Abstract

protease específica da ubiquitina 42 (USP42) é um membro da deubiquitinating (Dubs). As alterações de dobragens estão implicados na patogénese de uma ampla variedade de tumores. No entanto, existem poucos estudos sobre a função de expressão e biológico de USP42 no câncer gástrico (GC). Aqui, os níveis de expressão USP42 foram significativamente maiores do que em tecidos de GC em tecidos não tumorais. expressão USP42 foi significativamente correlacionada com o tamanho do tumor, estágio TNM, metástases em linfonodos e sobrevida global de pacientes com GC. Além disso, USP42 silenciamento em duas linhas celulares de GC, a AGS e MKN-45, a proliferação celular nomeadamente inibida, mas estimulada prisão fase G1. As proteínas que promovem a progressão do ciclo celular (ciclina D1, ciclina E1 e PCNA) foram regulados negativamente em células com supressão de USP42. Além disso, a inibição da USP42 em células GC auditivos invasão celular através de afectar a expressão de metaloproteinases de matriz (MMPs) e reguladores de transição (EMT) epiteliais-mesenquimais. Em conclusão, USP42 sobre-expressão pode ser um potencial marcador de prognóstico para a GC, regular as propriedades de sobrevivência e invasivos de GC, e pode representar um alvo molecular terapêutico novo para este tumor

citação:. Hou K, Zhu Z, Wang Y, Zhang C, Yu S, Q Zhu, et ai. (2016) superexpressão e função biológica da Protease ubiquitina-Specific 42 em câncer gástrico. PLoS ONE 11 (3): e0152997. doi: 10.1371 /journal.pone.0152997

editor: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, República da Coreia

Recebido: 29 Dezembro, 2015; Aceito: 22 de março de 2016; Publicação: 31 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Hou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo projecto de investigação científica de Shanghai Comissão Municipal de Saúde e Planejamento Familiar (20124321)

CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declararam que nenhum existem interesses conflitantes.

Introdução

o câncer gástrico (CG) é o quinto câncer mais comum [1] e a terceira principal causa de morte por câncer [2]. principais fatores de risco conhecidos atualmente para GC incluem infecção por Helicobacter pylori (H. pylori), ambiente de vida, dieta, fatores genéticos e imunológicos, e doenças de estômago crônica [3]. O prognóstico entre os pacientes com GC é geralmente pobre, porque o tumor tem muitas vezes metástase ea maioria dos pacientes são idosos (idade média é de mais de 70 anos) no momento em que é diagnosticada. A taxa de sobrevivência de 5 anos para GC é relatado como sendo inferior a 25% [4]. É de grande importância clínica para identificar marcadores de diagnóstico e prognóstico sensíveis de GC, investigar os mecanismos moleculares de desenvolvimento de GC, e explorar novos alvos de terapia desta doença.

protease específica da ubiquitina 42 (USP42) é uma enzima deubiquitinating (DUB) que é amplamente expressos em vários tecidos humanos [5]. Ubiquitinação, uma modificação pós-traducional reversível, está envolvido em vários processos celulares, tais como ciclo celular, a reparação do ADN e a apoptose [6, 7]. Evidências crescentes demonstrou que a função alterada DUB está implicada na patogénese de uma ampla variedade de tumores [8]. Superexpressão de USP9X, USP9Y, USP10 e USP25 foi revelado no cancro da mama por análise de eletroforese em gel de poliacrilamida e proteómica bidimensional [9]. Alguns estudos têm demonstrado que USP22 superexpressão promovida a progressão do câncer e mau prognóstico de glioma, cancro pancreático, cancro do colo do útero e câncer de pulmão [10-13]. USP42 tenha sido previamente encontrado para ser reorganizados na leucemia mielóide aguda [14]. No entanto, para o nosso conhecimento, nenhuma investigação foi realizada sobre o padrão de expressão e funções biológicas de USP42 em GC.

No presente estudo, os níveis de mRNA USP42 em tecidos GC foram encontrados para ser consideravelmente maior para níveis nos controles . Uma análise mais aprofundada características clínicas mostrou que o nível de USP42 expressão foi associada com sobrevida global dos pacientes do GC. Nós então aplicada tecnologia de interferência de RNA (RNAi) para derrubar a expressão de USP42 em duas linhas de células GC (AGS e MKN-45 células), e investigou a proliferação, ciclo celular e capacidade invasiva em ambas as linhas celulares. Nossos dados sugerem que USP42 é um oncogene potente no GC, proporcionando-nos com um alvo futuro para a terapia GC.

Materiais e Métodos

As amostras de tecido

Um total de 90 GC pacientes submetidos à cirurgia no Departamento de cirurgia Geral do Hospital do Povo, Pudong New District (Xangai, China) entre fevereiro de 2007 e junho de 2009 foram incluídos neste estudo. A idade média dos pacientes era de 56 anos (variação: 34-68 anos). Todos os pacientes receberam o consentimento informado por escrito. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética independente do Shanghai Pudong Hospital Popular District (Xangai, China). amostras de tecido de tumor foram obtidas de todos os pacientes de GC. Enquanto isso, 42 combinado amostras não-tumorais localizados 3 cm de distância do tumor foram recolhidos. Todas as amostras cirúrgicas foram congeladas em azoto líquido imediatamente após ressecção cirúrgica, e armazenado a -80 ° C até à extracção do ARN.

As linhas celulares

As linhas celulares derivadas de cancro gástrico humano, incluindo AGS, SGC-7901, BGC-823, MKN-28 e MKN-45 foram obtidos do Instituto de Bioquímica e Biologia celular, da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). Todas as linhas celulares foram mantidas em meio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e antibióticos, a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2.

foram seleccionados por silenciamento de USP42 pequeno ARN interferente (siRNA)

siRNA específico para USP42 humana (5′-AUGGCCUCUGGUAUCAAAU-3 ‘). Uma sequência de encriptação siRNA não específica (SINC) foi utilizado como controlo negativo. Os ARNsi foram transientemente transfectados para células ou AGS MKN-45 utilizando lipofactamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os ensaios foram realizados 48 h após a transfecção.

-PCR em tempo real

O ARN total foi extraído utilizando TRIzol Reagent (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. reacção de transcrição reversa foi realizada com os iniciadores de hexâmeros aleatórios e um kit de transcriptase inversa Superscript (Invitrogen). O cDNA resultante foi utilizado como molde para PCR em tempo real realizado com um kit de SYBR Green PCR padrão (Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA) em ABI7300 (Applied Biosystem, Foster City, CA, EUA) termociclador. GAPDH foi utilizada como controlo do nível de ARN de entrada. Todas as reacções foram realizadas usando os seguintes parâmetros de ciclagem, 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 45 s. Para verificar a amplificação específica de produtos, os produtos foram então sujeitos a análise da curva de dissociação. A expressão do gene foi calculada usando o método Δ Ct. Todos os dados representam a média de três réplicas. As sequências dos iniciadores específicos foram como se segue: mRNA USP42 para a frente, 5′-ATGGAAAGCAGGGATGAC-3 ‘, e USP42 ARNm-inverso, 5′-ACGCAGATTGGAACAGAG-3′; GAPDH mRNA para a frente, 5’- CACCCACTCCTCCACCTTTG-3 ‘, e mRNA GAPDH reverso, 5′- CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’.

Os anticorpos e Western Blotting

Os anticorpos contra CyclinD1, E-caderina, β -catenina, Snail1 e GAPDH foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). Os anticorpos contra USP42, CyclinE1, PCNA, e MMP-9 foram a partir Abcam (Cambridge, MA, EUA). Anti-MMP-2 foi a partir de Epitomics (Burlingame, CA, EUA). Os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano foram Beyotime de Biotecnologia (Xangai, China).

As células foram lavadas três vezes com PBS e depois lisadas em radioimunoprecipitação pré-arrefecida (RIPA) de tampão de ensaio sobre gelo durante 10 min. Após remoção dos detritos celulares por centrifugação (12000 g, 10 min), a concentração de proteína dos sobrenadantes foi medida pelo kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific). Após ebulição durante 5 min em tampão de amostra, uma quantidade igual de proteínas de diferentes grupos foram separados por SDS-PAGE e transferidas para membrana de nitrocelulose para um (Millipore, Bredford, EUA). Após bloqueio com leite desnatado a 5%, as membranas foram incubadas com os anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite com agitação, seguido por incubação com anticorpos secundários correspondentes durante 1 h à temperatura ambiente com agitação. proteína reactiva foi então detectada utilizando o sistema de quimioluminescência ECL (Bio-Rad, Richmond, CA, EUA).

ensaio de proliferação celular por CCK-8

O ensaio CCK-8 foi realizada por métodos convencionais em placas de 96 poços. Resumidamente, 3 × 10

3 células foram semeadas por poço. No ponto de tempo indicado, a CCK-8 solução (10 ul em 100 ul de meio RPMI-1640) foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 1 h. Absorvância a 450 nm foi detectada utilizando um leitor de microplacas.

In vivo com tumor modelo de ratos sem pêlo

foram aprovados

As experiências com animais e realizada de acordo com as orientações do Animal Care e do Comitê Use de Shanghai Pudong District Hospital Popular (Xangai, China). Doze BALB /c nus com idades entre 4-5 semanas de idade (SLAC Animal, Xangai, China) foram mantidos sob condições específicas isentos de agentes patogénicos usando um rack laminar fluxo de ar e tiveram livre acesso contínuo a alimentos esterilizados e água autoclavada. Os experimentos foram iniciados após 1 semana de aclimatação. células AGS (2 × 10

6) foram injectados por via subcutânea no flanco direito de ratinhos nus para estabelecer o modelo de xenoenxerto de tumor de rolamento. Dez dias após a injecção subcutânea, os murganhos foram divididos aleatoriamente em dois grupos (n = 6 /grupo) e injectados IV com USP42 siRNA ou sinc formulações contendo duas vezes por semana. O diâmetro menor e maior do tumor foram medidos com compassos em intervalos de 4 dias, e (3 milímetros

) foi calculada usando a seguinte fórmula padrão do volume tumoral: (diâmetro menor)

2 × (o diâmetro mais longo ) x 0,5. 36 dias após a colocação do tumor, os ratinhos foram sacrificados por deslocamento cervical e os tumores foram recuperados. Foram examinados os pesos húmidos de cada tumor. Durante o procedimento experimental, todos os ratinhos foram monitorizados todos os dias. Nenhuma ratinhos morreram antes do ponto final experimental.

análise do ciclo celular

As células foram tratadas com tripsina, lavadas duas vezes em PBS e fixadas durante a noite a 4 ° C em gelo frio de 70% de etanol. As células foram então lavadas duas vezes em PBS, e incubou-se em iodeto de propídio (PI) a coloração tampão (5 ug /ml de PI e 0,25 mg /ml de RNase, Sigma, St. Louis, MO, EUA) à temperatura ambiente durante 30 min. As células foram então analisadas utilizando um utilizando uma citometria de fluxo FACScan (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). As percentagens de células em G0 /G1, S e G2 /M fase foram determinadas por coloração PI.

ensaios celular invasão

Para medir o potencial invasivo de células de células, ensaios Transwell foram feitas usando uma câmara de Boyden revestidas de Matrigel (BD Biosciences). As células foram privadas de soro durante a noite, colhidas e ressuspensas em meio isento de soro. As células (1 x 10

5) foram, em seguida, foi adicionada à câmara superior. Meio contendo FBS a 10% foi adicionada à câmara inferior. Depois as células foram incubadas a 37 ° C durante 24 horas, as células na superfície superior da membrana foram completamente removido utilizando pontas de algodão. As células migrantes ligados à superfície inferior foram fixadas em paraformaldeído a 4% e coradas com violeta de cristal a 0,5%. O número de células que migraram na superfície inferior da membrana foi contado sob um microscópio em cinco campos em 100 ×.

Bioinformatics análise

conjuntos de dados câncer gástrico foram transferidos do banco de dados Omnibus Gene Expression NCBI (ID de acesso: GSE26253) e The Cancer Genome Atlas (TCGA). Para investigar mais os caminhos biológicos envolvidos na patogênese do câncer gástrico através USP42 caminho, Gene definido análise de enriquecimento (GSEA) foi realizada utilizando o software disponível ao público do Instituto Broad do MIT (https://www.broad.mit.edu/gsea/software /software_index.html) como anteriormente descrito [15]. Para cada conjunto de genes, GSEA define uma pontuação de enriquecimento (ES), o que reflete a correlação entre o conjunto de genes e da amostra.

A análise estatística

análise de sobrevivência de Kaplan-Meier foi realizada utilizando Medcalc ( Mariakerke, Bélgica). A Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versão 17.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL) foi utilizado para a outra análise estatística. Os resultados das experiências são expressos como média ± DP. O teste t de Student foi utilizado para comparar os valores de amostras de teste e controle. teste do qui-quadrado foi utilizado para identificar as diferenças entre as variáveis ​​categóricas. Diferenças estatisticamente significativas foram definidas como tendo um

P

. 0,05

Resultados

A expressão de USP42 no cancro gástrico

Para explorar a expressão de USP42 em GC, foi realizada em tempo real a análise de PCR em CG (n = 90) e amostras de tecido não-cancerosas (n = 42). A expressão relativa de mRNA USP42 comparação com GAPDH foram calculados utilizando o método Ct △. Claramente, a expressão de ARNm foi maior em USP42 tecidos GC do que em tecidos cancerosos (Fig 1A). Para comprovar esta constatação, nós re-analisados ​​dados de microarranjos de TCGA dataset GC independente. Fig 1B mostrou superexpressão óbvia de USP42 em tecidos humanos GC em comparação com tecidos normais.

A. Os níveis de mRNA de USP42 em relação à expressão GAPDH em GC e tecidos não tumorais foram determinados utilizando PCR em tempo real (

P Art 0,0001). B. A expressão de USP42 em GC e tecidos normais com base em TCGA conjunto de dados (

P Art 0,0001). C. Análise de Sobrevivência mostrou que os pacientes com tumores de expressão USP42-maior têm uma sobrevida global mais baixo do que aqueles com tumores de expressão USP42-menor (

P

= 0,0141). D. Análise de Sobrevivência na GSE26253 conjunto de dados.

Usando o valor médio de 2

-ΔCt (0,550) como um corte entre baixo nível e alto nível de expressão de mRNA USP42, 90 pacientes eram classificados em baixas ( 0,550) e subgrupos de expressão USP42 elevadas (≥0.550). Como mostrado na Tabela 1, USP42 foi significativamente associada com o tamanho do tumor (

P

= 0,0328), estádio TNM (

P

= 0,0059) e metástases em linfonodos (

P

= 0,0184). No entanto, não houve associação significativa entre a expressão UP42 e outras características do paciente, incluindo o sexo ea idade dos pacientes no momento do diagnóstico e localização do tumor. Kaplan-Meier análise de sobrevivência revelou que o tempo global de sobrevivência foi significativamente menor nos pacientes com maior expressão USP42 do que em pacientes com menor expressão USP42 (Fig 1C, P 0,05), o qual foi ainda confirmada por análise de sobrevivência em ArrayExpress conjunto de dados (ID de acesso : GSE26253, Fig 1D)

USP42 siRNA suprimida a expressão USP42

Comparação de várias linhas celulares de cancro gástrico revelou que o nível de expressão da proteína USP42 em AGS e MKN-45 células é. mais elevada do que a de SGC-7901, BGC-823 e MKN-28 células (Fig 2A). Portanto, AGS e células MKN-45 foram escolhidos para experiências posteriores. Para explorar as funções de USP42 em GC, batemos expressão USP42 abatido em linhas celulares GC por siRNA transfecção. Como mostrado na Fig 2B, ARNsi específico para USP42 marcadamente suprimida USP42 expressão em células AGS e MKN-45 com uma relação de supressão 60,4% e 74,4%, respectivamente. Em seguida, analisamos se a supressão da expressão USP42 iria alterar a taxa de crescimento de células de GC. Como mostrado na Fig 2C, houve uma redução significativa na taxa de crescimento de células USP42-suprimida quando comparada com as células transfectadas-SINC.

. os níveis de proteína foram determinadas USP42 em diversas linhas de células de GC por Western blot e normalizadas para GAPDH. B. USP42 eficiência silenciamento de ARNsi de transfecção em células AGS e MKN-45 foi avaliada por Western blot. C. USP42 silenciamento por ARNsi transfecção resultou na inibição do crescimento tal como detectado por CCK-8 de ensaio em AGS e células MKN-45. As células transfectadas com ARNsi USP42 ou não-silenciamento siRNA (SINC), durante 48 h, juntamente com as células não tratadas, foram semeadas numa placas de 96 poços e a viabilidade celular foi determinada em pontos de tempo indicados. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P

. 0,001 comparado com SINC

USP42 siARN suprimiu o crescimento de tumores em ratinhos nus

Para determinar o efeito de ARNsi em USP42 tumorigenicidade in vivo, igual número de células AGS foi injectada subcutaneamente em ratinhos nus e USP42-siARN foi injectado IV, após a formação do tumor. A taxa de crescimento de tumores de murganhos injectados com USP42-siARN foi significativamente mais lenta do que a de ratinhos injectados com ARNsi de controlo (figura 3A). O volume e peso dos tumores USP42-ARNip foi inferior a 25% dos tumores de controlo (Fig 3B). Além disso, em comparação com os tumores de controlo, USP42 e PCNA foram significativamente diminuída em tumores com USP42-siRNA injecção (Fig 3C).

A. O volume do tumor foi medido após USP42 siARN (siARN) ou ARNsi de controlo de injecção (SINC). B. Os ratinhos foram sacrificados e os tumores foram recuperadas em 36 dias após a colocação do tumor. As imagens (painel superior) e peso (n = 6, expressos em média ± SD, painel inferior) de tumores recuperados foram mostrados. C. A expressão de USP42 e PCNA em tumores a partir de ratinhos nus foi determinado por western blot. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P

. 0,001 comparado com SINC

prisão /fase G1 G0 induzido em células cancerosas USP42-suprimidos

Para saber como maior expressão USP42 afetados proliferação celular GC, foi realizada Gene Set Análise de Enriquecimento (GSEA) sobre TCGA conjunto de dados, analisando a relação de expressão USP42 e genes em Kyoto enciclopédia de genes e genomas (KEGG) via ciclo celular. Curiosamente, verificou-se que a expressão mais elevada USP42 foi positivamente correlacionada com a via do ciclo celular em pacientes KEGG GC com base no conjunto de dados TCGA (Fig 4A). Em seguida, analisamos a distribuição do ciclo celular de células GC com USP42 knockdown. Suprimindo a expressão USP42 reduziu a população de células de fase S e levou à prisão G1 em AGS e células MKN-45 (Fig 4b). Para explorar ainda mais o mecanismo celular subjacente a proliferação celular induzida por USP42, os níveis de proteínas de proteínas do ciclo celular foram avaliadas. USP42 knockdown reduzida significativamente a expressão da ciclina D1, ciclina E1 e PCNA (Figura 4C). Assim, estes resultados mostram que uma diminuição no nível de expressão USP42 inibida ciclina D1, ciclina E1 e expressão de PCNA em células de GC, o que pode induzir a paragem fase G0 /G1, reduzir significativamente o número de células em fase S e inibir a proliferação celular.

A. análise GSEA em pacientes GC com maior expressão USP42 contra menor expressão USP42 com base em conjuntos de dados TCGA. via ciclo celular KEGG foi associada com USDP42 de maior expressão. A pontuação de enriquecimento (ES, linha verde) reflete a correlação entre o percurso do ciclo celular e da amostra. As barras pretas indicam genes previamente conhecidos associados com vias do ciclo celular. B. USP42 silenciamentos induziu uma /G0 paragem em G1 em células de GC. histogramas FACS e análise do ciclo celular de células AGS e MKN-5. A quantificação da percentagem de células em G0 /G1, S, e G2 de fase /M foi mostrado. C. Expressão de proteínas-chave no ciclo celular foi determinada por Western blot. Todos os ensaios foram realizados em triplicado. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P

. 0,001 comparado com SINC

Baixo potencial invasivo de células cancerosas USP42-suprimidos

GSEA também indicou que a expressão USP42 foi positivamente correlacionada com metástases (Fig 5A). Para verificar estes resultados, num ensaio in vitro, examinou-se o potencial invasivo das células reprimidas-USP42 usando um ensaio in vitro em Matrigel invasão (Fig 5B). As células reprimidas-USP42 exibiu potencial significativamente menos invasiva do que as células de Sinc-transfectadas (

P

0,01)., Sugerindo que a expressão elevada de USP42 reforçada invasividade tumoral

. análise GSEA em pacientes GC com maior expressão USP42 contra menor expressão USP42 com base em conjuntos de dados TCGA. via celular metástase foi associada com USDP42 de maior expressão. A pontuação de enriquecimento (ES, linha verde) reflete a correlação entre a via de metástase e da amostra. As barras pretas indicam genes previamente conhecidos associados com a metástase de células via. B. USP42 silenciamento diminuiu a invasão de células como detectada por meio de ensaio de invasão in vitro. C, D. Expressão de proteínas chave em metástase e EMT foi determinado por western blot. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P

. 0,001 comparado com SINC

a degradação da matriz extracelular através de metaloproteinases de matriz (MMPs), é um processo crítico durante a invasão de células [16]. Como mostrado na Fig 5C, o silenciamento de USP42 regulada negativamente a expressão de MMP-2 e MMP-9.

Além disso, os níveis de proteína de reguladores da via-epiteliais mesenquimais transição (EMT), os quais estão estreitamente relacionados com a metástase de células de tumor, foram analisados ​​por Western blot (Figura 5D). Transfecção de USP42 siRNA reduziu significativamente os níveis de β-catenina, Twist and Snail1 expressão, enquanto aumenta a E-caderina.

Discussão

Vários membros da família DUB são conhecidos por contribuir para a carcinogênese, incluindo USP1 [17], USP2 [18], USP7 [19, 20] e USP22 [10-12, 21], enquanto outros Dubs são regulados negativamente em cancros humanos, incluindo USP10 [22] e BaP1 [23]. No entanto, pouco se sabe sobre o padrão de expressão e funções biológicas de USP42, um DUB para p53 [24] e a histona H2B [25], nos cancros humanos. Em nosso estudo, mostramos pela primeira vez que os tecidos GC expressam altos níveis de mRNA USP42 em comparação com os correspondentes tecidos não-tumorais. Além disso, a expressão USP42 foi associado com o tamanho do tumor, estágio TNM, metástases em linfonodos e sobrevida global dos pacientes do GC (Fig 1). Nossas descobertas forneceu informações valiosas para a previsão de resultados clínicos de pacientes com GC.

Nós presumido que USP42 pode atuar como um fator oncogênico durante o desenvolvimento GC. Nós então aplicada tecnologia de RNAi, que é amplamente utilizado na investigação sobre o cancro ou terapia de câncer, para derrubar expressão USP42 em duas linhas de células GC (Fig 2B). Redução de expressão de USP42 efetivamente diminuiu a proliferação de células cancerosas in vitro (Fig 2C) e

in vivo

(Fig 3). dados GSEA revelou a associação de percurso do ciclo celular com expressão USP42 (Fig 4A). Em seguida, aplicada uma análise do ciclo celular por FACS (Figura 4B) e a análise da expressão de ciclina D1, ciclina E e PCNA por Western blot (Figura 4C). Nossos dados revelaram que USP42 siRNA teve um efeito inibitório sobre o crescimento de células GC via indução de prisão G0 /G1.

GC é um dos cancros mais comuns e continuou a ser um grave problema de saúde pública no mundo. Alta incidência de metástases ainda é uma das principais causas para a baixa sobrevida dos pacientes GC [4]. GSEA em TCGA conjunto de dados revelou a associação da via de metástase com expressão USP42 em GC (Fig 5A). Além disso, no ensaio in vitro de invasão indicou que USP42 knockdown diminuiu a capacidade invasiva de linhas de células imortalizadas de GC (Fig 5B). Assim, os nossos dados indicam que a expressão elevada de USP42 em GC pode promover metástase de tumor e está associada com a evolução clínica de pacientes do GC. Em seguida, tentamos explorar os mecanismos subjacentes ao avaliar a expressão de MMPs e reguladores de EMT em células cancerosas USP42-suprimidos. MMP-2 [26] e MMP-9 [27] são conhecidos para mediar a degradação da matriz extracelular e estão relacionados com metástase de nódulo linfático de GC. EMT está envolvida na patogénese do complexo de tumores [28]. Aqui, o silenciamento de USP42 induzida a expressão do factor principal de EMT (E-caderina), mas diminuiu a expressão de MMP e três indutores conhecidos de EMT (β-catenina, torção e Snail1) (Fig 5C e 5D). Essas descobertas sugeriram o papel da USP42 como um gene promotor de invasão via afetando a expressão de MMPs e reguladores de EMT, embora mais estudos são necessários para esclarecer os mecanismos exatos.

Em resumo, o presente estudo demonstrou que a expressão USP42 foi aumentou significativamente nos tecidos GC. O aumento da expressão USP42 pode ser importante para a progressão do tumor e a metástase de GC, e pode servir como um marcador de prognóstico para a doença. Nossos in vitro resultados mostraram que o silenciamento de USP42 inibiu a proliferação celular via indução /paragem G1 G0 e suprimiu a invasão da célula via MMPs e reguladores EMT. Assim, USP42 pode ser um novo alvo molecular terapêutico para GC.

Reconhecimentos

Este estudo foi apoiado pelo projecto de investigação científica de Shanghai Comissão Municipal de Saúde e Planejamento Familiar (20.124.321).