Abstract

Os receptores tirosina-quinase Ef mediar sinais juxtacrine interagindo “em

trans” com ligantes ancorada a superfície de células vizinhas por meio de uma âncora de GPI (efrina-a) ou um segmento transmembranar (efrina-B), o que leva a agrupamento do receptor e um aumento da actividade de quinase. Além disso, as formas solúveis de ligandos efrina-A libertados da superfície celular por metaloproteases da matriz pode também activar a sinalização de receptores EphA. Além destes

interações trans, estudos recentes revelaram que os receptores Eph e Efrinas co-expressas nos neurônios também podem se envolver em lateral, “

cis

” associações que atenuam a ativação do receptor por Efrinas em

trans

com consequências funcionais críticos. Apesar da importância do sistema /ephrin Ef na tumorigênese, Ef receptor-ephrin

cis

interações não foram investigados anteriormente em células cancerosas. Aqui nós mostramos que nas células cancerosas, co-expressos ephrin-A3 pode inibir a capacidade do EphA2 e EphA3 para ligar Efrinas em

trans e tornar-se activado, enquanto ephrin-B2 pode inibir não apenas EphB4 mas também EphA3. O

cis

inibição da EphA3 por ephrin-B2 implica que, em alguns casos Efrinas que não pode ativar um receptor Eph especial no

trans

pode, no entanto, inibir a sua capacidade de sinalização através de

cis

Associação. Nós também descobrimos que uma mutação EphA3 identificado em aprimora cancro do pulmão

cis

interação com ephrin-A3. Estes resultados sugerem um novo mecanismo que pode contribuir para a patogênese do câncer atenuando o tumor efeitos do receptor Eph vias ativadas por Efrinas em

trans sinalização suprimindo.

Citation: Falivelli G, Lisabeth EM, de la Torre ER, Perez-Tenorio G, Tosato G, Salvucci O, et al. (2013) Atenuação de Ef Receptor Kinase de ativação em células cancerosas por co-expressos ephrin ligantes. PLoS ONE 8 (11): e81445. doi: 10.1371 /journal.pone.0081445

editor: Renping Zhou, da Universidade Rutgers, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de agosto de 2013; Aceito: 21 de outubro de 2013; Publicação: 29 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Falivelli et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health concede P01CA138390 e P01HD025938, conceder 18XT-0099 do tabaco-relacionada Programa Disease Research (EBP), uma bolsa de pós-doutorado da Fundação Espanhola para a Ciência e Tecnologia (FECYT, ERT), Institutos Nacionais de pós-doutorado da Saúde T32CA121949 bolsa de formação e pós-bolsa 20FT-0076 do Tobacco-Related Disease Research Program (EML) e pós-doutorado Dnr 2009-7360 do Conselho de Pesquisa sueco (GP). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

membros da grande família de receptores de tirosina-quinase Ef, e particularmente o EphA2 e EphB4, são sobre-expressos em uma ampla variedade de tipos de tumor [1,2]. receptores Eph sinalizar através da interação “em

trans” com Efrinas expressa em células vizinhas, que promove o agrupamento receptor, autofosforilação e atividade da quinase [3]. As formas solúveis de ligandos efrina-A libertados da superfície celular por metaloproteases da matriz pode também activar os receptores EphA [4-7]. No entanto, receptores Eph em células de cancro são frequentemente mal tirosina fosforilada [3]. Isto sugere baixa activação por ligandos efrina e é consistente com o tumor efeitos relatados para um número de vias de sinalização de receptor Eph a jusante [1,8,9] supressora.

A falta de ativação substancial receptor Eph é, em alguns casos devido à baixa expressão de ephrin ligantes em células cancerosas com expressão do receptor de alta [1,10-13]. Além disso, vários outros mecanismos pode manter a activação do receptor Eph baixa em células de cancro que também expressam ligandos efrina. Por exemplo, as mutações de cancro têm sido mostrados para perturbar a capacidade ou a actividade de quinase de receptores Eph [14,15] ligação efrina. Além disso, a falta de adesão célula-célula dependente de E-caderina pode prejudicar a activação do receptor EphA2 em células de cancro da mama, sugerindo ineficiente do EphA2

trans

interacção com efrinas [16]. Outro mecanismo potencial para atenuar receptor Eph sinalização a jusante em células cancerosas poderia envolver inibitória laterais

cis

interações entre receptores Eph e Efrinas co-expressas nas mesmas celas [2,17,18]. Inibitória

cis

interacções com efrinas demonstraram desempenhar um papel importante na sintonia fina de activação de receptor Eph no sistema nervoso para controlar com precisão o pathfinding axónio e função sináptica [1,18-21]. No entanto,

cis

interações não ocorrem em todos os neurônios coexpress� receptores Eph e efrinas porque em alguns receptores de neurônios e ligantes ocupam microdomínios distintas da membrana plasmática e, portanto, não pode se misturam [20,22]. Se

cis

interações entre receptores e Efrinas também pode ocorrer em células cancerosas Ef não foi previamente investigado.

Os estudos bioquímicos e estruturais têm demonstrado que

cis

interação envolve um Ef interface de ligação distinto do receptor-ephrin mediar a interação de alta afinidade no

trans [18,23]. A região extracelular de ambas as classes de receptores EphA e EphB contém um domínio de ligação ao ligando do terminal N, uma região rica em cisteína e dois domínios de fibronectina de tipo III [3]. O segundo domínio de fibronectina é seguido por um segmento transmembranar e uma região citoplasmática que inclui o domínio da tirosina-cinase, um domínio de SAM e um motivo de ligação PDZ. As efrinas consistem de um domínio de ligação ao receptor Eph N-terminal ligada por uma região ligante curta para uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) para o efrina-A e um segmento transmembranar seguido de uma curta região citoplasmática para o efrina-B. Ef ligação em receptores de efrina

trans

envolve, principalmente, a interacção entre o circuito do G-H da efrina e um bolso no interior do domínio de ligação ao ligando do receptor Eph [24]. Estas interfaces predominantemente apoiar as interacções de receptores Eph promíscuos com efrinas pertencentes à mesma classe A ou B. Por outro lado,

cis

interacções têm sido propostos para envolver a fibronectina de tipo III domínios do receptor Eph e uma região do domínio de ligação ao receptor da efrina, que é distinto do circuito de GH [18,23 ].

Aqui nós mostramos que os receptores Eph e Efrinas co-expressas em células cancerosas podem se envolver em

cis

interações que inibem a ativação do receptor Ef por Efrinas em

trans. Curiosamente, foram detectadas a inibição da activação através EphA3

cis

interacção não só com ef rina-A3, mas também Efrina-B2, o que não é um ligando de activação para EphA3 [25], sugerindo que

cis

interacções não exibem a mesma selectividade de receptor-ligando, como

interacções trans. Também descobriram que uma mutação câncer de pulmão identificadas no repeat segundo tipo fibronectina III do EphA3 aumenta a

cis

associação do receptor com ephrin-A3.

Resultados

Ephrin-A3 co-expressão em células cancerosas atenua a ativação do receptor EPHA em trans por solúvel ephrin-A3

Para investigar o efeito da co-expressão ephrin no receptor Eph sinalização no cancro células, examinámos EphA3 (um receptor Eph para o qual inibidora

cis

interacções com efrina-a têm sido extensivamente estudadas em neurónios [17,18,20]) e o EphA2 (o receptor Epha mais amplamente expresso em células cancerosas [1,26-28], mas para o qual os efeitos do

cis

interações não foram investigados anteriormente). Nós infectadas a linhas celulares de cancro do pulmão A549 NCI-H226 e com lentivírus que codifica EphA3 ZsGreen e a partir de um transcrito ou bicistr�ica única ZsGreen como um controlo. Após selecção por separação por FACS, que ainda infectado as células com lentivírus que codificam ef rina-A3 marcado com mCherry ou única mCherry como controlo, seguido de selecção. As duas linhas de células de cancro lentivirally infectadas, que não expressam EphA3 endógena detectável ou ef rina-A3 (Figura 1), foram então tratadas com ef rina-A3 Fc (uma forma solúvel do ligando ef rina-A3 fundido com a porção Fe de IgG humana

1) para activar EphA3 através ephrin obrigatório em

trans. Ef rina-A3 Fc aumento da fosforilação da tirosina do receptor nas células que co-expressam EphA3 com controlo mCherry, como esperado, mas não nas células que co-expressam EphA3 com mCherry-ef rina-A3 (Figura 1A, B). Ef rina-A3 co-expressão também atenuou a activação induzida por Fc ef rina-A3 do EphA2 endógeno em células A549 (Figura 1C). Assim, em células de câncer de pulmão, co-expressos ephrin-A3 pode inibir EphA2 e ativação EphA3 por ligantes ephrin.

(B, A) NCI-H226 e do pulmão A549 células cancerosas foram infectados com uma EphA3 codificação lentivírus e ZsGreen sozinho ou em conjunto com uma codificação lentivírus mCherry-ef rina-A3; células de controlo foram infectados com lentivírus que codifica ZsGreen e mCherry. imunoprecipitados EphA3 foram sondados por immunoblotting para fosfotirosina (pTyr) e sondado para EphA3. Os lisados ​​foram sondadas para mCherry-ef rina-A3 com um anticorpo anti-dsRed que também reconhece mCherry, para EphA3, e para β-tubulina como controlo de carga. Os histogramas mostram meios normalizados ± SE quantificada a partir de 3 imunomanchas em ambas, A e B. Numa das experiências A549 utilizados para quantificação, as células foram estimuladas com Efrina-A5 Fc. ** P 0,01 por um teste t de amostras de comparação de células-efrina A3 tratados com Fc que expressam tanto EphA3 e efrina-A3 com ef rina-A3 células tratadas com Fc expressando apenas EphA3. É de notar que os níveis de EphA3 foram maiores nas células que co-expressam A549 ef rina-A3 /Efrina-B2 (ver também Figs. 2A, 3B, 4A e 5C, D), sugerindo que este receptor pode ser estabilizado por co-expressas as efrinas. (C) As células A549 foram infectadas com uma codificação-lentivírus mCherry-efrina A3 ou mCherry como um controlo. Imunoprecipitada EphA2 endógena foi sondada por imunotransferência para fosfotirosina (pTyr) e sondado para o EphA2. Os lisados ​​foram sondadas com um anticorpo anti-dsRed e β-tubulina como controlo de carga. O histograma mostra meios normalizados ± SE quantificados a partir de 3 imunotransfer�cias. ** P . 0,01 pelo teste de uma amostra t de comparação de células tratadas com Fc ephrin-A3 expressar ou não expressar ephrin-A3

A co-expressão com ephrin-A3 em células cancerosas prejudica a capacidade de EphA3 para ligar efrina, como em trans

para examinar se em células cancerosas ephrin-A3 co-expressão prejudica a capacidade de EphA3 para ligar ligantes ephrin-a em

trans

, medimos a ligação de solúvel formas de efrina-A5 ou ef rina-A3 fundido com a fosfatase alcalina (AP) com o NCI-H226 e A549 células que expressam EphA3 sozinho ou em conjunto com mCherry-ef rina-A3. Detectamos efrina-A AP ligação a células expressando EphA3 única, mas não para células que co-expressam ef rina-A3 com EphA3 (Figura 2A). Imunotransferência verificou-se que ef rina-A3 co-expressão não diminui os níveis globais EphA3 (Figura 2A). A biotinilação das proteínas da superfície celular, seguido por um ensaio ELISA em que EphA3 foi capturado com um anticorpo e o seu nível de biotinilação foi detectada com estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano (HRP) mostrou que efrina-A3 co-expressão não afecta a fracção de EphA3 presente na célula superfície (Figura 2B). Assim, co-expressos ephrin-A3 em células de câncer de pulmão inibe ephrin ligação a EphA3 em

trans sem reduzir a expressão EphA3 ou localização superfície.

células cancerosas NCI-H226 e do pulmão A549 (A) foram infectados com um EphA3 codificação lentivírus e ZsGreen sozinho ou em conjunto com uma codificação lentivírus mCherry-ef rina-A3; células de controlo foram infectados com lentivírus que codifica ZsGreen e mCherry. Os histogramas mostram a ligação da efrina-A5 AP para as células NCI-H226 e efrina-A3 AP para as células A549, revelando que a co-expressão ef rina-A3 impede a ligação de proteínas efrina AP para EphA3. meios normalizados a partir de 2 experimentos (cada um com amostras em triplicado) ± SE são mostrados. ** P 0,01 por ANOVA one-way e teste post-hoc de Dunnett para a comparação com células que expressam única EphA3. Os imunoblots mostram a expressão de EphA3, ef rina-A3, e β-tubulina como controlo de carga, em lisados ​​celulares, verificando-se que a co-expressão ef rina-A3 não reduziu os níveis EphA3. De facto, os níveis EphA3 aparentemente mais elevada nas células que co-expressam A549 ef rina-A3. O espaço em branco indica a remoção de uma pista irrelevante. biotinilação (B) da superfície celular, seguido por um ensaio ELISA em que EphA3 foi capturado com um anticorpo imobilizado e a sua biotinilação detectado com estreptavidina-HRP revela uma fracção de EphA3 semelhante sobre a superfície de células que expressam EphA3 sozinho ou em conjunto com ef rina-A3. O histograma mostra as médias de 2 experiências (cada um com amostras em triplicado) ± SE. A incubação com o dobro de lisados ​​produziram resultados semelhantes, indicando que foi conseguida ligação máxima ao anticorpo imobilizado nos poços EphA3. ** P 0,01 por ANOVA one-way e teste post-hoc de Tukey para a comparação com células que expressam mCherry e ZsGreen; p 0,05 para a comparação de células que expressam EphA3 com e sem ef rina-A3. (C) EphA3 Fc foi usado para menus pendentes de meio condicionado e lisados ​​de células A549 ou H226 infectadas com os lentivírus indicados. Por immunoblotting com um anticorpo anti-dsRed, ef rina-A3 foi detectada apenas nos lisados. Os menus pendentes também foram sondados para Fc para verificar os níveis de EphA3 Fc. (D) As proteínas de superfície foram biotiniladas em células infectadas com lentivírus que codificam mCherry, mCherry-ef rina-A3, ou mCherry-ef rina-A3 em conjunto com EphA3 e ZsGreen. imunoprecipitados mCherry-ef rina-A3 (com anticorpo anti-dsRed) foram sondados com estreptavidina-HRP, demonstrando níveis semelhantes da superfície das células de efrina-A3 expressa sozinha ou em conjunto com EphA3. IgG, immunoprecipitate controle com IgGs não-imunes. Os lisados ​​foram sondadas para mCherry-ef rina-A3 com anticorpo anti-dsRed.

Uma possível explicação para estes resultados pode ser que solúvel ephrin-A3 lançado no meio de cultura por metaloproteases de matriz [4-6] iria competir com ephrin-A3 AP para a ligação ao EphA3 ligando de ligação domínio. Para abordar esta possibilidade, utilizou-se o domínio extracelular de EphA3 fundida com Fc para puxar para baixo ef rina-A3 a partir do meio de cultura ou das células lisadas num volume equivalente ao de meio de cultura. Ef rina-A3 podia ser detectada por imunotransferência nos menus pendentes a partir de lisados ​​celulares, mas não a partir do meio de cultura (Figura 2C), o que indica que a grande maioria da ef rina-A3 permaneceu associada com as células durante o período de tempo de 24-48 horas das nossas experiências. Além disso, uma única banda mCherry-ef rina-A3 foi observada nos imunoblots, tornando improvável que uma porção substancial da efrina foi clivada para gerar uma forma menor restante associado com as células por ligação a um receptor de Efa. A biotinilação das proteínas da superfície celular, seguido por detecção do imunoprecipitado biotinilado ef rina-A3 com estreptavidina-HRP confirma que efrina-A3 é similarmente localizada na superfície de células A549, quando expressa sozinha ou em conjunto com EphA3 (Figura 2D).

interacção cis-EphA3-efrina A3 não exige que o receptor de ligação ao ligando de domínio

Estudos anteriores demonstraram que as interacções cis requerem a localização da membrana do receptor Eph e o efrina [18]. Portanto, para examinar se é necessário o domínio EphA3 de ligação ao ligando para

cis

interação com ephrin-A3 ou se o tipo de fibronectina III repetições são suficientes para mediar

cis

vinculativo [18,23] , que transientemente transfectadas células HEK293 que expressam estavelmente mCherry-ef rina-A3 com plasmídeos que codificam EphA3 ΔN (uma forma truncada de EphA3 que falta o terminal N do domínio de ligação ao ligando e cisteína-região rica) ou de comprimento completo EphA3. Em experiências coimmunoprecipitation com um anticorpo anti-EphA3 que reconhece a região do terminal C do receptor, que detectada associação de efrina-A3 com ambos de comprimento completo e truncado EphA3 (Figura 3A). Isto confirma que o domínio EphA3 ligando de ligação, que medeia obrigatório em alta afinidade

trans

, não é necessário para EphA3-efrina-A3

cis

interação. células

(A) HEK AD-293 foram infectadas com uma codificação-lentivírus mCherry-efrina A3 ou mCherry como um controlo. Subsequentemente, as células foram transfectadas com plasmídeos de codificação de comprimento completo EphA3 ou uma sua forma truncada sem o domínio de ligação ao ligando e a região rica em cisteína (EphA3 ΔN). imunoprecipitados EphA3 foram sondados com anti-ephrin-A3 anti-soro e sondado para EphA3, revelando que a associação ephrin-A3 com EphA3 não requer o domínio EphA3 ligando de ligação. O histograma mostra meios normalizados ± SE quantificado a partir dos imunoblots de 2 experiências. p 0,05 por um teste t de amostras de comparação de efrina-A3 ligado ao EphA3 ΔN ou de comprimento completo EphA3. células (B) HEK AD-293 infectadas com uma codificação lentivírus mCherry-ef rina-A3, o mutante mCherry-ef rina-A3 E129K, ou mCherry como controlo, foram transfectados com um plasmídeo que codifica EphA3 ΔN. imunoprecipitados EphA3 foram sondados para ephrin-A3 e sondado para EphA3, revelando que a mutação E129K não abole o

cis

interação com EphA3. O histograma mostra meios normalizados ± SE quantificados a partir de 3 imunotransfer�cias. p 0,05 por uma amostra de teste t de comparação de ephrin-A3 E129K contra ephrin-A3 do tipo selvagem obrigado a EphA3 ΔN. células AD-293 (C) HEK foram transfectadas com pcDNA3 de controlo, pcDNA3-ef rina-A3, ou pcDNA3-ef rina-A3 E129K. O histograma mostra as médias de duas experiências para a ligação de AP para EphA3 Efrina-A3, confirmando que mutante ef rina-A3 E129K não se liga EphA3 em

trans. *** P 0,001 por ANOVA one-way e teste post-hoc de Dunnett para a comparação com células que expressam o tipo selvagem ephrin-A3. A imunotransferência mostra a expressão de efrina-A3 e ephrinA3 E129K nas pistas carregadas com quantidades iguais de lisados ​​totais. Deve notar-se que ef rina-A3 sobre-expressos em células HEK produz duas bandas, com a banda superior corresponde ao tamanho da proteína madura de comprimento total.

Para investigar o efeito da mutação do GH efrina loop, nós examinamos a mutação E129K em ephrin-A3. Esta mutação não impediu que o

cis

Associação de ephrin-A3 com EphA3 ΔN (Figura 3B), mesmo que ele aboliu o

interação trans com EphA3 AP (Figura 3C). Estes resultados são consistentes com os obtidos com o correspondente mutante efrina-A5 E129K, que também ainda pode atenuar através

cis

fosforilação EphA3 interacção bem como Epha mediada colapso do cone de crescimento e orientação de axónios desencadeada por ligandos efrina-A em

trans [18,20]. Assim, EphA3 e ephrin-A3 pode associar uns com os outros, mesmo quando faltam as regiões que medeiam obrigatório em alta afinidade

trans

, apoio à participação geral no

cis

interações do Ef fibronectina de tipo III domínios e uma região efrina distinto do circuito de GH.

mutação O câncer de pulmão EphA3 G518L aumenta a interação cis com co-expressos ephrin-A3

estudos de sequenciamento recentes identificaram mutações EphA3 em câncer de pulmão e outros cancros, e caracterização funcional revelou que muitos são deficitária mutações de função de que inibem a ligação da efrina, a actividade de cinase e /ou localização na superfície celular, o que sugere um papel supressor de tumores para o tipo selvagem EphA3 [14,15,29]. Uma das poucas mutações que não foram encontrados de prejudicar qualquer uma das propriedades EphA3 examinados em um estudo anterior, mas ligeiramente aumentado de localização na superfície celular EphA3, é a mutação G518L no domínio segundo tipo fibronectina III [14]. Desde G518 em EphA3 corresponde a um resíduo conservado que na estrutura cristalina EphA2-ephrin-A5 participa do

cis

interface, examinamos se a mutação G518L pode afetar o

cis

associação de EphA3 co-expresso com ef rina-A3. Para focalizar o papel da interação cis, usamos EphA3 ΔN ou o mutante EphA3 ΔN G518L. Coimmunoprecipitation experiências utilizando células HEK293 que co-expressam mCherry-ef rina-A3 com EphA3 ΔN ou o mutante ΔN G518L revelou mais ef rina-A3 associado com o mutante (Figura 4A). Medição da efrina-A5 AP ligação verificou-se que a co-expressão ef rina-A3 com a de comprimento completo EphA3 G518 mutante inibiu a sua capacidade de se ligar efrinas em trans (Figura 4B). Estes resultados sugerem que a mutação G518L aumenta obrigatório em EphA3-ephrin

cis

e apoia o envolvimento no

cis

de interface da glicina conservado no domínio segundo tipo fibronectina III [23].

células AD-293

(a) HEK foram infectadas com uma codificação-lentivírus mCherry-efrina A3 ou mCherry como um controlo. As células foram então transfectadas com EphA3 ΔN ou o mutante EphA3 ΔN G518L. EphA3 imunoprecipitados foram sondadas com um anti-soro anti-ephrinA3 e sondado para EphA3. A mutação EphA3 G518L encontrado no cancro do pulmão aumenta a afinidade da interacção lateral entre EphA3 e efrina-A3. O histograma mostra meios normalizados ± SE quantificado a partir dos imunoblots de 3 experiências. * P 0,05 por uma amostra de teste t para a comparação do mutante EphA3 ΔN G518 contra EphA3 ΔN. (B) células de cancro do pulmão A549 foram infectadas com um lentivírus EphA3 codificação do tipo selvagem ou o mutante G518L e ZsGreen sozinho ou em conjunto com uma codificação lentivírus mCherry-ef rina-A3; células de controlo foram infectados com lentivírus que codifica ZsGreen e mCherry. O histograma mostra a ligação de células ef rina-A3 AP (um ensaio) e efrina-A5 AP (2 experiências), confirmando que a co-expressão ef rina-A3 impede a ligação de proteínas efrina AP para o mutante EphA3 G518L. meios normalizados a partir de 3 experimentos (cada um com amostras em duplicado) ± SE são mostrados. *** P 0,001 por ANOVA one-way e teste post-hoc de Tukey para a comparação das células de coexpress� EphA3 e ephrin-A3 com apenas as células que expressam EphA3 e de comparação de células coexpress� EphA3 G518L e ephrin-A3 com apenas células expressando EphA3 G518L. O immunoblot de lisados ​​celulares mostra expressão de EphA3, ephrin-A3 e β-tubulina como controlo de carga.

Ephrin-B2 co-expressão em células cancerosas atenua não só EphB4 mas também a ativação EphA3 e ligando- capacidade de ligação em trans

Cis

interacções entre a fibronectina de tipo III Ef domínios e efrinas poderia ter selectividade diferente em comparação com

interacções

trans que envolvem o domínio de ligação ao ligando de Eph e o ephrin GH ciclo [23]. Para investigar isto, utilizou-se Efrina-B2, que não se liga com elevada afinidade para o domínio de ligação ao ligando EphA3 [25]. Nós infectado A549 células do cancro do pulmão e cancro da mama células MCF-7 com uma codificação lentivírus ephrin-B2 fundido a EGFP e primeira examinou os efeitos sobre EphB4 endógena, que se liga ao ligando ephrin-B2 em

trans. Como EphA2, EphB4 é amplamente expresso em células cancerosas [1,30] e sua capacidade de ser regulada por Efrinas em

cis

não foi analisada anteriormente. Descobrimos que a expressão efrina-B2 inibe a ligação de AP efrina-B2 para a superfície celular (Figura 5A) e a fosforilação da tirosina induzida em EphB4

trans por efrina-B2 Fc (Figura 5B). Assim,

cis

interação com co-expressos ephrin-B2 inibe obrigatório em

trans e ativação em células cancerosas ligando EphB4. Para examinar se EphA3 também pode ser regulado por

cis

interacção com Efrina-B2, que infectaram células de cancro do pulmão A549 que expressam EphA3 com lentivírus que codificam-EGFP-efrina B2 ou única EGFP como um controlo. Curiosamente, efrina-B2 co-expressão atenuada por activação EphA3 ef rina-A3 Fc (Figura 5C) e inibiu a capacidade de se ligar EphA3 efrina-A5 AP sem diminuir os níveis globais EphA3 (Figura 5D). EphA3 expressão apenas um ligeiro aumento da ligação do domínio extracelular do AP efrina-B2 para as células (Figura 5D), o que confirma que efrina-B2 não se liga de forma eficiente para EphA3 em

trans [25]. Estes resultados sugerem que, embora ephrin-B2 não é um ligando activador para EphA3, pode afetar a função EphA3 através de

cis

interação. Isto implica que as especificidades de ligação que governam

cis

e

trans

interacções receptor-ephrin Ef não são os mesmos.

(A) O histograma mostra a ligação de AP efrina-B2 para células A549 infectadas com lentivírus que codifica EGFP-efrina-B2 ou EGFP, revelando que a co-expressão efrina-B2 inibe a Efrina-B2 ligação a AP EphB4. meios normalizados a partir de 3 experimentos (cada um com amostras em triplicado) ± SE são mostrados. *** P 0,001 pelo teste t não emparelhado de comparação de células que expressam efrina-B2 com as células não expressando efrina-B2. A imunotransf erência dos lisados ​​de células mostra a expressão de EphB4, efrina-B2 e β-tubulina como controlo de carga. (B) células cancerosas A549 pulmão e cancro da mama células MCF-7 foram infectados com lentivírus que codifica-EGFP-ephrin B2 ou EGFP. EphB4 imunoprecipitados foram sondadas por imunotransferência para fosfotirosina (pTyr) e sondado para EphB4. Os lisados ​​celulares foram sondadas para efrina-B2 com um anticorpo anti-EGFP e para β-tubulina como controlo de carga. Os histogramas mostram meios normalizados ± SE quantificada a partir de 2 imunoblots para cada linha celular. * P 0,05 por um teste t de amostras de comparação de células tratadas com Fc efrina-B2 expressam efrina-B2 com as células não expressando efrina-B2. (C) As células A549 foram infectadas com uma EphA3 lentivírus codificação e ZsGreen em conjunto com uma codificação lentivírus EGFP-efrina-B2, ou apenas EGFP. As células de controlo foram infectadas com lentivírus codificação ZsGreen e EGFP. imunoprecipitados EphA3 foram sondados por immunoblotting para fosfotirosina (pTyr) e sondado para EphA3. Os lisados ​​foram sondadas para efrina-B2 com um anticorpo anti-EGFP, bem como para EphA3 e para β-tubulina como controlo de carga. O histograma mostra meios normalizados ± SE quantificados a partir de 2 imunotransfer�cias. * P 0,05 por um teste t de amostras de comparação de células-efrina A3-tratadas que expressam Fc efrina-B2 com as células não expressando efrina-B2. (D) Efrina-A5 ligação a AP EphA3 superfície da célula é inibida por co-expressão efrina-B2. O histograma mostra as médias ± DP de 3 experiências (cada um com amostras em triplicado) para a ligação da efrina-A5 AP ou AP efrina-B2 para as células A549 utilizados para a experiência em C. Para a ligação da efrina-A5, ** P 0,01 pelo one-way ANOVA e teste post-hoc de Dunnett para a comparação com células que expressam EphA3 e EGFP; para AP efrina-B2 ligação, ** p 0,01 pelo teste t não emparelhado de comparação de células que expressam ou que não expressam EphA3. A imunotransf erência dos lisados ​​de células mostra a expressão de Efrina-B2, EphA3 e β-tubulina como controlo de carga, verificando-se que a co-expressão efrina-B2 não reduziu os níveis EphA3. Digno de nota, o dupleto correspondente a sobre-expresso efrina-B2 não é devido aos diferentes graus de glicosilação N-ligada porque a remoção de oligossacarídeos N-ligados com o PNGase-F endoglicosidase semelhante aumentou a mobilidade em SDS-PAGE das duas bandas (não mostrado). Se a banda superior pode representar um formulário com oligossacarídeos ligados a O [51] ou outra modificação pós-tradução continua a ser determinado.

endógenos Efrina-Como atenuam a ativação do EphA2 co-expressos em células cancerosas

Para investigar se Efrinas endogenamente expressos em células cancerosas também podem envolver-se em

cis

interações que inibem a ativação de receptores Eph endógenos co-expressas, nós escolhemos as linhas de células de cancro da mama SKBR3 e MCF7. Estas linhas expressam altos níveis de ligandos efrina-A juntamente com o EphA2 [11] (broadinstitute.org/ccle), embora o receptor é expresso a níveis relativamente baixos, consistente com a expressão complementar dos receptores Eph e efrinas observado em muitas linhas celulares de cancro [1]. Uma vez que tanto SKBR3 e MCF7 células expressam vários ligandos efrina-A, que são ancoradas a GPI, foi utilizada a enzima específica de fosfatidilinositol-fosfolipase C (PLC-PI) para remover todos os Efrina-A a partir da superfície da célula. Em ambas as linhas de células, remoção de endógenas Efrina-A a partir da superfície da célula resultou na activação do EphA2 reforçada por efrina-A1 Fc

trans

em comparação com células não tratadas (Figura 6 A, B). Em contraste, o tratamento com PI-PLC de células tratadas com Fc de controlo diminuiu a partir do EphA2 activação basal, sugerindo que endógena efrina-A pode induzir alguma activação do EphA2. Desde efrina-A1 foi relatado para ser clivada a partir da superfície de células cancerosas por metaloproteases de matriz, que também tratada células SKBR3 com o largo espectro inibidor de metaloprotease de matriz GM-6001 [4,6,31]. O tratamento com o inibidor para 24 horas aumentou ainda mais da superfície celular associado efrina-A1. No entanto, não afetou significativamente a fosforilação da tirosina EphA2 induzida por ephrin-A1 Fc obrigatório em

trans

, possivelmente devido a já elevada

cis

inibição pelos altos níveis de ephrin-A1 presente mesmo em a ausência de GM-6001. Assim, em câncer de células

cis

interação com ligantes endógenos ephrin-A pode atenuar a ativação EphA2 por Efrina-conforme apresentado na

trans

, apoiando a importância da

cis

interações em patogénese do cancro.

(a) e SKBR3 (B) células de cancro da mama MCF7 foram tratadas com PI-PLC, durante 4 horas e depois estimuladas com efrina-A1 Fc. EphA2 imunoprecipitados foram sondadas por imunotransferência para fosfotirosina (pTyr) e sondado para o EphA2. Lisados ​​sondadas com anticorpo-A1 anti-ephrin verificar remoção de ephrin-Como por PI-PLC; β-tubulina verifica carga igual das faixas. O sistema Odyssey LI-COR foi usado para detecção e as imagens coloridas foram convertidos em escala de cinzentos com Photoshop. Os histogramas mostram os dados normalizados a partir de 3 experiências diferentes * P 0,05 e *** p 0,001 por teste t de uma amostra de comparação de células efrina-A1 Fc-estimuladas tratadas ou não com PI-PLC. células (C) SKBR3 foram tratadas com PI-PLC, como em A ou com o largo espectro inibidor de metaloprotease de matriz GM-6001 durante 24 horas. Imunoprecipitados e lisados ​​foram sondados como indicado.

Discussão

Diferentes famílias de receptores e ligantes associadas à superfície de células que, juntos, mediam sinais juxtacrine interagindo no

trans em toda junções célula-célula pode também, quando co-expresso na mesma superfície da célula, interagir lateralmente em

cis

[32]. Estes

cis

interações, as quais têm sido quase sempre estudadas no sistema nervoso e do sistema imunitário, geralmente atenuam os sinais desencadeados pelas

trans

interações por meio de mecanismos que em muitos casos não são bem compreendidos [ ,,,0],32-34]. Estudos recentes descobriram papéis funcionais importantes para inibitórios

cis

interações entre receptores Eph e ligantes ephrin co-expressas nos neurônios [17-21].