Abstract
Purpose
Esta ocorrência avaliada estudo e potencial significado clínico intratumoral
EGFR
heterogeneidade mutacional em pacientes chineses com cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC).
Materiais e Métodos
Oitenta e cinco pacientes em estágio III-IV NSCLC que haviam sido submetidos ressecção cirúrgica paliativa foram incluídos neste estudo. Destes, 45 doentes realizada
EGFR
mutações (grupo M) e 40 doentes eram do tipo selvagem (grupo-W). Cada amostra de tumor foi microdissectados para produzir 28-34 focos tumorais e intratumoral
EGFR
mutação foram determinados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência A desnaturação (DHPLC) e amplificação refratária de mutação (ARMS).
EGFR
copiar números foram medidos usando hibridização fluorescente in situ (FISH).
Resultados
Microdissecção rendeu 1.431 focos tumorais de
EGFR
pacientes mutantes (grupo -M) e 1.238 focos de pacientes do tipo selvagem (grupo-W). O
EGFR
frequências de mutação no grupo-M foram de 80,6% (1.154 /1.431) e 87,1% (1.247 /1.431) usando DHPLC e braços, respectivamente. Uma combinação de
EGFR
células -mutated e do tipo selvagem foi detectado em 32,9% (28/85) das amostras por DHPLC e 28,2% (24/85) pelas armas, apoiando a ocorrência de heterogeneidade intratumoral. Trinta e um pacientes (36,5%) foram identificadas como
EGFR
FISH-positiva. Os pacientes portadores heterogeneidade mutacional intratumoral possuía menor
EGFR
copiar números do que os tumores continham células mutantes sozinho (16,7% vs. 71,0%,
P Art 0,05). Entre 26 pacientes que tinham recebido EGFR-TKI, a média
EGFR
conteúdo mutação foi maior nos pacientes que apresentam resposta parcial (86,1%) ou doença estável (48,7%) em comparação com pacientes que apresentam doença progressiva (6,0%) (
P
= 0,001). Há também mostrou relação entre sobrevida livre de progressão (PFS) e conteúdos diferentes de grupos de mutação EGFR (wild pura tipo EGFR, mutação EGFR com a heterogeneidade e puro mutado EGFR) (
P
= 0,001).
Conclusão
Aproximadamente 30% dos pacientes apresentaram intratumoral
EGFR
mutacional heterogeneidade, acompanhando com relativamente baixo número de cópias EGFR.
EGFR
conteúdo mutante foi correlacionada com a resposta e prognóstico de EGFR-TKI
Citation:. Bai H, Wang Z, Wang Y, Zhuo M, Zhou Q, Duan J, et al. (2013) Detecção e relevância clínica da intratumoral
EGFR
mutacional Heterogeneidade em pacientes chineses com avançada Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 8 (2): e54170. doi: 10.1371 /journal.pone.0054170
editor: William CS. Cho, a rainha Elizabeth Hospital, Hong Kong
Recebido: 21 Agosto, 2012; Aceito: 07 de dezembro de 2012; Publicação: 13 de fevereiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Bai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos jovens estudiosos Nacional de Ciências naturais da Fundação distinto [81025012]; e do Programa de Ciências Naturais da Fundação Nacional Geral [81172235]; eo Beijing Sistemas de Saúde Líder Academic [2011/02/22]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
inibidores do factor de crescimento epitelial do receptor de tirosina-quinase (EGFR-TKI), tais como gefitinib e erlotinib tinha sido amplamente aplicada para o tratamento do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Vários relatórios têm sugerido que pacientes tratados com EGFR-TKI exposição melhoria do tratamento de eficácia e de sobrevivência momentos em que eles carregam mutações ativadoras no
EGFR
[1] – [6]. No entanto, Na et al relatou que os doentes com adenocarcinoma do sexo feminino com mutação sensível EGFR apresentaram recidiva mais pós-operatória e menor sobrevida do que aqueles com wild-type EGFR [7]. Também existem
EGFR
pacientes com NSCLC -mutated que apresentam respostas pobres para EGFR-TKI ou que recidiva após um período de controle da doença, sugerindo que existem factores adicionais que medeiam a resposta ao EGFR-TKI. mutação secundária (T790M) no exão 20 do
EGFR
, bem como outras aberrações genéticas de circulação a jusante e vias relacionadas com EGFR, tais como,
C-MET
amplificação [8] – [10] ,
IGF-1R
mutação [11] tinham sido identificados em relação ao TKI resistência aos medicamentos. No entanto, cerca de 30% dos mecanismos de resistência dos pacientes permanecem obscuros. Recentemente, a heterogeneidade intratumoral de
EGFR
mutações tem atraído a atenção como uma fonte potencial de falha do tratamento e resistência à droga para EGFR-TKI [12], [13].
Tumorigênese de câncer de pulmão é um processo de vários estágios pelos quais as células cancerosas monoclonais tornar-se progressivamente heterogénea, devido à evolução clonal e instabilidade genética /epigenética. Embora todas as células malignas se pensa ser derivada de uma célula precursora comum, adquiriu instabilidade genética dá origem a gerações subsequentes que expressam características únicas, tais como oncogenes activados e genes supressores de tumor [14]. No entanto, estudos recentes envolvendo heterogeneidade genética intratumoral geraram contradizendo resultados. Gerlinger et al (2012) [15] relataram heterogeneidade intratumoral acentuada em relação a mutações somáticas em genes condutor e do passageiro, o que pode promover a adaptação do tumor e falha terapêutica através da seleção darwiniana. Snuderl et al (2011) [16] relataram a convivência estável de clones heterogêneos que possuem amplificação receptor tirosina quinase diferente (
EGFR, MET
, e
PDGFRA
) dentro do mesmo tumor. Como um gene controlador,
EGFR
foi sugerida para ser associado com resistência a EGFR-TKI quando as mutações neste gene exibiu heterogeneidade intratumoral. Nosso estudo recente (2012) [17] indicou igualmente que
EGFR
mutação mudança decorrente chemotherpy pode estar relacionada à heterogeneidade dos intratumoral
EGFR
mutação e diferentes níveis Chemosensitivity de mutante e wild- digite células, em contraste, Yatabe et al (2011) [18] relatou que
EGFR
heterogeneidade ocorreu muito raramente no adenocarcinoma de pulmão. Estes autores especularam que a heterogeneidade observada em estudos anteriores era um artefato resultante a partir de um desequilíbrio específico do alelo mutante e distribuição heterogênea
EGFR
amplificação ou a partir de uma diferença de
EGFR
sensibilidade de detecção de mutação nos diversos métodos.
com base nos resultados díspares dos estudos anteriormente seriais no heterogeneidade intratumoral, tentamos analisar
EGFR
estado de mutação por análise microdissection multi-focal, utilizando métodos diferentes (DHPLC vs ARMS), explorar a associação da heterogeneidade intratumoral com
EGFR
número e imfluence de
copiar EGFR
conteúdos mutação sobre a resposta da terapia de EGFR-TKI para os pacientes com localmente ou NSCLC avançado.
Materiais e Métodos
pacientes e espécimes
Todas as amostras utilizadas neste estudo foram obtidos a partir de um banco de tecidos do Departamento de Thoracic Oncologia médica, Peking University Hospital do Câncer, que foi criada em Junho de 1999 e já possuía cerca de 1900 pacientes com amostras de tecidos que tinha sido genotipados para
EGFR
estado de mutação utilizando métodos de rotina (DHPLC). Foram selecionados pacientes de banco de tecidos de acordo com os seguintes critérios: 1) histologicamente confirmados fase III-IV NSCLC (relatório de patologia); 2) receberam ressecção operacional paliativos; 3) poderia fornecer amostras de tecido primário suficiente para microdissection e análise molecular. Os critérios exclusivos incluídos: 1) tinha tecidos, mas foi amostras do sítio metastáticas; 2) o teor de células de tumor era demasiado baixo para análise. As ressecções operacionais paliativas foram definidos como a operação realizada nos pacientes com NSCLC avançado que tinham pequenos nódulos intra-pulmonares, metástase solitária em um único órgão ou doença metastática não identificado pré-operatório.
Finalmente, 85 pacientes preencheram os acima critérios e foram incluídos neste estudo, que continha 45 amostras digitadas como
EGFR
mutante (grupo-M) e 40
EGFR
amostra do tipo selvagem (grupo-W). Todos os pacientes fornecidos consentimento informado por escrito para análise de biomarcador. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional do Hospital Cancer Universidade de Pequim.
Microdissecção e DNA extração
Todas as amostras foram avaliadas para a
EGFR
mutação por DHPLC rotineira e foram classificadas em 40 de tipo selvagem e 45 amostras do tipo mutante. A partir de cada bloco de formalina-fixo Parafina-incorporado (FFPE), uma secção de 15 mm de espessura foi corado com hematoxilina e eosina (H E).
Para garantir que as amostras analisadas tiveram mais de 90% conteúdo de tumor , um protocolo é realizada rotineiramente no nosso grupo: em primeiro lugar, o limite de tumor na secção foi desenhada por dois patologistas independentes sob microscopia e excluídos os tecidos não malignos o mais rapidamente possível. Em segundo lugar, pequenos focos (cerca de 0,1 cm2 tamanho) na região do tumor foram microdissectados usando Laser Sistema Microdissecção (LMC, Leica Wetzler, Alemanha) e assegurar a cada focos conter mais de 90% de células tumorais
.
O DNA foi extraído a partir de alíquotas amostras microdissecadas de ADN utilizando o kit de FFPE extracção de acordo com as instruções do fabricante (ómega). As amostras de DNA foram examinadas quanto à pureza e concentração usando um kit Nano gota (Thermo Scientific) e foram diluídas até uma concentração de trabalho de 10 ng /ul.
análise de mutações de EGFR por DHPLC e braços
A
EGFR
status de mutação de amostras de ADN genómico derivados de microdissecações tumorais foram determinados através da aplicação de ambos DHPLC e os braços para cada amostra. DHPLC foi realizada como descrito anteriormente [19], e os braços foi conduzida usando um DxS
EGFR
Mutation Test Kit, de acordo com as recomendações do fabricante (Amoy Diagnostics Co., Ltd, China). PCR (qPCR) reações quantitativas foram realizadas utilizando um Real-Time QPCR Sistema Mx3000P (Stratagene, Agilent Technologies, EUA).
Semiquantitation de heterogeneidade mutação EGFR
Uma análise DHPLC semiquantitativo de
EGFR
abundância foi realizada através do cálculo da razão entre as alturas dos picos entre o mutante (H) e os produtos de tipo selvagem (W) (razão H /W). A análise DHPLC limitou-se a mutações no exão 19, porque M e picos W foram separados completamente, mas sobrepostos em detecção de mutações exon 21.
cópia EGFR detecção número
EGFR
copiar números foram determinados por hibridação in situ fluorescente (FISH) a partir de tecido massa usando sondas de DNA dual-cores (Beijing GP médica Tec., LTD, China). espécimes de tumor foram classificadas em seis categorias com base nos resultados de peixe de acordo com os critérios de Cappuzzo [20]. padrões citogenéticos foram classificados como FISH negativo se eles não apresentaram nenhuma ou baixa ganho genômica (
i
, ≤4 cópias de
EGFR
em . 40% das células). As amostras foram classificadas como FISH-positiva se eles exibiram um alto nível de polissomia (≥4 cópias de
EGFR
em ≥40% das células) ou se eles exibido amplificação do gene, definida como a presença de tight
EGFR
agrupamentos de genes e uma proporção de
EGFR
/cromossoma 7 centrómero de 2 ou mais por célula ou 15 ou mais cópias de
EGFR
por célula em pelo menos 10% das células analisadas .
Estatísticas
χ2 teste foram utilizados para analisar a associação de conteúdos mutação com número de cópias. O teste de McNemar foi aplicado para comparar disparidade de
EGFR
heterogeneidade mutação entre DHPLC e braços. teste de Wilcoxon foi aplicado para comparar a abundância mutante entre os diferentes grupos de mutação. testes não paramétricos foi utilizado para analisar o conteúdo mutação entre os diferentes grupos. Os valores de P 0,05 foram considerados significativos. A avaliação dos dados foi realizada com Todos os cálculos foram realizados usando SAS versão 10.0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC).
Resultados
Caracterização dos pacientes
Durante o período de outubro de 2005 a Dezembro de 2011, 85 pacientes foram incluídos neste estudo retrospectivo. critérios subtipos histológicos de cada amostra NSCLC foram avaliados com base na Organização Mundial da Saúde (OMS) [21]. Adenocarcinoma foi o subtipo mais comum histológico (63 pacientes, 74,1%). estadiamento do câncer foi realizada de acordo com o sistema UICC-AJCC-TNM (version 7, 2009) [22]. doença avançada (estágios III-B – IV) foi identificada em 61,2% dos doentes envolvidos. Os dados dos pacientes estão resumidas na Tabela 1. Quarenta e cinco doentes foram confirmados para ser
EGFR mutante
tipo (grupo M), incluindo 25 pacientes com deleções exão 19 (grupo-M /E19) e 20 pacientes com exão 21 mutações (grupo-M /E21).
A heterogeneidade da mutação EGFR detectadas por DHPLC e braços
Tumor microdissection rendeu 2.699 focos, incluindo 1.238 focos de tipo selvagem
EGFR
(grupo-W) e 1.431 casos grupo-M. A frequência de mutação total no grupo-M foi de 80,6% em DHPLC (1.154 /1.431) e 87,1% (1.247 /1.431) pelas armas. frequências de mutação variou amplamente em todo tumores individuais, variando entre 5% -100% em DHPLC e 1% -100% em ARMS. as amostras do Grupo-M foram subdivididos por meio de mutação do conteúdo do seguinte modo: 1) puro
EGFR
mutação (100%) ou nenhuma heterogeneidade mutacional foi detectada em 21 casos por DHPLC (12 Grupo-M /E19, 9-H grupo /E21) e em 31 casos por ARMS (20 grupo-M /E19, 11 grupo-M /E21); 2) Os conteúdos moderada mutante (≥50%) ou de nível moderado a heterogeneidade foi detectada em 16 casos por DHPLC (10 grupo-M /E19, 6 grupo-M /E21) e em 9 casos por ARMS (2 grupo-M /E19 , 7 grupo-M /E21); e 3) baixo teor mutante ou heterogeneidade de alto nível ( 50%) foram detectados em 8 casos por DHPLC (3 grupo-M /E19 e 5 grupo-M /E21) e em 5 casos por ARMS (3 grupo-M /E19 e 2 do grupo-M /E21).
Entre os 40 casos do grupo-W, 4 casos apresentaram frequências de mutação baixos que variam de 5,0% a 8,0%, quando focos tumorais microdissecadas foram analisados por DHPLC. Três destes casos carregava um
EGFR
mutação exão 19, e um caso realizado um
EGFR
exon 21 mutações. ARMS confirmou estes 4 casos e identificados 6 casos adicionais mostrando frequências de mutação muito baixas que variam de 1,0% a 5,0%. Ao combinar os casos grupo-M que transportam tanto wild- e do tipo mutante
EGFR
células e os casos do grupo-W contendo células mutantes em baixa frequência, 32,9% (28/85) e 28,2% (24/85 ) das amostras foram identificadas para levar intratumoral
EGFR
heterogeneidade mutacional por DHPLC e braços, respectivamente. Diferença de intratumoral
EGFR
heterogeneidade mutacional identificado por dois métodos não foi significância estatística (
P
= 0,031, teste de McNemar) (Figura 1).
A cor diferente de torta representam diferentes níveis de heterogeneidade mutação EGFR. Os restantes três partes (azul claro, roxo e verde) de cada gráfico de pizza representam percentual de casos com a heterogeneidade EGFR.
A análise semiquantitativa do exão 19 mutação por DHPLC
Também medimos semiquantitativa
EGFR
abundância mutante calculando a /relação de altura M W de pico a partir do gráfico DHPLC. Nós, a análise a eliminação do exão 19 porque o M correspondente e picos W não se sobrepõem em condições não desnaturadas (50 ° C) (Figura 2). O M médio /rácios W de exon 19 foram 2,43 (variação, 0,40-18,15) entre as amostras grupo-M e 0,12 (variação de 0,06-0,22) entre as amostras do grupo-W (
P
= 0,005). Sob condições parcialmente desnaturadas (62,2 ° C), o M e picos W correspondentes à substituição exão 21 sobrepostas, impossibilitando qualquer determinação de suas alturas relativas.
O gráfico da esquerda mostrou detecção de estado da mutação EGFR rotineiro por DHPLC e correspondentes tecido grosso. O gráfico da direita representam heterogeneidade mutação EGFR por microdissecção. Os dois painéis superiores representam EGFR mutante em tecidos em massa mostrou mutação pura e mutação com a heterogeneidade por microdissecção, respectivamente. A seguir dois painéis representam EGFR selvagem em tecidos em massa com pura EGFR de tipo selvagem ou misturado com baixa frequência de células de mutação por microdissecção.
número de cópias do EGFR
análise FISH foi realizado em 85 amostras de tumores de medir
EGFR
copiar números. Trinta e um pacientes (36,5%) foram consideradas positivas FISH. A associação de
EGFR
heterogeneidade mutacional como detectado por braços com
EGFR
número de cópias é descrito abaixo. Entre os 31 pacientes com 100%
EGFR
células -mutated (sem heterogeneidade), 71,0% (22/31) foram classificados como (amplificação alta polissomia ou gene) FISH-positiva. Por outro lado, a baixa
EGFR
grupo -mutated exibiu cerca de 13,3% FISH-positividade (2/15, incluindo 10 casos mutantes de baixa frequência no grupo-W e 5 casos mutantes de baixa frequência no grupo-M) , e a moderada
EGFR
grupo -mutated exibido aproximadamente 22,2% (09/02) positividade PEIXES (
P
0,05; Figura 3 e 4), que foram semelhantes aos detectados em 30 pacientes com o tipo selvagem
EGFR
de quem focos microdissecção foram analisados por meio de armas (5/30, 16,7%,
P
= 0,75).
Os vários
conteúdos EGFR
mutação são descritos na legenda.
Avaliação do gene EGFR número de cópias por FISH foi feito usando o
EGFR
(laranja) CEP 7 (verde) sonda /(Beijing GP médica Tec., LTD, China). Painéis ilustram amostras tumorais representam a amplificação do gene (A) e dissomia (B).
Heterogeneidade por tipo histológico e do estádio
Adenocarcinoma foi o padrão histológico mais comum identificados neste estudo (74,1 % dos indivíduos); isso era esperado em uma série predominantemente cirúrgico. A positividade do
EGFR
mutação no adenocarcinoma, como confirmado pela análise microdissection, foi de 91,8%. A relação H /W foi de 2,57 (intervalo, 0,13-18,15). Em comparação, o
frequência EGFR
mutação foi menor entre outros padrões histológicos (70,9%), e apenas 3 casos levou o
EGFR
19 mutação com M rácio /W 1,53. Com base no sistema de estadiamento do tumor UICC-AJCC-TNM, 50 tumores foram classificados como estádio IIIa e IIIb (localmente avançado) e 35 foram classificados como estágio IV (avançado). Não foram observadas diferenças significativas na taxa positiva mutação e abundâncias entre os estágios localmente avançados e avançados NSCLC (taxa, 87,7% vs. 86,3%,
P
= 0,875; M rácio /W, 2,12 vs 2,86,
P
= 0,662).
Impacto do EGFR heterogeneidade mutacional em resposta ao EGFR-TKI
Entre 85 casos, 26 pacientes receberam EGFR-TKI como de primeira linha ou multi- terapias de linha. 9 pacientes exibiu uma resposta parcial (PR), 7 tinham doença estável (SD), e 10 experiente doença progressiva (DP). De acordo com ARMS resultados, o teor de mutante média foi de 86,1% (247/287), no grupo PR, 48,7% (110/226) no grupo SD, e 6,0% (19/317) no grupo de PD, e com um diferença significativa (
P
= 0,001).
Dividimos 26 pacientes em três subgrupos de acordo com o estado heterogêneo mutação EGFR, que eram “pura tipo selvagem EGFR”, “mutação EGFR com a heterogeneidade” e “EGFR mutado pura”. O PFS foram de 3,01 meses (IC 95% 0,51-5,52), 11,35 meses (IC 95% 6,37-15,21) e 16.21 meses (IC 95% 8,21-25,19) para os três grupos, respectivamente (p = 0,001).
Discussão
intratumoral
EGFR
homogeneidade mutação tem sido assumida em cancros do pulmão. Como tal, a determinação de um paciente
EGFR
estado de mutação foram interpretados utilizando métodos qualitativos. No entanto, apenas uma fracção dos doentes portadores do
EGFR
mutações responder ao EGFR-TKI, sugerindo que fatores adicionais além mutação EGFR contribuir para a resposta à droga de um paciente. Além de vários marcadores biológicos relacionados (
por exemplo
., K-ras, T790M, C-Met), intratumoral
EGFR
heterogeneidade mutacional tem sido proposta como um mediador de candidato a resistência ao EGFR terapia de TKI, embora a existência de tal heterogeneidade foi contestado [15] – [17]. No presente estudo, observou-se heterogeneidade mutacional intratumoral significativa usando ambos os métodos DHPLC e braços.
Uma das controvérsias sobre a heterogeneidade intratumoral de
EGFR
mutação é se atribui a heterogeneidade de usar uma baixa sensível método de detecção, especialmente quando o sinal mutante é inferior ao limiar de detecção. Para excluir a possibilidade, utilizamos dois métodos de ensaio, DHPLC e braços, para avaliar a
EGFR
estado de mutação nos focos intratumoral microdissecção. ARMS é pensado como um ensaio de alta sensibilidade para
EGFR
detecção de mutações. Considerando que o método DHPLC não tem sido amplamente utilizada para
EGFR
análise da mutação, no entanto, é de alta sensibilidade e especificidade têm sido mostrados em nossos estudos e outros (limite de detecção de 3% -10%) [19], [23] – [26]. Os resultados mostraram a parte de espécimes da localmente avançado e avançado NSCLC apresentada a coexistência de
EGFR
mutantes e do tipo selvagem células independentemente da DHPLC ou braços sendo usados, sugerindo que o intratumoral
EGFR
heterogeneidade mutado, de fato existiu e não derivam do viés de métodos de detecção ou baixas frequências mutantes intratumorais.
a fim de melhor caracterizar a heterogeneidade intratumoral de
EGFR
, nós microdissectados tecido tumoral em massa para obter 28-34 focos por tumor e analisou cada foco de
EGFR
estado de mutação usando métodos qualitativos e semi-quantitativas. A maior parte dos focos microdissecção foram identificados como
EGFR
do tipo mutante com
EGFR conteúdo de mutação
variando de 1% a 100%. Estudos teóricos e experimentais têm relatado que as células cancerosas do mesmo genótipo localizar de forma contígua [27]. Análise de uma pequena amostra de tecido de tumor excisado provavelmente indicaria uma população geneticamente idêntica de células cancerosas. No entanto, nossa análise do
EGFR
status de mutação de numerosos focos intratumorais indicou heterogeneidade. Foram excluídos os sítios não-malignas por visualização microscópica, e a cada espécime microsampled foi cruzado para confirmar que a percentagem de tecido do tumor era pelo menos 90%, assegurando que as áreas não foram microdissecadas contaminada por células não-cancerosas. Assim, nossos dados confirmaram a existência de intratumoral
EGFR
heterogeneidade mutacional.
Yatabe et al. (2011) [17] relatou que as distribuições heterogéneas de
EGFR
mutações no adenocarcinoma de pulmão eram extremamente raros. Os autores sugeriram que a heterogeneidade do tumor relatado por outros era realmente um pseudoheterogeneity resultante de um desequilíbrio específica para o alelo mutante (MASI) ou heterogeneamente distribuídas a partir de
EGFR
amplificação. Vários estudos suportado o ocorrência de Masi em células tumorais mutada-EGFR, e este fenómeno está associado com o aumento da actividade transcricional alelo mutante [28] – [30].
EGFR
mutações, número de cópias do gene, os ganhos e MASI ocorrendo em conjunto em células tumorais parecem sinergia para efectuar um fenótipo maligno mais do que estas alterações individualmente [28] – [30]. Observou-se uma elevada
EGFR
número de cópias entre os pacientes com pura
EGFR
mutações, sugerindo que uma alta frequência de
EGFR
mutações ocorrem frequentemente com um elevado
EGFR
número de cópias (MASI). No entanto, em pacientes que apresentam heterogeneidade intratumoral,
EGFR
copiar o número foi menor do que em pacientes com pura
EGFR
tumores mutantes. A possível explicar é que os tumores heterogéneos contidos não só
EGFR
células mutantes, mas também as células do tipo selvagem, e a amplificação selectiva de alelos mutantes podiam ser diluído por um alelo de tipo selvagem, dando origem a uma relativamente baixa
EGFR
número de cópias.
Entre os tumores granel portadores do tipo selvagem
EGFR
, 10 de 40 casos apresentaram frequências muito mutantes mais baixo (5-8%) através da análise microdissection comparação com as 45 doentes portadores do mutante
EGFR
. Este assim chamado “falso negatividade”, medida a partir de tecido grandes quantidades pode ser devido à incapacidade de DHPLC para detectar pequenas quantidades de ADN mutante quando poucas células mutantes estão contidos numa amostra. Nós também determinou semiquantitativa abundância mutante através do cálculo da razão entre as alturas (M /W) a partir do gráfico DHPLC. De acordo com os nossos dados, a proporção mediana M /W variou 0,13-18,15 em
EGFR
casos mutantes e 0,06-0,22 nos casos do tipo selvagem, o que sugere que as células cancerosas em tecido tumoral normalmente contêm grandes quantidades e mutante tipos não mutantes simultaneamente. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo aplicação da relação M /W para semi-determinar quantitativamente
EGFR
estado de mutação e inferir heterogeneidade intratumoral.
Apenas 26 pacientes receberam EGFR-TKI, o que limitava o poder estatístico deste braço do estudo. No entanto, foi detectada uma taxa de mutação significativamente maior nos focos de pacientes PR e SD em comparação com pacientes com DP. Estes resultados eram consistentes com vários outros estudos. Taniguchi et al [31] analisaram a relação entre a
EGFR
heterogeneidade e a resposta ao EGFR-TKI por microdissecção em tumores NSCLC em estágio inicial, e relatou que os pacientes com maior
EGFR
frequência de mutação foram mais sensíveis ao EGFR-TKI e mostrou maior tempo de sobrevida livre de progressão do que pacientes com
EGFR
baixas taxas de mutação. Nós especulamos que a progressão rápida do tumor pode ocorrer em amostras com uma baixa percentagem de
EGFR
células mutantes, devido ao fato de que a apoptótica
EGFR
células mutantes que responderam ao EGFR-TKI foram superados em número pelos proliferando células não mutantes. Com base nessa especulação, sugerimos que a heterogeneidade intratumoral pode ser um fator importante que contribui para a resistência EGFR-TKI. As respostas dos pacientes podem pela melhoria através da administração de uma combinação de terapia EGFR-TKI e outras terapêuticas capazes de limpar não
EGFR
células tumorais mutantes de forma simultânea ou sequencial.
No geral, nossos resultados sugerem que os pacientes com câncer de pulmão avançado nutriam marcada EGFR heterogeneidade mutacional. A significância clínica mais importante do EGFR heterogeneidade mutacional pode ser capaz de explicar mecanismo de resistência de EGFR-TKI. Secundária heterogeneidade intratumoral da mutação EGFR também indicam que um único ponto ou biópsia única hora pode não ser melhor método para determinar a terapia personalizada EGFR-TKI. histológicos combinatória e genéticos abordagens utilizando informações sobre perfis de sobrevivência e de resposta podem fornecer melhores inferências para a prevenção eficaz da doença e cura no futuro.
Reconhecimentos
Agradecemos Prof Keneng Chen no Departamento de Cirurgia Torácica para fornecer amostras parciais, o Dr. Ning Wang no Departamento de Radiologia para avaliações da resposta do tratamento, o Dr. Yu Sun no Departamento de Patologia por sua contribuição na análise de amostras de Pequim Hospital Instituto. Agradecemos Prof Chen Yao (Universidade de Pequim Instituto de Pesquisa Clínica) e Dr.Guoshuang Feng (Chaoyang District Centro para o Controle e Prevenção de Doenças) para análise estatística.