Abstract

O DNA danos resposta quinase ATR pode ser um câncer alvo terapêutico útil. inibição ATR estabeleça sinergias com a perda de ERCC1, ATM, XRCC1 e DNA danificando agentes quimioterápicos. Os ensaios clínicos começaram a usar inibidores de ATR em combinação com a cisplatina. Aqui nós relatamos a primeira tela letalidade sintética com um tratamento de combinação de um inibidor de ATR (Atri) e cisplatina. O tratamento combinado com Atri /cisplatina é sinteticamente letal com perda do ζ polimerase TLS e 53BP1. Outras vias de reparação do ADN, incluindo recombinação homóloga e reparação de emparelhamentos incorrectos não apresentam interacções letais sintéticos com atri /cisplatina, mesmo que a perda de algumas destas vias de reparação sensibiliza células à cisplatina como um agente único. Nós também relatam que Atri synergizes fortemente com a inibição de PARP, mesmo em homólogas fundos de recombinação-proficiente. Finalmente, inibidores de ATR foram capazes de resensitize linhas de células resistentes à cisplatina a cisplatina. Estes dados fornecem uma análise abrangente das vias de reparo de DNA que apresentam letalidade sintética com inibidores de ATR quando combinado com quimioterapia com cisplatina, e vai ajudar a orientar estratégias de seleção paciente como inibidores de ATR progredir para a clínica do cancro

Citation:. Mohni KN, Thompson PS, Luzwick JW, Glick GG, Pendleton CS, Lehmann BD, et al. (2015) A tela Lethal Synthetic Identifica vias de reparo de DNA que sensibilizar células cancerosas para Combinada ATR de inibição e cisplatina tratamentos. PLoS ONE 10 (5): e0125482. doi: 10.1371 /journal.pone.0125482

Editor do Academic: Robert W. Sobol, University of South Alabama Cancer Institute Mitchell, United States |

Recebido: 16 de novembro de 2014; Aceito: 18 de março de 2015; Publicado: 12 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Mohni et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Institutes of Health [CA102792 a DC, T32CA093240 para KNM, CA95131 para JAP], Susan G. Komen [SAC110030 para JAP, PDF14302198 para KNM] eo Breast Cancer Research Foundation [DC]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

DNA danificando agentes quimioterápicos como a cisplatina são padrão de cuidados tratamentos para muitos tumores sólidos, incluindo o cancro da mama triplo-negativo (TNBC) e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Estes agentes funcionam colocando uma maior dependência de DNA respostas danos para a sobrevivência e proliferação. Mutações em genes de reparo de DNA são frequentes em TNBC e NSCLC e estudos genômicos indicam instabilidade do genoma significativa em um subconjunto de TNBC sugerindo defeitos de reparo do DNA [1-5]. TNBC muitas vezes tem uma boa resposta inicial à quimioterapia incluindo drogas de platina, mas pacientes recaída quase invariavelmente e pode desenvolver resistência [6, 7]. pacientes com NSCLC receber platina como uma droga de primeira linha e normalmente sobrevivem menos de um ano [8].

A quinase DNA danos resposta ATR (ATM- e relacionados com Rad3) coordena muitas das respostas celulares a danos no DNA ATR é necessário para estabilizar garfos de replicação paralisadas e permitir o reinício garfo após a lesão [9]. Na ausência de ATR, parado replicação garfos colapso em quebras de cadeia dupla, que pode levar a rearranjos genómicos ou a morte das células [10, 11]. activação ATR, também é necessária para reduzir a velocidade do ciclo celular para permitir tempo para reparação, através da fosforilação da cinase CHK1 seu efector [9]. ATR é uma cinase essencial, e muitas células de cancro têm uma maior dependência do ATR para compensar para o esforço de replicação induzida pelo oncogene [12-14].

Inibidores selectivos ATR foram descritos por Vertex Pharmaceuticals [15, 16] e AstraZeneca [17] e estão atualmente na fase I de ensaios clínicos em combinação com DNA danificando quimioterapia ou radioterapia. Para identificar quais os inibidores de ATR contexto genómico pode melhor ser utilizado como uma monoterapia que anteriormente conduzida uma tela sintética siARN letal para identificar genes que, quando inactivado células sensibilizadas à inibição ATR. Inactivação da endonuclease de ERCC1-XPF, bem como a perda de proteínas da via ATR conhecidos e proteínas de replicação do ADN para células de inibição ATR [18] sensibilizados fortemente. inibição ATR também é sinteticamente letal com perda de XRCC1 e ATM, bem como sobre-expressão de ciclina E [18-21].

inibição ATR synergizes com DNA danificando medicamentos de quimioterapia, tais como cisplatina e gemcitabina para matar células cancerosas [15 , 19]. inibição ATR tem demonstrado eficácia num modelo de ratinho de cancro pancreático em combinação com gemcitabina, e em xenoenxertos do tumor do pulmão derivado do paciente em combinação com a cisplatina [16, 22]. Assim, ensaios clínicos incluem tratamentos de combinação com um inibidor da ATR e cisplatina, gemcitabina, ou etoposido (ClinicalTrials.gov: NCT02157792). Aqui nós relatamos o primeiro siRNA tela de letalidade sintética sistemática combinando inibição ATR e tratamento com cisplatina a olhar para aplicações mais específicas do inibidor ATR quando combinado com quimioterapia. Como esperado, foi identificada a via de ATR, os genes de replicação de ADN, e ERCC1-XPF. Não houve benefício adicional de combinar Atri e cisplatina em qualquer recombinação homóloga (HR) -deficient ou reparação incompatibilidade (MMR) células -deficient. Nós encontramos que a perda de DNA polimerases translesão e 53BP1 hiper-sensibiliza células para Atri /cisplatina tratamento combinado. Desde mutações de inactivação são encontrados nestes genes em tipos de câncer, nossos dados sugerem valor terapêutico para combinada Atri /cisplatina nesses ambientes.

Materiais e Métodos

Células e reagentes

U2OS e HCT-116 foram obtidas a partir de Stephen Elledge, Agosto, 2002. MDA-MB-468 (HTB-132), HCC1806 (CRL-2335), BT549 (HTB-122), H157 (CRL-5802), e A549 (CCL -185) foram obtidas da ATCC e mantidas como anteriormente descrito [18]. As seguintes linhas celulares foram previamente descritos: células BRCA2 defeituosos e complementadas VC8 [23], HCT-116 + cromossomo 3 [24], hec59 e hec59 + cromossoma 2 [25]. MDA-MB-468 de células resistentes à cisplatina foram gerados por selecção contínua em cisplatina, e mantidas em meio suplementado com 3 um cisplatina. As células resistentes à cisplatina foram cultivadas sem cisplatina durante 7 dias antes do início de cada experiência para controlar quaisquer efeitos do tratamento com cisplatina. O inibidor da ATR (atri) VE-821 [19] foi sintetizado pelo Instituto de Biologia Vanderbilt Chemical Chemical Synthesis Facility. O inibidor de PARP (PARPi) BMN673 [26] foi adquirido a partir de Selleck Chemicals. A cisplatina foi comprado de Calbiochem.

tela siRNA letal sintética

A tela siRNA letal sintética foi feito como descrito anteriormente [18]. Resumidamente, utilizou-se uma biblioteca de siRNA alvejando personalizada 240 de reparação e de replicação de genes de ADN conhecida com 4 siRNAs por gene num formato de 96 poços. células U2OS foram transfectadas com a biblioteca de siRNA e dividida em quatro placas de 96 cavidades 72 horas após a transfecção. As células foram então ou não tratada ou tratada com 1 � Atri, cisplatina 0,5 uM ou 1 uM Atri e cisplatina 0,5 uM. A viabilidade das células foi determinado após um período adicional de 72 horas utilizando o azul de Alamar (Invitrogen). A percentagem de viabilidade de cada amostra foi determinada por comparação da amostra de fármaco tratada para a amostra não tratada para cada gene para controlar quaisquer efeitos específicos de um siRNA nas taxas de crescimento da célula. z-scores robustas foram calculados utilizando a mediana e o desvio absoluto médio dos valores log

10 (por cento viabilidade). Os valores apresentados são a média robustos z-scores de três transfecções independentes. Genes selecionados como exibindo relações letais sintéticos com qualquer um dos tratamentos medicamentosos têm pelo menos 2 siRNAs com z-scores robustos menos de -1.3. O único braço Atri da tela foi publicado anteriormente [18].

interferência de RNA e de viabilidade celular ensaios

Todas as transfecções siRNA foram realizados conforme descrito anteriormente com 10nM siRNA e Dharmafect 1 (Invitrogen) [ ,,,0],18]. Foram usadas as seguintes sequências de ARNsi: siREV3L-2 GAAGUUAUCUGGCUGCUUU, siREV3L-4 CAAAGAUGCUGCUACAUUA, si53BP1-2 GGACAAGUCUCUCAGCUAU, si53BP1-3 GAUAUCAGCUUAGACAAUU. O siRNA não-alvo foi Qiagen All Star Controlo negativo. Os ensaios de viabilidade celular de curto prazo foram realizadas como anteriormente descrito [18]. Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de 96 cavidades 72 horas após a transfecção com ARNsi e depois tratou-se com medicamentos para 72-96 horas, tal como indicado nas legendas das figuras. A viabilidade celular foi comparada com um controlo não tratado depois de subtrair os valores em branco bem a partir de todos os dados. A concentração máxima de DMSO na dose mais elevada de droga foi de 0,01% e não teve efeito sobre o crescimento celular. ensaios clonogénicos com células U2OS foram realizados como previamente descrito [27]. Em todos os ensaios de viabilidade celular os valores representam a média (n = 3) e as barras de erro representam o desvio padrão de uma experiência. Todos os experimentos foram realizados pelo menos duas vezes.

Análise Synergy

volumes log independência Bliss de sinergia (MM

2%) foram calculados com o uso MacSynergy II e relatou no intervalo de confiança de 95% para uma réplica (n = 3) [28]. Os picos no gráfico correspondem a uma sinergia e quanto maior for o pico mais forte o grau de sinergia. análise de isobolograma foi realizada como descrito [29, 30]. concentrações inibitórias fracionários foram determinados pela divisão do IC

50 de Atri com uma concentração fixa de cisplatina ou PARPi pelo IC

50 de Atri sozinho (coordenada x). A coordenada y é a concentração fixa de cisplatina /PARPi dividido pelo IC

50 de cisplatina /PARPi sozinho. A linha diagonal sólida no gráfico representa a aditividade e valores abaixo da linha representam sinergia. IC

50 valores foram determinados usando a versão Prism 6.

Imunofluorescência análise

realizada e quantificada como descrito anteriormente [27].

Resultados

inibição ATR synergizes com cisplatina e resensitizes células cancerosas resistentes à cisplatina

inibidores de ATR (Atri) sinergia exposição com cisplatina em matar HCT-116 células cancerígenas do cólon sugerindo combinações de Atri e cisplatina pode ser útil terapeuticamente [15, 19] . Consistente com este resultado, quantidades crescentes de atri reduzir a concentração de cisplatina necessária para matar células U2OS do osteossarcoma e ambos os agentes exibem sinergia marcada em ensaios de viabilidade a curto prazo (Figura 1A e 1B). A sinergia é referidos num gráfico, 3-dimensional com os dois agentes individuais (atri ou cisplatina) representada nas dimensões X e Z e um volume sinergia log independência Bliss representados graficamente na dimensão Y. Os picos no gráfico correspondem ao grau de sinergia com picos mais elevados indicando quantidades maiores de sinergia [28]. Synergy também foi avaliada utilizando análise isobolograma (Fig 1C). As concentrações inibidoras fraccionais (FIC) de atri e cisplatina são mostrados no eixo dos x e do eixo Y, respectivamente. Valores abaixo da linha sólida representa sinergia. Para confirmar estas observações em ensaios de viabilidade de longo prazo, as células U2OS foram tratados com atri, cisplatina, ou combinação atri /cisplatina para 24, 48, ou 72 horas e deixou-se formar colónias durante 14 dias (Figura 1D). Nas concentrações utilizadas, ambos atri e tratamento com cisplatina sozinha reduziu ligeiramente a capacidade das células para formarem colónias. O Atri /cisplatina tratamento combinado reduziu a formação de colónias por quase duas ordens de magnitude mais do que os simples tratamentos sozinho. Assim, não é grande sinergia entre atri e cisplatina em ensaios de viabilidade de longo prazo. Além disso, quase todos os do efeito de morte celular do tratamento combinado é transmitido, durante as primeiras 24 horas de exposição, como tempos de incubação mais longos não reduzem ainda mais a formação de colónias a capacidade das células

.

(A e B células U2OS) foram tratados com doses crescentes de cisplatina ou o inibidor da ATR (atri) sozinho ou em combinação, durante 72 horas. A viabilidade celular foi determinada com azul de alamar e relatado como uma percentagem das células de controlo não tratadas. Análise de sinergia entre a cisplatina e atri usando Bliss Independência (B) e a análise de isobolograma (C) tal como descrito nos materiais e métodos. (D) As células U2OS foram tratados com cisplatina 1 uM, 1 uM atri, ou ambos atri (+ Cis); as células foram libertadas em meio sem drogas após 24, 48, ou 72 horas e deixou-se formar colónias. (E) As células foram tratadas com 1 uM ou 1 uM atri cisplatina durante 24 horas, atri (24 horas), seguido por cisplatina (24 horas) A → C, ou cisplatina (24 horas), seguido por atri (24h) C → Uma. As barras de erro em todos os painéis são desvio padrão (n = 3).

Em seguida, perguntou se o fim do tratamento é importante para a sinergia. células U2OS foram tratadas com cisplatina isoladamente ou atri durante 24 horas, ou tratados com atri durante 24 horas, seguido por cisplatina durante 24 horas ou vice-versa (Figura 1E). As células tratadas com atri, cisplatina, ou atri seguido por cisplatina exibem uma redução de 2-5 vezes na capacidade para formar colónias. Surpreendentemente, as células tratadas com cisplatina seguido por atri exibiu uma redução de 1000 vezes na sua capacidade para formar colónias. Em conjunto, estes dados indicam que a máxima sinergia é observada quando as células são tratadas com cisplatina e atri simultaneamente, ou quando o tratamento cisplatina precede atri. Não sinergia foi observada quando o tratamento Atri precedida cisplatina.

A forte sinergia observada entre Atri e cisplatina levou-nos a hipótese de que Atri pode resensitize cânceres resistentes à cisplatina. Para testar essa ideia, geramos MDA-MB-468 células triplos resistentes à cisplatina cancro da mama negativo (TNBC) por exposição gradual contínua a concentrações crescentes de cisplatina (Fig 2A). Estas células foram tratadas com concentrações crescentes de atri sozinho, ou em combinação com 0,5 uM ou 3 um cisplatina (Fig 2B e 2C). Como esperado, a linha celular parental exibem sinergia com cisplatina 0,5 uM e foi completamente mortos por 3 um cisplatina (Figura 2D). A linha de células resistentes à cisplatina não exibiram qualquer sinergia com cisplatina 0,5 uM, mas exibiram sinergia com 3 um cisplatina, embora não ao nível das células parentais (Figura 2E). Assim, a inibição ATR foi capaz de resensitize células resistentes à cisplatina a cisplatina, mas estas células ainda não foram tão sensíveis como as células parentais. Nestas experiências, foi observada sinergia quando a dose de cisplatina começa a ter um efeito sobre a viabilidade celular (redução de 5-10 por cento em viabilidade) e sinergia máxima foi observada quando a dose de cisplatina reduziu a viabilidade celular em 25-50 por cento do não tratado ao controle. Inesperadamente, a linha de células resistentes à cisplatina foi ligeiramente mais sensível ao inibidor ATR sozinho, sugerindo que o mecanismo de resistência à cisplatina feitas as células mais dependentes da ATR sinalização para a sobrevivência

(A) MDA-MB-468. (468) e MDA-MB-468 de células resistentes à cisplatina (468-Cr) foram tratados com doses crescentes de cisplatina durante 96 horas antes de se medir a viabilidade celular com o azul de alamar. (B e C) MDA-MB-468 e MDA-MB-468 de células resistentes à cisplatina foram tratados com atri sozinho ou atri e cisplatina a 0,5 uM (B) ou de 3 um (C) durante 96 horas antes de se medir a viabilidade das células com azul de Alamar . (D e E) Bliss independência sinergia entre cisplatina e atri na MDA-MD-468 (D) e MDA-MB-468 de células resistentes à cisplatina (E). As barras de erro em todos os painéis são desvio padrão (n = 3).

Identificação de interações letais sintéticos com Atri /cisplatina tratamento combinado

Para identificar os determinantes genéticos da sinergia observada entre Atri e cisplatina, realizamos três telas siRNA letais sintéticos para procurar genes que, quando esgotados, células sensibilizadas para Atri ou cisplatina isoladamente, bem como Atri /cisplatina tratamento combinado. Nós usamos uma biblioteca siRNA personalizado que contém 240 reparação e replicação de DNA genes conhecidos com 4 siRNAs individuais por gene em poços separados de placas de 96 poços [18]. células U2OS foram transfectadas com a biblioteca de siRNA. 72 horas mais tarde, cada placa de 96 poços foi dividido em quatro placas de 96 poços e não tratadas à esquerda ou tratadas com 1 uM atri, cisplatina 0,5 uM, ou 1 uM uma combinação de cisplatina e atri 0,5 uM durante 72 horas (Figura 3a). A viabilidade celular foi medida com azul de Alamar, e a percentagem de viabilidade de cada siARN foi calculada comparando o valor de azul de alamar do siARN tratados em comparação com o siRNA não tratada. Este método controla para quaisquer efeitos específicos de um siRNA sobre o crescimento celular. As doses de droga foram escolhidos de tal forma que eles tinham um efeito mínimo sobre a viabilidade das células do ARNsi sem segmentação e teve um efeito máximo nos controlos ATR siRNA adicionados a cada placa de ecrã (Fig 3B). Propusemos que as doses mais baixas de atri são suficientes para matar as células ATR-empobrecido porque menos atri é necessária para inibir completamente a proteína ATR restante [18]. Todos os três tratamentos com drogas foram analisadas de forma independente, e a percentagem de viabilidade foi utilizado para calcular um índice z robusta para cada tratamento da toxicodependência, tal como descrito nos materiais e métodos. A tela foi concluída em triplicado, e os escores z robustos médios foram plotados para cada siRNA para cada um dos tratamentos medicamentosos (Fig 3C-3E). Os siRNAs de controlo positivo interna, dirigido ATR e ATRIP são destacadas em vermelho e a linha vermelha sólida indica o ponto de corte limite usado para selecionar siRNAs. S1 Dataset apresenta os resultados completos de todas as três telas. Genes com pelo menos 2 siRNAs ter um z-score robusta de -1,3 ou menos foram selecionados como exibindo relações letais sintéticos. A relativamente modesto robusta corte z-score foi escolhida uma vez que esta é uma biblioteca parcial de proteínas de resposta danos ao DNA e replicação que esperamos ter uma maior frequência de interações letais sintéticos do que uma biblioteca aleatória.

(A) Schematic da tela de siRNA. células U2OS foram transfectadas com siRNAs e então ou não tratada ou tratada com 1 � Atri, cisplatina 0,5 uM, ou Atri e cisplatina. A viabilidade celular foi medida com azul de alamar. (B) A viabilidade dos controles não-alvo (NT) e ATR siRNA usando as condições de tela. Os valores representam a média ± DP de três replicados independentes da tela. (C-E) Os robustos z-scores de tratados em comparação com a viabilidade das células não tratadas foram determinadas para cada siRNA na biblioteca para Atri (C), cisplatina (D), e Atri e cisplatina (E). Os círculos vermelhos representam os 8 siRNAs únicas dirigidas ATR e ATRIP presente na biblioteca e a linha vermelha indica uma pontuação z robusta de -1,3. (F) Resumo da sobreposição de relações letais sintéticos com Atri, cisplatina, ou Atri e cisplatina. (G) Lista completa de genes que apresentam uma relação letal sintético com Atri, cisplatina, ou Atri e cisplatina. Genes com 2 ou mais siRNAs com robustos z-scores de menos de -1.3 são considerados tão letal sintética. A tela de agente único Atri foi publicado anteriormente e incluídas em comparação com os outros tratamentos de droga [18].

As três telas de genes que exibiram as relações letais sintéticos em uma ou mais das combinações de drogas identificadas e em várias vias de reparação de DNA distintos (Fig 3F e 3G). O braço Atri da tela foi publicado anteriormente e aqui incluídos para comparação com a tela de tratamento de combinação [18]. Como relatado anteriormente, a maior família de genes identificados que apresentam letalidade sintética com Atri só foram genes da via ATR e genes de replicação de DNA, incluindo uma interacção letal sintética anteriormente não declarada com a ribonucleótido-redutase (

RRM1

e

RRM2

). Também identificamos remodelers cromatina, genes da via da Anemia de Fanconi, polimerases de DNA translesão, e

ERCC1

[18].

ATM

e

XRCC1

não chegar ao nosso ponto de corte com mais de um siRNA e não foram incluídos na lista de interações letais sintéticos. Estas interacções foram previamente identificados utilizando linhas celulares de nulos e complementadas, bem como os inibidores de moléculas pequenas [19, 20]. É possível que completa silenciamento /inibição é obrigada a respeitar a letalidade sintética relatado e não foi realizado com o siRNA usada em nossa biblioteca.

Usando cisplatina como agente único, observamos letalidade sintética com genes de RH como esperado uma vez que este é um mecanismo importante necessária para reparar aduetos cisplatina. As células deficientes em

ATR

, DNA translesão vias polimerase, XPF (

ERCC4

),

XAB2

, e

XRCC1

também são hipersensíveis à cisplatina.

A tela /sensibilidade cisplatina combinada Atri foi realizado nas mesmas doses de Atri e cisplatina que foram usados ​​nas telas de drogas individuais. Esta tela também identificou genes da via ATR e um subconjunto de genes de replicação de DNA, que são susceptíveis presente com base em sua letalidade sintética apenas com Atri. famílias de genes novos encontrados no tratamento combinado incluem genes de reparo, polimerases de DNA translesão adicionais, XPF (

ERCC4

),

TP53BP1

,

DDB2

e SOSS-A (

INTS3

). Com a combinação de Atri tratamento /cisplatina,

ATM

,

RAD50

, e

RAD54

abordagem L nosso limite nível de significância com um siRNA para cada produzindo um z-score menos de -1,3 e um segundo siRNA com um robusto z-score menor que -0.9.

relações sintéticas entre RH ou MMR e Atri /cisplatina

Curiosamente, a perda de genes de RH não causou sinergia com Atri /cisplatina, embora seja sinérgico com cisplatina isolada. Verificou-se este resultado utilizando células VC8 BRCA2 deficientes. Estas células são extremamente sensíveis a cisplatina em comparação com células manipuladas para isogénicas re-express de tipo selvagem BRCA2 (Fig 4A). No entanto, eles não são hipersensíveis a atri sozinho e a terapia de combinação de atri /cisplatina não resultou em qualquer morte sinérgica em doses de cisplatina baixas ou moderadas (FIG 4B e 4C). A grande quantidade de morte visto no tratamento de combinação de dose alta de cisplatina é quase todo devido à toxicidade reforçada da cisplatina em células HR-defeituoso. A falta de letalidade sintética pode ser porque a inibição da ATR reduz a eficiência da HR de modo mais nenhuma sinergia é observada em fundos de RH deficiente em [31].

células VC8 BRCA2 deficiente ou células VC8 complementada com uma expressão BRCA2 vector foram tratados com Atri, cisplatina e Atri /combinação de cisplatina. (A) Sensibilidade das células deficientes em BRCA2 à cisplatina. (B e C) Sensibilidade das células BRCA2 deficientes para Atri sozinho e Atri, quer com 0,05 ou cisplatina 0,1 uM. A viabilidade celular foi medida com Alamar Blue após 72 horas e relatado como uma percentagem das células de controlo não tratadas. As barras de erro são o desvio padrão (n = 3).

Vários genes MMR exibiu letalidade sintética com o /cisplatina tratamento combinado Atri na tela. Desde MMR-deficiência é uma característica comum de muitos tipos de câncer, buscou-se verificar que as células tumorais com MMR por deficiência são hipersensíveis aos tratamentos Atri /cisplatina combinados. A linha celular de cancro do cólon HCT-116 é MMR deficiente devido à falta de MLH1. Surpreendentemente, quando comparado com HCT-116 + cromossomo 3 em que a expressão MLH1 foi restaurado [24], não foi encontrada diferença na sensibilidade à Atri sozinho ou a combinação de Atri /cisplatina em ensaios a curto prazo e viabilidade a longo prazo ( Figura 5A e 5B). Também testamos o papel da MMR em HEC59 células cancerosas endometrial, que são deficientes em MSH2 e, consequentemente, não expressam MSH3 ou MSH6. Estas células não exibiram nenhuma letalidade sintética com atri sozinhos ou a combinação de atri /cisplatina em comparação com a linha celular complementado tanto a curto prazo e os ensaios de viabilidade de longo prazo (Fig 5C e 5D). Em conjunto, estes dados indicam que o reparo incompatibilidade não é um indicador útil de letalidade sintética com Atri ou Atri /tratamento de combinação com cisplatina. Assim, várias vias de reparação de ADN não exibem nenhuma letalidade sintética com a inibição ATR ou a combinação de ATR /cisplatina incluindo RH e MMR.

(A e C) As células foram tratadas com doses crescentes de atri sozinho ou em combinação com 0,5 cisplatina uM durante 72 horas. A viabilidade celular foi medida com Alamar Blue e relatado como uma percentagem das células de controlo não tratadas para cada linha celular. (B e D) As células foram tratadas com 1 uM atri, cisplatina 0,5 uM, ou ambos (A + C); as células foram libertadas em meio sem drogas após 24 horas e deixou-se formar colónias. (A e B) MLH1 deficiente em células HCT-116 e HCT-116 células complementadas com MLH1. (C e D) células HEC59 MSH2 deficiente e células HEC59 complementada com MSH2. As barras de erro em todos os painéis são desvio padrão (n = 3).

inibição ATR é sintético letal com inibição de PARP

inibidores de PARP exibem letalidade sintética com perda de RH, e estão atualmente em ensaios clínicos para o tratamento de tumores BRCA-deficiente [32-34].

PARP1

,

PARP2

, e

PARP4

estavam em nossa biblioteca e não causou letalidade sintética com qualquer um dos tratamentos com medicamentos indicando que a perda genética de PARP não sensibiliza células a inibição ATR. No entanto, a ATR foi identificado como o terceiro mais elevado do gene de pontuação da tela procurando interacções letais sintéticos com a inibição de PARP [35] e inibição ATR sensibilizados células de cancro do ovário para o inibidor de PARP Veliparib [36]. a inibição de PARP pode produzir resultados diferentes em comparação com a perda genética dos genes de PARP devido aos múltiplos PARPs em células e a necessidade para capturar complexos de PARP no ADN para a morte celular [34, 37-39]. células U2OS tratados com doses crescentes de BMN673 reduziu significativamente a quantidade de atri necessária para matar as células e exibiram sinergia acentuada ao longo de um largo intervalo de doses em ensaios de viabilidade a curto prazo (Fig 6A-6C). Esta observação foi ainda mais pronunciada na colônia ensaios que formam a longo prazo, onde o tratamento combinado de Atri e BMN673 reduziu a capacidade das células para formar colônias em mais de 1000 vezes (Fig 6D). Resultados semelhantes foram obtidos em células HCT-116.

células U2OS

(A) foram tratados com doses crescentes de ATR e os inibidores da PARP durante 96 horas. A viabilidade celular foi medida com Alamar Blue e relatado como uma percentagem do controlo não tratado. A sinergia entre a ATR e inibição de PARP usando Bliss Independência (B) e análise de isobolograma (C) tal como descrito nos materiais e métodos. (D) As células foram tratadas com 1 uM atri, 2 nM PARPi, ou ambos (a + P) e as células foram libertadas em meio sem drogas após 72 horas e deixou-se formar colónias. As barras de erro em todos os painéis são desvio padrão (n = 3).

Perda de Rev3 e 53BP1 sensibiliza células cancerosas para Atri e cisplatina

genes adicionais identificados no ecrã como exibindo forte letalidade sintética com Atri combinação /cisplatina foram

REV3L

e

TP53BP1

.

REV3L

foi o quarto gene de pontuação mais alta (após

POLD2

,

ATR

, e

ATRIP

) identificados. Rev3 é a subunidade catalítica da polimerase ζ translesão (TLS). A subunidade estrutural do Pol ζ, rev7, também foi identificada como sintético letal com a combinação /cisplatina Atri com 2 de 4 siRNAs. TLS é dividido em duas etapas, inserção de um nucleótido em frente a uma base danificada e extensão após a inserção [40]. Extensão após a inserção de várias polimerases TLS é muitas vezes realizada por Pol ζ. Este evento de comutação de polimerase requer REV1. 3 de 4

REV1

siRNAs causou letalidade sintética com Atri /cisplatina (robustas z-score de -1,9, -1,0 e -0,9), embora a magnitude de dois deles só perdeu nosso limite de significância. O aparecimento de ambas as subunidades de ζ Pol e a polimerase necessário para carregá-lo sugere fortemente perda deste complexo cria hipersensibilidade a Atri /cisplatina.

Para validar os resultados obtidos na tela e avaliar a sua generalização que derrubou Rev3 utilizando dois siRNAs específicos na linha de células NSCLC H157. As células H157 foram depletados de Rev3 ligeiramente mais sensível a concentrações elevadas de cisplatina do que as células que expressam o siARN não-direccionamento (Fig 7A). células empobrecido-REV3 foram então tratadas com doses crescentes de atri sozinho, ou em combinação com cisplatina. Depleção de Rev3 moderadamente sensibilizados células H157 para atri sozinho com ambos os siRNAs (Figura 7B e 7C). letalidade sintético aumentou foi observada quando as células foram tratadas com a combinação atri /cisplatina (Figura 7B e 7C). Em contraste, as células H157 transfectadas com o não-siRNA alvejando exibiram sinergia com atri e cisplatina apenas com doses elevadas de combinação atri /cisplatina (Figura 7D). Células desprovidas de Rev3 exibiu grandes quantidades de sinergia ao longo de um intervalo de dose ampla de Atri e cisplatina (Fig 7E e 7F). sinergia máxima foi observada na dose de cisplatina apenas antes que exibe qualquer morte com um único agente. Também observamos resultados semelhantes através da formação de colónia de ensaio (S1 Fig) e ensaios de viabilidade de curto prazo com outras linhas celulares de cancro NSCLC e TNBC (S2-S4 figos).

células (AF) H157 NSCLC foram transfectadas com os não -targeting siRNA (Sint) ou dois siRNAs segmentação rev3 (número 2 e 4 referem-se a sequências específicas descritas nos materiais e métodos). As células foram então tratadas com atri, cisplatina, e atri e cisplatina. A viabilidade celular foi determinada com azul de alamar e relatado como uma percentagem das células de controlo não tratadas. (A) Sensibilidade das células knockdown REV3 a cisplatina. (B e C) Sensibilidade das células knockdown REV3 para Atri e Atri, com 0,1 uM cisplatina. sinergia independência Bliss entre Atri e cisplatina no controle (D) e as células knockdown REV3 (E e F). As barras de erro em todos os painéis são desvio padrão (n = 3).

Depois de Rev3,

TP53BP1

foi o segundo maior gene de pontuação que não era uma via ATR ou um gene de replicação de DNA . 53BP1 é uma proteína DNA danos resposta a funções de reparação ruptura de fita dupla. 53BP1 impede ressecção nas quebras de cadeia dupla e influencia a escolha via para a reparação do DNA, promovendo final não homóloga juntar [41-43]. 53BP1 também é necessária para proteger os sítios frágeis cromossômicos e outras regiões sub-replicadas durante a mitose para eventual reparação no G1 subsequente [44, 45].

Para generalizar a relação genética 53BP1 com a combinação Atri /cisplatina, foram analisados redução de 53BP1 na linha de células NSCLC H157. Esgotamento de 53BP1 teve um efeito menor sobre a sensibilidade das células ao agente único tratamento com cisplatina (Fig 8A). células com depleção de 53BP1 exibiu acentuada sensibilidade ao tratamento Atri sozinho com ambos os siRNAs testados (Fig 8B e 8C). A viabilidade celular foi ainda mais reduzido com o tratamento combinado de atri /cisplatina. Como observado anteriormente, o tratamento de combinação com atri /cisplatina exibiram sinergia apenas com doses elevadas de ambos os medicamentos em células transfectadas com o siARN não-direccionamento (Fig 8D).