foram calculados por meio de duas caudas t-teste de Mann-Whitney.

Discussão

Este estudo confirma que transcritos de mRNA colorretais são diferencialmente expressos em ambos os adenoma e câncer de tecidos em relação aos controles , com alguns transcritos ser regulados positivamente em neoplasia, enquanto outros são regulados negativamente. Nós confirmou que 103 de 108 (95%) de sondas descoberto a ser regulada para cima no neoplasia também foram diferencialmente expressos durante os testes de validação. 87% (297/338) das sondas regulada para baixo também foram confirmadas durante os testes de validação. padrões de covariância de todo o genoma revelou que a presença ou ausência de neoplasia correlacionada com a maior fonte de variância em todas as probesests e todas as matrizes nos dados de expressão (Fig 1A). Aproximadamente 25% dos alvos 44,928 descoberta de sondas foram diferencialmente expressos entre o tecido neoplásico e controlos não neoplásicas. Todos os outros contrastes fenótipo resultou em menos de sondas que mostram uma resposta diferencial. Estes resultados demonstram que o estado neoplástico tem uma maior influência sobre a expressão do gene que, por exemplo, colite ou até mesmo a diferença entre o tecido adenoma pré-invasivo e cancro maligno.

Os nossos resultados estão de acordo com uma tendência frequentemente observada no cancro colo-rectal pesquisa de expressão de gene que mostra um maior número de genes que são regulados negativamente em tecidos de adenoma e cancerosas em comparação com os controlos não-neoplásicas [15]. Este padrão de expressão pode refletir níveis de hipermetilação associados à oncogênese [16] aumentou.

Por outro lado, este estudo revela que mais genes parecem ser regulada para cima na transição do adenoma para adenocarcinoma (Tabela S1) . Esta observação pode reflectir o aumento da complexidade histológica subjacente de cancro, em comparação com o tecido adenoma ou, mais interessante, pode demonstrar uma relação entre o aumento do número de genes expressos e da progressão para um fenótipo invasivo e metástases. O maior grupo (14%) dos genes regulados positivamente em cancro, em comparação com adenomas são da família de colágeno, mas a lista também inclui quatro espécies diferentes de metaloproteinases de matriz sugerindo aumento da atividade de genes com potencial de invasão (Tabela S1).

Além disso, este estudo envolveu a criação de uma micromatriz personalizado que continha um conjunto de genes que mostram que os adenomas podem ser separados a partir de espécimes de cancro com base em padrões de expressão de genes (Fig 1B). Estes resultados suportam o conceito de que não só é a assinatura de expressão do gene neoplásica conservadas entre a descoberta e validação de dados, mas também o adenoma vs assinatura de expressão do cancro é também preservada. Não temos conhecimento de qualquer estudo de expressão gênica anterior que demonstrou a capacidade de distinguir entre não-neoplasia, neoplasia pré-invasiva e fenótipos invasivos. Esta seleção de genes abre o caminho para a identificação de biomarcadores de uso na detecção sensível e específica de adenomas.

O segundo objetivo deste estudo foi investigar se biomarcadores candidatos selecionados descobertos em tecido eram detectáveis ​​e diferencialmente expressos no plasma de doentes com adenoma colorrectal ou cancro em comparação com o plasma de controlo não neoplásicas. Esta etapa é crucial para a tradução dos resultados de tecido em endpoints clinicamente úteis. Caso contrário, a descoberta do marcador deve começar em amostras clínicas de diagnóstico (por exemplo sangue) que representam desafios maiores do que começar com relativamente RNA rico tecido fresco congelado. Este relatório descreve um ensaio de qPCR prova-de-conceito baseado em plasma que mede transcritos de mRNA de

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, um gene de função desconhecida que confirmam a ser diferencialmente expressos em ambos os tecidos e plasma de pacientes com câncer e adenoma.

Biomarkers para neoplasia colorretal

Há uma literatura grande e crescente de genes colorectal experiências relacionadas com a expressão [17], [18]. O estudo aqui apresentado amplia e melhora em cima desse corpo de trabalho. A comparativamente grande meta-análise de Chan et al. de 25 genes estudos de descoberta de expressão relacionadas com cancro colorectal identificaram cinco genes que ser regulado para cima em sete ou mais independentes análises, incluindo

TGFBI

,

IFITM1

,

MYC

,

SPARC

,

GDF15

[17]. Todos os cinco desses genes foram confirmados para ser regulado para cima em nosso estudo.

Poucos estudos abordar as diferenças de expressão entre adenomas colorretais e tecido colorectal normal. Galamb et ai. microarrays usado para identificar um conjunto de três genes (

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,

FOXQ1

, e

CA7

) que foram diferencialmente expressos em adenomas relativos aos controles normais, bem como um conjunto de cinco genes (

VWF

,

IL8

,

CHI3L1

,

S100A8

, e

GREM1

) que poderia discriminar o cancro tecidos de controles normais [19]. Desses genes, o nosso estudo constatou que

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,

FOXQ1

e

IL8

foram diferencialmente expressos em adenomas (e em cancros) em relação aos controles normais.

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O presente estudo confirma relatos anteriores de que

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apresenta um elevado nível de expressão de mRNA em adenomas pré-cancerosas, um up-regulação que persiste em tecido canceroso [14]. Este gene também foi um dos melhores marcadores identificados pelo laboratório de Marra como um alvo previamente desconhecida de expressão induzida por Wnt e um possível biomarcador da novela para neoplasia colorretal. Sabates-Bellver et ai. demonstrou que

expressão KIAA1199

na mucosa normal foi confinada às células na porção inferior das criptas intestinais, enquanto elevado

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expressão foi observada em todos os adenomas que eles estudaram.

o papel de

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não é conhecido, mas a evidência de Wnt-indutibilidade sugere que este gene pode ser parte da cascata a jusante do Tcf /LEF genes transcricionalmente activados que são comumente perturbados na neoplasia gastrointestinal [14] . adenocarcinomas gástricos que expressam elevados níveis de

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estão correlacionadas com pior sobrevida em cinco anos os resultados em relação aos pacientes com baixa

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expressão [20]. células cancerígenas do cólon tratados com seletivos ciclooxigenase-2 inibidores mostram reduzido

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expressão [21], enquanto que altos níveis de

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mRNA são positivamente correlacionados com a mortalidade celular em fibroblastos humanos [22].

Um teste de sangue prova-de-conceito para adenomas

Apesar do rápido crescimento do banco de dados de biomarcadores de câncer putativos, alguns candidatos promissores durante a pesquisa de descoberta inicial sobreviver testes de validação subsequente com tecidos independentes. Uma fracção ainda menor de candidatos continuam a mostrar promessa quando esses genes são seleccionados para desenvolvimento do ensaio e o teste clínico. Nós identificamos centenas de biomarcadores para neoplasia colorretal que sobreviveram a validação em amostras clínicas independentes. Por um convincente biomarcador tecido neoplásico,

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, temos também testou um ensaio qPCR de um único gene que mostra a promessa em discriminar entre amostras de plasma de pacientes com neoplasia colorretal e de indivíduos saudáveis. Este gene, que era um de muitos genes “validados”, foi escolhido para estudo adicional com base no desempenho de biomarcadores aqui relatado, os relatórios anteriores que mostraram

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a ser elevado na neoplasia colorectal e porque a função biológica desta gene é desconhecido. Plasma

níveis KIAA1199

foram elevados em pacientes que tinham adenomas colonoscopia confirmou ou cancros em relação ao controlo de plasma de indivíduos sem neoplasia, apesar da aparente sensibilidade deste único marcador foi maior para o câncer do que para adenomas.

como um biomarcador com o potencial para o diagnóstico em amostras de doentes não invasivos,

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deve agora ser considerado para incorporação em ARNm (e possivelmente de proteínas) e ensaios investigada em estudos clínicos e de rastreio maiores. De particular interesse será a relação de

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expressão aos vários caminhos genéticos de oncogênese colorectal, tais como a via de

Wnt

sinalização, que são comumente perturbado em câncer colorretal e adenomas.

colorectal neoplasia apresenta padrões característicos da expressão do gene.

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é diferencialmente expressos em tecidos neoplásicos e

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transcrições são mais abundante no plasma dos pacientes com câncer ou adenoma em relação aos controles.

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e outros biomarcadores validados aqui descritas justificar uma avaliação mais aprofundada, como testes de rastreio baseados no sangue para neoplasia colorretal. Um dos principais desafios para esta avaliação adicional será também abordar sensibilidades relativas de um teste para adenomas e cancros dado o muito maior prevalência de adenomas colorretais neoplásicas benignas em comparação com carcinoma colorectal neoplásicas malignas.

Materiais e Métodos

Todos os dados de microarranjos utilizados neste estudo foi documentado em conformidade com as normas Miame para experimentos de microarranjos.

Data Discovery

colorretais amostras de tecido utilizados para descoberta de biomarcadores foram recolhidos por Genelogic Inc (Gaithersburg, MD, EUA) a partir de pacientes que deram consentimento por escrito de acordo com padrões éticos estabelecidos por um conselho de revisão independente, composto de cientistas e bioeticistas que não eram empregados da Gene Logic. Cada instituição que forneceu amostras de tecido para GeneLogic obtido consentimento informado de cada doador, ou, se for o caso, o seu representante autorizado, e se encontrou com as exigências do Conselho de Revisão Institucional relevantes e todas as leis aplicáveis, perfil de expressão gênica dados medidos em 548 amostras de tecido colorectal usando Affymetrix HGU133A fritas HGU133B gene (44,928 sondas combinadas) (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA) e dados clínicos de acompanhamento foi comprado de GeneLogic Inc. Experimental e descritores clínicos foram fornecidos para todos os arquivos de dados de chip, além de arquivados digitalmente imagens de microscopia de preparações histológicas. Antes de efetuar a pesquisa de descoberta usando esses dados, o teste rigoroso controle de qualidade foi aplicado a esses dados. Um total de 454 microarrays cumprido os requisitos de controle de qualidade e foram julgados adequados para esta pesquisa de descoberta. Mais detalhes dos procedimentos de controlo de qualidade aplicados a estes dados está prevista no Informações de Apoio S1 Análise de Controle de Qualidade. Descrição dos fenótipos de tecidos para esses dados de descoberta é mostrada na Tabela 3, com repartição fenótipo de câncer na Tabela 4.

padrões de expressão específica do Fenótipo

Além de diferencial padrão análise de expressão, introduzimos uma técnica analítica projetado para filtrar candidatos de sondas diferencialmente expressos para transcrições que fizemos a hipótese foram qualitativamente “virou-on” em sala de aula um fenótipo e qualitativamente “-off transformou” em um fenótipo de comparação. Por este método, a identificação de genes de “off” foi baseado no pressuposto de que relativamente simples a maioria dos genes num dado tecido era

not * constitutivamente expresso acima de um nível relativamente baixo do fundo nominal. Por conseguinte, um micro-arranjo concebido para hibridizar com o transcriptoma humano completo deve, por conseguinte, não exibem específicos de transcrição de ligação para a maioria dos conjuntos de sondas de uma dada experiência. Por outro lado, a intensidade de fluorescência de sondas que hibridaram com o equilíbrio de transcritos não expressa deve reflectir a hibridação de sondas-transcrição “não específica”. A suposição de que uma grande fracção dos conjuntos de sondas para qualquer dada experiência, não estavam sinais específicos de transcrição proporcionados meios para estimar um teórico de ligar /desligar limiar de genes em experiências completa do genoma, como as utilizadas aqui para a descoberta. O nível de expressão significa para todos os 44,928 sondas nos 454 microarrays descoberta foram classificados eo valor de sondas correspondente à 30

th valor percentual através dos dados foi escolhido como o limiar para o silêncio da transcrição. Esse limite representa uma estimativa por cima conservadora de expressão não-específica ou de fundo

Validação de dados:. Amostras de tecido

Para todos (ou seja, teste de hipóteses) experimentos de validação, recolhidos de forma independente amostras de tecido fresco congelado foram obtidos a partir de um banco de tecidos hospital de referência terciária (Flinders Medical Centre, Adelaide, SA Austrália). Uma descrição de casos usados ​​para testes de validação é apresentada na Tabela 3. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa do Hospital Geral de Repatriação e Comité das Flinders Medical Centre de Ética. Consentimento informado por escrito paciente foi recebida para cada tecido estudado. Os espécimes cirúrgicos foram coletadas e processadas como descrito anteriormente [23]

Validação de dados:. personalizado projeto microarray

Para testar os diversos biomarcadores de genes hipotéticos identificadas pela descoberta de análises, um microarray de design personalizado, o “Adenoma Biomarcador Gene Chip”, foi fabricado (Affymetrix). A matriz Adenoma Biomarcador Gene Chip incluiu todos os conjuntos de sondas HGU133-A /B identificadas durante a descoberta, bem como sondas de nível exão que não estavam disponíveis no momento do exercício descoberta original. Cada conjunto de sondas HGU133 descoberta na Adenoma Biomarcador Gene Chip foi anotada a um ou mais símbolos humanos de genes baseados em ferramentas de anotação do NCBI (NCBI36 /hg18) e estes símbolos de genes foram então inversamente volta ao exão de nível sondas projetados por Affymetrix para o HuGene ST 1.0 GeneChip. O microarray personalizado incluído “perfeita-match” de sondas única

Validação de dados:. Extração de RNA

Uma avaria fenotípica dos tecidos utilizados para testes de validação é apresentada na Tabela 3. RNA foi extraído de tecido congelado amostras utilizando Trizol (Invitrogen, San Diego, EUA) tal como recomendado pelo fabricante. Resumidamente, tecidos congelados foram homogeneizados em 300 mL de reagente de Trizol, usando uma broca de Dremel modificados e estéreis descartáveis ​​pilões. 200 ul de reagente de Trizol foi adicionado ao homogenato e as amostras foram incubadas à temperatura ambiente (TA: 25C) durante 10 minutos. 100 ul de (% v /v), em seguida, foi adicionado clorofórmio, as amostras foram agitadas durante 15 segundos, e incubou-se à temperatura ambiente durante 3 minutos.