Abstract

infecção por HPV persistente desempenha um papel importante no cancro cervical. Este estudo foi realizado para identificar os tipos de HPV em uma coorte de mulheres indianas com câncer de colo uterino localmente avançado, bem como para determinar o estado físico e /ou local de integração viral no genoma do hospedeiro. biópsias pré-tratamento (n = 270) de pacientes foram rastreados para a infecção por HPV por um ensaio de genotipagem de HPV de alto rendimento com base em tecnologia xMAP Luminex, bem como MY09 /11 PCR e spf1 /2 de PCR. positividade geral HPV foi observado ser de 95%, com HPV16 sendo o mais comum (63%), seguido de infecção com HPV18. estado de integração do vírus foi identificado usando a amplificação de Papilomavírus Oncogene Transcrições de ensaio (APOT) num subconjunto de amostras positivas para HPV 16 e /ou HPV 18 (n = 86) e com um seguimento adequado. Os dados foram correlacionados com a evolução clínica dos pacientes. A integração do genoma virai foi observada em 79% dos casos e uma preferência para a integração cromossómica do locus 1p, 3q, 6q, 11q, 13q 20q e foi vista. Os dados clínicos revelaram que o estado físico do vírus (integrado ou epissomal) poderia ser um marcador de prognóstico importante para o câncer cervical

Citation:. Das P, Thomas A, Mahantshetty U, Shrivastava SK, Deodhar K, Mulherkar R (2012) HPV Genotipagem e site da Integração Viral em cânceres cervicais em mulheres indianas. PLoS ONE 7 (7): e41012. doi: 10.1371 /journal.pone.0041012

editor: Torbjörn Ramqvist, Karolinska Institutet, na Suécia

Recebido: 17 de fevereiro de 2012; Aceito: 15 de junho de 2012; Publicação: 16 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Das et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores desejam exprimir a sua gratidão pelo apoio financeiro do cancro das mulheres da Iniciativa IRG # 634. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer cervical é o terceiro câncer mais comum entre as mulheres em todo o mundo e que o câncer mais comum encontrada em mulheres indianas. infecção por HPV tem mostrado desempenhar um crítico, embora não suficiente, papel na etiologia dos cancros cervicais. Até à data mais de 200 tipos de HPV foram reportados, dos quais HPV16 é o mais comum, seguido geralmente por HPV18, HPV45, HPV31 e HPV33 [1], [2]. A maioria do HPV de alto risco (HPV-RH) infecções (90%) regridem espontaneamente e apenas em casos cerca de 10% a infecção persiste e progride para neoplasia intra-epitelial cervical de alto grau. Isto geralmente ocorre através da integração do genoma HPV no cromossoma do hospedeiro com a perda associada ou perturbação de E2 [3]. De acordo com relatórios disponíveis, gene E2 virai tem a capacidade para reprimir oncogenes virais E6 e E7, em células contendo DNA de HPV integrado [4]. Portanto integração do vírus com a perda de controlo da transcrição por E2 resulta em sobre-expressão de E6 e E7 levando a imortalização e transformação das células [5]. Na maior parte dos casos, a integração do genoma de HPV-RH dá origem a transcrições de fusão compreendendo de oncogenes virais E6, E7 e sequências celulares adjacentes [6], [7], [8], [9]. Em estudos in vitro demonstraram que os transcritos de fusão virai-celulares são mais estáveis ​​e transmitir as células com uma vantagem de crescimento selectivo, em comparação com os homólogos epissomais [10], [11].

Os estudos relatam que o evento de integração é aleatório envolvendo quase todos os cromossomas e, consequentemente, vários locais de integração vírus-hospedeiro foram mapeados até à data [12]. No entanto, há determinados pontos de acesso, por exemplo, sítios frágeis, pontos de ruptura de translocação e regiões transcricionalmente activos [3], [13], [14], [15], que são os preferidos pelo vírus para a sua integração no genoma humano. Na integração dentro ou perto de um gene, o vírus pode provocar uma mudança na sua expressão, que pode eventualmente levar a alterações no crescimento e proliferação celular. Além disso, a integração virai pode processar ambos os genes codificantes virais, bem como os genes celulares sensíveis a alterações epigenética que poderia regulam a sua expressão. Assim, a integração do HPV no genoma humano é considerado um evento importante na carcinogénese do colo do útero.

O objectivo deste estudo foi a genotipagem de HPV e de identificação do local de integração de dois tipos de HPV-RH (16 e 18) , juntamente com a avaliação do valor prognóstico do local de integração, em cancros do colo do útero localmente avançados em mulheres indianas.

Materiais e Métodos

amostras clínicas

pré-tratamento biópsias de tumores do colo do útero, predominantemente de estágio IIIB FIGO, foram obtidas de pacientes (idade média, 50 anos; faixa etária, 33-80 anos) submetidos à radioterapia isolada ou quimio-radioterapia concomitante no Departamento de Oncologia radiação, Tata Memorial Hospital, Mumbai, depois de obter a aprovação IRB. A autorização genérica para a pesquisa básica foi obtida antes da obtenção das biópsias. No entanto, para o presente estudo uma renúncia foi obtido consentimento do Comitê de Ética do Hospital. As biópsias foram obtidas a partir de tumor do colo do útero histologicamente provado, preliminar, antes do início da terapia de radiação e radicais foram codificados para desidentidade pelo médico antes de serem testadas. As amostras foram recolhidas em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Todas as amostras foram atribuído um código de laboratório para manter a confidencialidade.

Processamento de amostras de tumores

tecidos congelados foram cryocut para a extração de DNA e RNA. Para a extracção do ADN, cinco secções de 30 um foram recolhidos em tampão STE (NaCl 0,1 M, Tris 0,05 M pH 7,5, EDTA 1 mM, SDS a 1%) contendo 10 mg /ml de Proteinase K (USB, Cleveland, OH, EUA). O DNA foi isolado pelo método de fenol-clorofórmio padrão. Para o isolamento de ARN total, foi utilizado RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). Dez secções de 30 um foram recolhidos em tampão contendo tiocianato de guanidina RLT fornecido no kit e processadas seguindo as instruções do fabricante. tratamento com DNase das amostras de ARN foi realizada utilizando o kit de ADN livre (Ambion, Austin, TX, EUA).

genotipagem de HPV por matriz Luminex alto rendimento

A genotipagem de 24 tipos de HPV que incluiu 15 tipos de alto risco (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,52, 56, 58, 59, 68, 73 e 82), 3 tipos putativos de alto risco (26, 53 e 66 ) e 6 tipos de baixo risco (6, 11, 42, 43, 44 e 70) [1], [2] foi realizada usando um array HPV multiplex genotipagem (Multimetrix GmbH, Heidelberg, Alemanha) baseado em Luminex tecnologia xMAP . De acordo com as instruções do fabricante, a PCR foi realizada utilizando conjuntos de iniciadores de largo espectro biotiniladas num volume total de 50 uL contendo MgCl 3,5 mM

2, 200 ^ M de dNTPs, 0,75 unidades de polimerase de ADN de Taq mistura de iniciadores e 1 ul. As etapas de amplificação incluíram uma desnaturação inicial de ADN a 94 ° C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de desnaturação durante 20 s a 94 ° C, emparelhamento durante 30 segundos a 38 ° C e extensão durante 1 min 20 s a 71 ° C , antes de uma extensão final durante 4 min a 71 ° C. as amostras positivas por PCR foram então sujeitos ao Luminex prazo. Dez microlitros do produto da PCR foi misturado com a mistura de grânulo Luminex contendo populações distintas grânulo acoplados a 24 tipos de HPV. Após desnaturação térmica, as sequências-alvo foram hibridados com sondas ligadas a grânulo. Os produtos de PCR hibridados foram marcados através da ligação ao R-ficoeritrina conjugada com estreptavidina. O read-out foi obtido na Bioanalyzer Luminex (Luminex Corporation, Austin, TX, EUA). Os tipos de HPV foram discernidos de acordo com a assinatura do grânulo único, enquanto que a presença de produtos de PCR foi determinada por fluorescência ficoeritrina. Uma sensibilidade analítica de corte foi calculado com base no controlo negativo que foi retido de cada um dos-out ler.

genotipagem do HPV por PCR usando MY09 /11 e spf1 /2 primers

Desde a quantidade de ADN disponível para o estudo estava a limitar, a PCR β-actina foi feita apenas nas amostras que não conseguiram mostrar amplificação por GP5

+ /6

+ iniciadores (n = 92). Estes foram adicionalmente rastreadas para HPV por PCR utilizando iniciadores MY09 /11 L1 (Tabela S1) e spf1 /2 iniciadores [16]. A PCR foi realizada num volume de reacção de 25 uL contendo, MgCl 1,5 mM

2, 10 pM de cada iniciador, 200 uM de dNTP e 0,75 unidades de polimerase de ADN Taq. As amostras que apresentaram resultados positivos para o HPV seja por MY09 /11 ou spf1 /2 ou ambos foram ainda genotipados para os dois mais comuns HPV16 tipos-HR-HPV e 18 usando /18 primers específicos HPV16 (Tabela S1). Como a quantidade de DNA foi limitante, SPF 1/2 PCR não pôde ser realizada em 4 das 92 amostras.

Associação de HPV16, HPV18 e HPV16 /infecção 18 com clínica resultado

os dados de genotipagem para os dois tipos HR-HPV, HPV16, HPV18 e HPV16 /18 em conjunto, onde havia dados disponíveis adequadas de acompanhamento foi comparado com o resultado clínico dos pacientes. A análise de Kaplan-Meier (SPSS 15.0) foi realizado para determinar a associação entre a infecção com estes tipos HPV-RH e recorrência da doença. sobrevida livre de doença foi considerada desde o início da terapia de radiação para o momento em que a recorrência ocorreu ou até último follow-up. A significância estatística foi avaliada pelo teste de log-rank (SPSS 15.0).

Identificação do local de integração por APOT ensaio

As amostras (n = 86) positivo para HPV16, HPV18 ou ambos, e com um acompanhamento adequado clínica (1ano mínimo ou até ocorrência de primeiro evento, o que era anteriormente) foram tomadas para estudar a integração viral usando a amplificação de Papilomavírus Oncogene Transcrições (APOT) de ensaio, como descrito por Klaes

et al

[6 ]. Resumidamente, o ARN total (0,5-1 ug) foi transcrito inversamente utilizando oligo (dT) 17-iniciador acoplado a uma sequência ligante [(dT) 17-p3] [17] e 50 unidades de transcriptase inversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) durante 1 h a 42 ° C. PCR com iniciadores de p-actina foi levada a cabo para verificar a integridade do ADNc. O ADNc da primeira cadeia foi amplificada utilizando iniciadores específicos de HPV-E7 (P1-16 específico para HPV16 e p1-18 específico para HPV18) como iniciadores directos e P3 ligante como o iniciador inverso (Tabela S1). A amplificação por PCR foi realizada num volume de reacção de 50 uL contendo MgCl 2,5 mM

2, 200 ^ M de dNTPs, 25 uM de cada iniciador e 1 unidade de polimerase de ADN de Taq. A reacção constituído por um passo de desnaturação inicial a 94 ° C durante 2 min, seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94 ° C durante 30 s, emparelhamento a 58 ° C durante 30 s e extensão a 72 ° C durante 4 min. Isto foi seguido por uma extensão final a 72 ° C durante 20 min. Em seguida, 7 ul do produto de PCR foi utilizado como molde para PCR com iniciadores internos para a frente utilizando iniciadores específicos para p2-16 HPV16 ou HPV18 para p2-18 específica e (dT) 17-p3 como iniciador inverso (Tabela S1). As condições de PCR foram as mesmas que a do primeiro PCR, excepto que a temperatura de emparelhamento foi de 66 ° C.

Clonagem de transcritos de fusão

amplicons outro do que os principais transcritos de epissomais (~1050 pb para HPV16 e ~1000 pb para HPV18) foram suspeito de ser derivados a partir dos genomas de HPV integradas. Estes foram excisadas a partir do gel e o DNA isolado utilizando GFX PCR do ADN do gel e da faixa Purification Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). O DNA foi isolado, quer sequenciados directamente ou após clonagem no vector pTZ57R /T usando o kit de clonagem de PCR Insta (Fermentas, Litu�ia, UE), no sequenciador de ADN (3100 Avant Genetic Analyzer, Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os loci de integração cromossômicas foram determinadas usando Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (BLAST) e da Universidade da Califórnia, hg19 Santa Cruz (UCSC) (fevereiro 2009) (CLAT) assembleias genoma humano. Além disso, os locais de integração foram verificados quanto à presença de sítios frágeis e quaisquer genes de identidade conhecida usando NCBI visualizador de mapa do site frágil e a ferramenta UCSC Blat, respectivamente.

Associação de integração viral com resultado clínico

os dados obtidos foram comparados com a evolução clínica dos pacientes. A análise de Kaplan-Meier (SPSS 15.0) foi feito para determinar a associação do estado viral (episs�ica /integrado) com a recorrência da doença. sobrevida livre de doença foi considerada desde o início da terapia de radiação para o momento em que ocorreu recorrência ou até último follow-up (acompanhamento médio de 86 casos foi de 44 meses). A significância estatística foi avaliada pelo teste de log-rank (SPSS 15.0).

Resultados

genotipagem do HPV através da matriz Luminex alto rendimento

Embora existam alguns relatórios sobre diferentes alta HPVs de risco em mulheres indianas, aqui nós relatamos 15 HPVs de alto risco, risco intermediário 3 e 6 tipos de HPV de baixo risco, usando a matriz Luminex alto rendimento. Os primers fornecidos no kit matriz Luminex para genotipagem do HPV foram biotinilados, ampla gama GP5

+ /GP6

+ primers. Utilizando este conjunto de iniciadores para PCR, obteve-se 178 a 270 de amostras positivas para HPV (Figura 1). As amostras positivas para HPV foram ainda submetido a hibridação com as sondas ligadas à matriz do grânulo por Luminex como descrito anteriormente. Cento e sessenta e nove amostras foram encontrados para hibridar com as diferentes sondas de HPV Considerando 9 amostras foram negativas. Estas amostras 9 pode ter a infecção pelo HPV não incluídos nas 24 tipos detectados pelo kit. Fora de amostras positivas para HPV 169, 168 amostras foram positivas para um ou mais tipos de HPV-RH indicando uma elevada associação de cancro cervical com a infecção pelo HPV-RH. Entre estes, HPV16 e /ou infecção HPV18 foram mais comuns – 114 amostras sendo positivo para HPV16 sozinho, 6 amostras para sozinho HPV18 e 16 amostras, tanto para HPV16 e HPV18 (Figura 2)

A genotipagem foi realizada por diante. 270 estágio cervical exemplos avançados de câncer de high-throughput, GP5

+ /6

+ primers matriz Luminex base; de consenso MY09 /11 e spf1 /2 primers. positividade de HPV foi de 95% (257/270). ensaio APOT foi feito em 86 HPV16

+ e /ou HPV18

+ amostras, com um bom acompanhamento clínico e RNA de boa qualidade. Em 18 amostras, apenas forma epissomal de HPV foi identificado, descansar 68 insinuado para possível integração. Local de integração poderia ser previsto com alta pontuação BLAST e /ou BLAT em 48 amostras.

O gráfico mostra a frequência de 24 tipos de HPV em 178 amostras de biópsia de câncer do colo do útero que se considerou ser positivo GP5

+ /6

+ primers. infecção HPV16 predominaram nas amostras. Cada barra representa diferentes tipos de HPV.

genotipagem do HPV por PCR usando MY09 /11 e spf1 /2 primers

A fim de estimar o verdadeiro positividade HPV nos 270 casos, o 92 biópsias de cancro cervical negativo para HPV por Luminex matriz, foram em primeiro lugar sujeito a PCR utilizando iniciadores de p-actina para verificar a qualidade do ADN. Todos foram consideradas positivas para β-actina. Em seguida, eles foram sujeitas a PCR usando MY09 /11 e spf1 /2 iniciadores. Vinte e cinco de 92 amostras foram consideradas positivas para o HPV por MY09 /11 PCR. Uma vez que a quantidade de ADN foi limitativo, SPF 1/2 PCR não poderia ser levada a cabo em quatro das 92 amostras. A triagem com spf1 /2 primers revelaram 79 amostras para ser HPV positivo. Estas 79 amostras também incluídas as 25 amostras que testaram positivo HPV por MY09 /11 PCR. A positividade do HPV foi calculado tendo em conta os resultados de matriz Luminex e spf1 /2 PCR. A positividade de HPV nesta coorte foi encontrada ser de 95% (257/270). Além disso genotipagem das 79 amostras, utilizando HPV 16/18 primers específicos, mostrou 49 amostras positivas para HPV16. Nenhuma destas 79 amostras foram positivos para HPV18. Portanto, a prevalência de HPV 16 e /ou HPV18 nesta coorte foi de 69% (185/270) (Figura 1).

Associação de HPV16, 18 e infecção dupla com o resultado clínico

Kaplan -Meier dados de análise de sobrevivência para 125 pacientes com type16 HPV, 18 e infecção dupla e com adequado seguimento clínico (mediana de acompanhamento de 125 casos foi de 54 meses), revelaram que não houve diferença significativa entre a infecção com estes dois HR- tipos de HPV em termos de evolução da doença (Figura S1).

estado físico de vírus e de evolução clínica

Fora de 125 HPV16, HPV18 amostras positivas ou duplo HPV, um sub-conjunto de 86 amostras com RNA de boa qualidade, foram tomadas para estudar o estado físico e /ou local de integração viral pelo ensaio APOT. Na maioria dos casos, o genoma viral foi encontrado para ser integrado (n = 68), enquanto que em 21% (n = 18), apenas transcritos epissomais podem ser identificados. Em 12 casos com genoma virai integrado, forma epissomal do HPV também foi detectada (Figura 1). O estado físico do vírus (episs�ica /integrado) foi associada com a evolução da doença. Os dados da sobrevivência revelou que 16 dos 18 pacientes com única forma epissomal de HPV (16 e /ou 18), tiveram sobrevida livre de doença em comparação com aqueles com forma integrada do vírus, indicando um bom resultado clínico (p = 0,067, representando um significância limítrofe) (Figura 3). O resultado clínico de todos os pacientes em que a integração virai foi estudado é mostrada na Tabela S2.

curva de sobrevivência de Kaplan-Meier para os pacientes com forma epissomal de vírus (n = 18) versus forma integrada (n = 68 ) é descrita. A maioria dos pacientes com a forma epissomal (16 em 18) tiveram uma sobrevida livre de doença em comparação com pacientes com forma integrada, indicando uma boa evolução clínica, embora com uma significância limítrofe (p = 0,067).

Identificação do local de integração viral

a fim de entender se o evento de integração é aleatória ou há alguma preferência por determinados sites dentro dos cromossomos, os dados de sequenciamento para 68 casos derivados de ensaio APOT foram investigados pela explosão e pelo /ou Blat. O site da integração poderia ser previsto com uma pontuação elevada em 48 casos (Tabela S3A), para os restantes 20 casos, a pontuação foi baixa (Tabela S3B). Apenas nos casos em que o local de integração foi prevista com alta pontuação (n = 48) foram analisados ​​mais para características diferentes associadas ao mesmo. Os locais de integração foram encontrados para ser distribuída por todo o genoma. No entanto, a integração foi mais frequente no 1p cromossómico loci (n = 7), 3q (n = 8), 13q (n = 4), 6Q (n = 4), 11q (n = 4) e 20Q (N = 4 ) (Figura 4). Apenas uma amostra apresentou a integração HPV em dois loci cromossómico simultaneamente. Alguns dos locais de integração recorrentes também foram verificadas ao nível genómico mediante a realização de PCR do ADN genómico, com iniciadores de HPV E7 como o iniciador para a frente e iniciadores específicos para uma região cromossómica dada como a um inversa (Figura S2).

sítio de integração, como determinado por ensaio de APOT em 48 casos positivos para HPV16, HPV18, ou ambos, com alta predição registos com BLAST /BLAT. evento de integração foi encontrado para ser mais comum em 1p e 3T cromossômica loci. Cada barra representa diferente locus cromossômico.

características associadas com a integração HPV

Usando NCBI sítio frágil Map Viewer foi observado que 60% das integrações (29/48) estavam localizadas em ou perto de um sítio frágil comuns ou raros. O resto dos locais de integração não foram associados com sites frágeis (Tabela 1). Usando a ferramenta UCSC Blat 58% das sequências (28/48) foram observados como sendo dentro ou genes codificadores de proteínas vizinhas. Estes genes pertenciam a diversas categorias que variam de oncogenes, fatores de transcrição e genes supressores de tumor (Tabela 1).

Discussão

Está provado além de qualquer dúvida que a infecção pelo HPV desempenha um importante papel na etiologia de cancro cervical. Relatórios de diferentes partes do sub-continente indicam uma prevalência de HPV variando de 73-99% [18] – [30]. No presente estudo, relatamos 95% de positividade HPV utilizando três conjuntos de iniciadores diferentes. É evidente a partir deste estudo que um único conjunto de iniciadores não é suficiente para estimar a verdadeira infecciosidade HPV. Dos vários genótipos de HPV de HPV16 foi mais comum (60%), seguido de infecção com HPV 18 sozinho (2%). Também se observou infecção dual com HPV16 /18 (6%) e HPV16 /45 (3%). Estes resultados estão em concordância com outros estudos do subcontinente indiano que relata 57-65% de positividade HPV16, seguido pelo HPV 18, 45 e 33 em neoplasia cervical [19], [20], [29].

integração do vírus é comum na fase tardia cancros cervicais e é considerado um evento importante na progressão da doença. Integração geralmente ocorre a jusante dos genes precoces E6 e E7, muitas vezes na região E1 ou E2. O gene E2 é transcricionalmente inativada uma vez que o vírus é integrada devido ao rompimento do seu quadro de leitura aberta. do gene E2 virai tem sido extensivamente estudada e é conhecida por desempenhar um papel na replicação do vírus, bem como regulação negativa dos genes E6 e E7 [31].

Várias técnicas têm sido usadas para estudar a integração do vírus, tais Ligadura como PCR mediada [32], local de restrição-PCR [15] e ensaio APOT [6]. A fim de limitar o nosso estudo de locais de integração com um genoma viral transcricionalmente activo, foi escolhido APOT ensaio. Além disso, o ensaio de APOT permite a detecção de genoma virai integrado nas lesões clínicas, mesmo na presença de um grande excesso de forma epissomal não integrada de genomas virais [6], [33]. A frequência de integração virai no genoma do hospedeiro em carcinomas do colo do útero tem sido relatada como sendo tão elevada como 100% em HPV18

+ tumores [34] ou superior a 80% em HPV16

+ tumores [35]. Em nosso estudo, encontramos quatro HPV18

+ amostras onde o vírus foi integrado e um HPV18

+ amostra onde o vírus foi epissomal. A incidência de integração em HPV16

+ amostras foi maior. O mecanismo de integração HR-HPV não é totalmente compreendido. Especula-se que a integração pode representar uma ocorrência fortuita, a probabilidade de que aumenta com a frequência das interrupções da cadeia dupla (DSB) no host e DNA viral. sítios frágeis cromossômicos poderiam representar os hotspots para a integração HR-HPV.

O estado físico e /ou local de integração foi estudada em 86 amostras de tumores cervicais infectados com uma ou ambas das duas HR-HPV, HPV16 e HPV18, e com uma adequada acompanhamento clínico. forma epissomal de HPV foi observado em 18 casos. Presença de apenas forma epissomal nestes pacientes com estágio avançado da doença (predominantemente FIGO estágio IIIB), pode indicar que tanto a integração HPV não é o único responsável pela progressão da doença; ou pode ser uma limitação da técnica, resultando em falha de amplificação da transcrição derivado integrante. Estudos recentes confirmaram a presença apenas de forma epissomal do vírus em carcinomas escamosos cervicais avançada células [33], [36]. Além disso, uma vez que APOT funciona na base de recozimento do iniciador Frohman com a cauda poliA, casos em que a cauda poliA é localizado a uma grande distância a partir do iniciador em sentido directo, podem não ser passíveis de amplificação por PCR.

no presente estudo, observou-se 12 amostras em que ambas as formas episs�icas integrados, bem como do vírus estavam presentes. Em tais casos, E2 pode estar disponível em

trans para modular os níveis de oncogénica E6 e E7 [37] expressão. Ainda de acordo com o relatório do Pett

et al

., Perda de epissomas é tão importante quanto a integração do vírus no genoma do hospedeiro para a progressão das lesões para neoplasia cervical [38]. Seria interessante ver a expressão de E2 e E6 /E7 nos casos em que HR-HPV está presente em episs�ica bem como a forma integrada ou em amostras onde HPV só é epissomal.

Há relatos de que HR- com excepção de E6 /E7 de HPV proteínas induzem instabilidade e transformação [39] cromossómico. Relata-se que E2 estabiliza Skp2, um oncogene e isso pode levar à activação da entrada da fase S [39]. Hamid et. al., [40] também sugeriram um papel para E2 na proliferação celular. Uma vez que as células em fase S são mais sensíveis à radiação, cancros com epissomal E2 poderia ser mais sensíveis ao tratamento por radiação. Comparação do estado físico do vírus (epissomal /integrada) com o resultado clínico após a radioterapia radical revelou que os pacientes com forma epissomal do vírus aumentaram a sobrevivência livre de doença em comparação com aqueles com forma integrada. Esta observação é suportada por vários relatórios que indicam que o evento de integração está associada com uma diminuição da sobrevivência livre de doença [41], [42]. No entanto, não são contrastantes relatórios, bem como, segundo a qual o estado físico do vírus não se correlaciona com sobrevida livre de doença [43], [44]. Isso precisa ser mais estudada.

Embora os sites de integração foram distribuídos por todo o genoma em diferentes amostras, houve uma preferência por certos loci cromossómico como 1p, 3T, 6q, 11q, 13q, 6q e 20q. Certas regiões específicas em alguns desses loci como 1p36.23, 1p36.33, 3q26, 3q28 e 20q11.21 mostrou integrações repetidas, indicando que a integração pode não ser um evento aleatório. Relatórios de estudos envolvendo populações ocidentais indicam que a integração do vírus ocorre mais frequentemente no lugar 8q cromossômica [3], [45], [46]. Integração no locus 8q em nosso estudo foi observado em apenas 1 em cada 48 casos. Isto pode ser devido à diferença na etnia das duas populações.

3T, 13q e 20q loci além de ser alvo preferencial para a integração HPV tem sido relatada a ser locais para a instabilidade genômica associada com o câncer cervical. Ganho de 3q e 20q, enquanto que a perda de 13q tem sido relatada em diferentes estágios da doença [47] – [49]. Também os relatórios mais recentes mostram que existe uma associação significativa entre o rearranjo genómico e integração HPV [46]. Seria, portanto, interessante estudar se a integração preferencial do vírus para estes loci tem um papel a desempenhar na indução de instabilidade do genoma.

A maioria das integrações (28/48) foram encontrados para ser localizado no interior ou nas proximidades certos genes. Isto poderia indicar que o vírus prefere regiões transcricionalmente activos para o evento de integração. Tais genes incluídos oncogenes, tais como myc, fatores de transcrição como TP63, MECOM, etc. Esta observação é apoiada pelo relatório anterior por Wentzensen

et al

onde eles têm demonstrado o envolvimento de genes relacionados tumorais (myc e TP63) em HPV processo de integração [50]. Estudos no nosso laboratório mostraram que alguns dos genes no interior do qual foi observada a integração, tais como ABCB10, SLC25A36, IL8, COX4I2, HNF1B, myc, demonstram um aumento da expressão (dados não publicados), indicando assim que na integração dentro ou perto de um gene particular o vírus pode provocar mudanças na expressão gênica

Integração do vírus perto ou dentro de sites frágeis tem sido frequentemente relatados [15], [45], [50] – [52].. Os sítios frágeis são regiões específicas nos cromossomos que nonrandomly sofre quebrar em resposta a certos stress. Isso faz com que genes em ou próximo a estes locais suscetíveis a integração de DNA estranho. Em nosso estudo 29/48 integrações foram localizados dentro ou perto de um sítio frágil comuns ou raros, que está em concordância com os relatórios anteriores. Outra observação do nosso estudo foi que os pacientes com a integração viral na cromossômica loci 3T, 13q e 20q mostrou o pior prognóstico entre todos. Se isso pode ter qualquer implicação clínica no prognóstico do câncer do colo do útero seria interessante e desafiador para estudo.

Informações de Apoio

Figura S1.

análise de Kaplan-Meier para dois tipos de HPV-RH – HPV16 e /ou HPV 18 e a evolução da doença. análise de sobrevivência de Kaplan-Meier para HPV16 e /ou HPV18 em 125 pacientes que tiveram um bom acompanhamento clínico foi realizado. Pacientes com infecção por HPV16 sozinha mostrou tendência de melhor sobrevida livre de doença em comparação com infecção HPV18 sozinho e infecção dupla com HPV16 /18

doi:. 10.1371 /journal.pone.0041012.s001

(TIF)

Figura S2.

Genomic DNA PCR dos locais de integração recorrentes. imagens de gel representativos (a, b) integração HPV mostrando no nível genômico. integrações recorrentes em loci 1p36.23, 3q28, 6q23.3, 8p11.21 e 11q13.1 cromossômica é retratado

doi:. 10.1371 /journal.pone.0041012.s002

(TIF)

Tabela S1 . sequências

primer.

doi: 10.1371 /journal.pone.0041012.s003

(DOCX)

Tabela S2.

dados clínicopatológicos para todos os casos em que a integração viral foi estudada.

doi: 10.1371 /journal.pone.0041012.s004

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Tabela S3.

Seqüência de locais de integração HPV no genoma em 68 casos. a) Locais de Integração para 48 casos com uma alta pontuação de previsão. b) Locais de Integração para 20 casos com uma pontuação baixa previsão

doi: 10.1371. /journal.pone.0041012.s005

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Agradecimentos

Os autores desejam reconhecer falecido Dr. KA Dinshaw e todos os indivíduos do Grupo Ginecologia Disease Management, Tata Memorial Hospital, que estavam envolvidos em criteriosamente a elaboração da história clínica e coleta e armazenamento de biópsias de pacientes com câncer cervical. Ajuda de Ms. Sadhana Kannan (ACTREC) na análise estatística e Ms. Tabish Hussain (ACTREC) por suas valiosas contribuições na preparação do manuscrito estão reconhecido agradecimento.