Sumário

A expressão da proteína L-inflamatória receptor acoplado CysLT

1R tem sido mostrado para ser regulada positivamente em pacientes com cancro do cólon e associado com mau prognóstico. O presente estudo investigou a correlação entre CysLT

1R e desenvolvimento do cancro do cólon

in vivo

usando CysLT

1R antagonistas (ZM198,615 ou montelucaste) eo modelo do rato de xenotransplante nu. Dois regimes de administração de drogas foram estabelecidos. O primeiro regime foi criado para investigar a importância da CysLT

1R na iniciação do tumor. Ratinhos nus foram inoculados com 50 uM CysLT

HCT-116 células de cancro do cólon pré-tratados com antagonistas 1R e receberam tratamento contínuo (5 mg /kg /dia, intraperitonealmente). O segundo regime tinha como objectivo abordar o papel da CysLT

1R na progressão tumoral. ratinhos nus foram inoculados com células sem pré-tratamento HCT-116 e não recebeu CysLT

tratamento antagonista 1R até o aparecimento do tumor gravável. Ambos os regimes resultaram no tamanho do tumor significativamente reduzida, atribuída a alterações na proliferação e apoptose, conforme determinado por níveis reduzidos de Ki-67 e aumento dos níveis de p21

WAF /Cip1 (

P

0,01), clivado da caspase 3, e o produto foi clivado da caspase-citoqueratina 18. diminuição dos níveis de VEGF (

P

0,01) e do tamanho do vaso reduzida (

P

0,05) também foram observados, esta última apenas no grupo ZM198,615-pré-tratamento. Além disso, foi realizada uma série de

in vitro

estudos utilizando a linha de células de cancro do cólon

1R antagonistas HCT-116 e CysLT. Em adição a uma redução significativa da proliferação celular, a adesão e a formação de colónias, foi observada a indução da paragem do ciclo celular e apoptose de um modo dependente da dose. A capacidade de Montelucaste para inibir o crescimento de xenoenxerto de cancro do cólon humano foi ainda validado usando duas linhas adicionais de células de cancro do cólon, SW-480 e HT-29. Os nossos resultados demonstram que CysLT

1R antagonistas inibem o crescimento de xenoenxertos de cancro do cólon principalmente por redução da proliferação e indução de apoptose das células tumorais

citação:. Savari S, Liu M, Zhang Y, W Sime, Sjölander Um (2013) CysLT

1R Antagonistas inibir o crescimento tumoral num modelo de xenoenxerto de cancro do cólon. PLoS ONE 8 (9): e73466. doi: 10.1371 /journal.pone.0073466

editor: Lishan Su, da Universidade de Carolina do Norte em Chapel Hill, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de novembro de 2012; Aceito: 22 de julho de 2013; Publicação: 05 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Savari et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiada por doações para a partir da Fundação sueca de Câncer (CAN 2009/1185, 10 de 0478), o Conselho de Investigação médica Sueco (X-10356), Fundação Gunnar Nilsson Cancer (www.cancerstiftelsen.com), a Fundação Österlund, a Fundação no Hospital Skåne Universidade, e por WS Royal Society fisiográfica em Lund (www.fysiografen.se). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

eicosanóides incluem uma grande variedade de metabolitos lipídicos bioactivos derivados de ácidos gordos essenciais de 20 carbonos poli-insaturados. O ácido araquidónico pertence à família omega-6 e é o precursor dos eicosanóides, tais como leucotrienos, prostanóides, hidroxilo eicosatetraenóicos ácidos (HETEs) e epóxidos. Estes eicosanóides são considerados pró-inflamatória; epidemiológico, e estudos laboratoriais clínicos estabeleceram que o metabolismo aberrante do ácido araquidónico através da ciclo-oxigenase (COX) e a lipoxigenase (LOX) vias, que geram prostanóides e leucotrienos, respectivamente, podem promover a inflamação crónica e carcinogénese [1], [2 ]. O leucotrieno instável

4 (LTA

4) é formado por 5-LOX, na presença de 5-lipoxigenase-proteína de activação (FLAP). LTA

4 é metabolizado, quer LTB

4 ou os leucotrienos de cisteinilo, LTC

4, LTD

4 e LTE

4 [3].

cisteinilo leucotrienos estão envolvidos em processos das vias respiratórias, tais como a secreção de muco, aumento da permeabilidade vascular, quimiotaxia de eosinófilos, e a broncoconstrição [4], [5], [6], [7]. leucotrienos de cisteinilo também estão implicados em doenças inflamatórias crónicas, tais como artrite reumatóide, asma, e doenças inflamatórias do intestino (IBD) [8], [9], [10]. O meio inflamatório tem sido amplamente reconhecida como uma das características que permitam de cancro [11]. Por conseguinte, existe uma forte correlação entre a longa IBD, tais como colite ulcerativa e doença de Crohn, em que os eicosanóides pró-inflamatórias (isto é, derivados do ácido araquidónico) são abundantes e cancro colorrectal [12], [13]. O câncer colorretal é o terceiro tipo de câncer mais comumente diagnosticado no mundo e tem a taxa de mortalidade quarta maior [14]. Estima-se que os pacientes que sofrem de IBD têm um risco aproximadamente 30 vezes maior de desenvolver cancro colorrectal [15]. Outros eicosanóides derivados da via araquidónico que estão implicados no cancro do cólon incluem os prostanóides. Prostaglandina E

2 (PGE

2) é derivado do ácido araquidônico pela via COX e é o prostanóide mais abundante e mais extensivamente estudado em câncer, especialmente câncer de cólon. PGE

2 foi mostrado para aumentar a carga de tumor nos intestinos de ambos APC

Min /+ e murganhos azoximetano induzida [2]. LOX-5 e COX-2, as enzimas responsáveis ​​pela produção de leucotrienos de cisteinilo e PGE

2, respectivamente, têm também sido implicado no cancro do cólon. Sua expressão aumentada tem sido documentado em pacientes com adenocarcinomas colorretais [16].

Leucotrienos

cisteinilo mediar os seus efeitos através de G receptores acoplados à proteína (GPCRs) e são referidos como CysLT

1R e CysLT

2R, com base na sua caracterização farmacológica e funcional de perfis em resposta a uma série de agonistas ou antagonistas em diferentes sistemas celulares e de tecidos [17]. CysLT

1R tem uma maior afinidade para LTD

4, o mais potente do leucotrieno de cisteinilo, enquanto CysLT

2R tem uma afinidade mais baixa, mas iguais tanto para LTD

4 e LTC

4 [18] , [19]. ZM198,615 Montelucaste e são sub

antagonistas selectivos 1R CysLT utilizados em estudos de doenças inflamatórias tais como artrite reumatóide e asma [20], [21]. Este último CysLT

antagonista 1R também é utilizado na clínica para o tratamento de pacientes com asma [22].

O equilíbrio entre o CysLT

1 e CysLT

2 receptor parece ser importante na etiologia da doença de cancro do cólon. De facto, mostrámos que estes dois receptores são co-localizadas e formar ambos os heteroátomos e homodimeros na linha celular epitelial intestinal humana Int 407 e que LTC

4 estimulação de CysLT

2R regula negativamente a expressão à superfície celular de CysLT

1R [23]. Os nossos estudos anteriores mostraram também que LTD

4, através de CysLT

1R induz a regulação positiva de proteínas associadas a cancro do cólon, tais como COX-2, β-catenina, e Bcl-2 em células epiteliais intestinais [24] . Além disso, temos mostrado que CysLT

1R é regulada em pacientes com câncer de cólon e está associada com mau prognóstico [16], ao passo que a baixa expressão concomitante de CysLT

1R e alta expressão de CysLT

2R mediar boa prognóstico [25]. Além disso, o nosso trabalho anterior mostrou que

4 induzida por LTD CysLT

1R sinalização resulta na proliferação de células, a sobrevivência, a migração e [26], [27]. Em contraste, LTC

4 estimulação de CysLT

2R tem sido mostrado para induzir a diferenciação de células de cancro do cólon, e diminuição da expressão de CysLT

2R está associada com o prognóstico do paciente pobre [28].

no presente estudo, investigamos a função do CysLT

1R no crescimento do cancro do cólon usando CysLT

1R antagonistas. Foram estudados os efeitos de CysLT

1R antagonistas em 116 HCT-células cancerígenas do cólon humano ambos

in vitro

e

in vivo

usando o mouse modelo de xenotransplante nu.

materiais e Métodos

Reagentes

o CysLT

1R antagonista ZM198,615 (ICI-198615) foi um presente da AstraZeneca ea CysLT

1R antagonista montelucaste foi comprado a partir Cayman Chemicals Co. (Ann Arbor, MI). Celular reagente de proliferação de WST-1 e o anticorpo monoclonal de ratinho M30 CytoDeath (01:10) foram da Roche (Basileia, Suíça). O kit de detecção de apoptose Anexina V-PE foi da BD Pharmingen (San Diego, CA). O Quick Start ™ Bradford Dye Reagent, Mini-Protean TGX ™ Gel, os anticorpos rábano conjugada secundárias e reagente de detecção quimioluminescente foram de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). caspase 3 clivada anticorpo anti-humano de coelho monoclonal (1:200) foi adquirido a Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Obteve-se o anticorpo Ki67 monoclonal anti-humano de coelho (1:500) da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). PECAM-1 (CD31) de anticorpo policlonal de cabra anti-ratinho (1:700) e anticorpo anti-VEGF humano policlonal de coelho (1:200) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Monoclonal de rato anti-humano p21

WAF1 anticorpo /Cip1 (1:1200) foi de DakoCytomation (Glostrup, Dinamarca). Policlonal de coelho anti-humano CysLT

anticorpo 1R (1:250) foi obtido a partir de Innovagen (Lund, Suécia). Rato anticorpo anti-β-actina monoclonal foi da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). O kit de EIA Leukotriene cisteinil foi adquirido a partir de Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI). Todos os outros produtos químicos eram de grau analítico e foram obtidos da Chemicon International (Temecula, CA), ou Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).

Cultura celular

HCT-116 células ( ATCC

® No. CCL-247), derivada de carcinoma do cólon humano, SW-480 (ATCC

® No. CCL-228) e HT-29 (ATCC

® No. HTB-38), derivada de adenocarcinoma de cólon humano, foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA).

HCT-116 e HT-29 foram cultivadas em meio de McCoy 5A, enquanto SW-480 células foram cultivadas em meio RPMI 1640. Todos os meios foram suplementados com 10% de soro fetal de bovino (FBS) a 55 ug /ml de estreptomicina, 55 IU /ml de penicilina, e 1,5 ug /ml de fungizona. As células foram cultivadas durante 5 dias a 70

–

80

%

confluência a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. Todos os experimentos foram realizados com células em passagens de 5 a 30, e as células foram testados regularmente para garantir a ausência de contaminação por micoplasma.

Tumor Xenoenxerto Estudos

Todos os experimentos com animais foram aprovados pela Regional de Ética Comitê de Pesquisa animal da Universidade de Lund, na Suécia (M205-10). ratinhos nus atimicos de 6 a 8 semanas de idade, fêmeas (BalbC nu /nu) foram adquiridos a Taconic Europe A /S (Ry, Dinamarca). Para induzir a xenoenxertos de cancro do cólon humano subcutâneas, 2,5 × 10

6 de baixa passagem HCT-116 células em 100 ul de PBS foram injectadas em dois flancos por ratinho (n = 7 ratinhos /grupo). Dois regimes de administração de drogas foram estabelecidas para investigar a importância funcional do CysLT

antagonistas 1R na iniciação e progressão tumoral. Os animais tratados de acordo com o primeiro esquema foram inoculados com HCT-116 células pré-tratadas com DMSO (DMSO I), 50 uM ZM198,615 (Pré-ZM), ou 50 | iM montelucaste (Pré-montelucaste), durante 30 min. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de exclusão com corante azul de tripano e apenas as células viáveis ​​foram consideradas para a injecção subcutânea. Em seguida, a partir do dia da inoculação, os ratinhos receberam diariamente i.p. injecções com DMSO ou CysLT

1R antagonistas (5 mg /kg) dissolvido em DMSO, diluídos em PBS, para um volume total de 100 ul (Figura 1A). De acordo com o segundo regime, os animais foram inoculados com células HCT-116 sem pré-tratamento. Uma vez que os tumores palpáveis ​​foram estabelecidos 6 dias após a injecção, os ratinhos foram aleatoriamente divididos em três grupos e, em seguida, decidido qual o grupo deve ser tratada com DMSO (DMSO II), ZM198,615, ou montelucaste. O i.p. os ratinhos receberam diariamente injecções de DMSO ou o CysLT

1R antagonistas (5 mg /kg) (Figura 1E)

(A) Protocolo experimental para os grupos pré-tratamento.; BalbC ratinhos (nu /nu) foram injectadas subcutaneamente em dois flancos com células HCT-116 pré-tratadas com ZM198,615 ou montelucaste (50 uM), e receberam o tratamento por via intraperitoneal a partir do dia da inoculação com DMSO, 198,615 ZM, ou Montelukast (5 mg /kg /dia). (B) a incidência de tumores de ratos tratados com DMSO (DMSO grupo I), ZM198,615 (grupo de pré-ZM), ou Montelukast (grupo de pré-montelucaste) e (C) o peso do tumor em comparação com o grupo I de DMSO no final de da experiência (dia 21). (D) as imagens de tumores representativos do grupo de pré-tratamento. (E) Protocolo experimental para o estudo do tratamento; sem pré-tratamento HCT-116 células foram injectadas subcutaneamente em dois flancos de ratinhos nus. DMSO (DMSO grupo II), ZM198,615 (grupo ZM), ou Montelukast (grupo montelucaste) tratamento começou no dia 6 após a inoculação das células de tumor. (F) Os volumes dos tumores ao longo de um período de 21 dias e (g) de peso do tumor no final da experiência (dia 21). (H) a partir de imagens de tumores representativos do grupo de tratamento. Os dados quantitativos apresentados são a média ± SEM. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001. análise do volume do tumor foi realizada por ANOVA de duas vias e peso do tumor análise foi realizada pelo estudante de

t

teste.

Além disso, SW-480 ou células HT-29, 2,5 × 10

6 células de baixa passagem em 100 ul de PBS foram injectadas em dois flancos por rato (n = 12 e n = 18 ratos para SW-480 e HT-29, respectivamente) para induzir a xenoenxertos de cancro do cólon humano subcutâneos em fêmea 6 -para ratos atímicos 8 semanas de idade (BalbC nu /nu). Todos os ratinhos tinham tumores palpáveis ​​estabelecida em ambos os flancos no dia 7 e foram divididos aleatoriamente em dois grupos para cada linha celular. Antes de se iniciar os tratamentos, um investigador medidos os tamanhos dos tumores de todos os tumores para assegurar que não havia nenhuma diferença de tamanho entre os diferentes grupos. Os ratinhos, em seguida, recebidas injecções IP diárias durante 14 dias, quer com DMSO ou Montelukast (5 mg /kg) (= 6 e n = 9 murganhos por grupo de tratamento para SW-480 e HT-29, respectivamente).

rato de peso corporal e o tamanho do tumor foram registados a cada terceiro dia. A fórmula para calcular o volume do tumor foi

V

= π /6 × 1,58 (

comprimento x largura

)

3/2 [29]. Após 21 dias, todos os ratinhos foram sacrificados e os tumores removidos, medidos, pesados, e fotografados. Os tecidos tumorais foram fixados em 10% de formalina tamponada, embebidos em parafina para análise imuno-histoquímica e /ou congeladas rapidamente em azoto líquido, e armazenado a -80 ° C para análise de Western blot.

A dose de montelucaste (5 mg /kg) foi escolhida com base em dados publicados, em que dosagens que variam de 5-10 mg /kg, têm sido relatados em uma grande variedade de modelos experimentais ratos [30], [31], [32]. As dosagens de 2 mg /kg e 10 mg /kg também foi investigado e os resultados revelam tendências semelhantes na inibição do crescimento do tumor de xenoenxerto (dados não mostrados).

A imuno-histoquímica

secções embebidas em parafina obtidos a partir de tumores xenoenxertados foram seccionados (5 uM) para coloração imuno-histoquímica. Todos os procedimentos foram realizados utilizando um Dako Stainer automática de correr de acordo com as instruções do fabricante. As lâminas foram fotografadas com uma Nikon Eclipse 800 microscópio e avaliados de forma cega por dois observadores independentes. Ki-67 secções coradas inteiras foram escaneados com Aperio ScanScope CS (Aperio Technologies, Inc, Vista, CA) e uma área em que a coloração foi particularmente prevalente (ie, hot spot) foi identificado em cada tumor usando um campo de baixa potência (× 40). 3 campo de alta potência (× 400) imagens foram selecionadas para análise em cada ponto quente. Usando o software NIS-Elements um limite foi definido para definir e medir a proporção de Ki-67 área manchada positivo para a área total do campo de alta potência. Estimativa de células apoptóticas foi realizada por detecção do produto clivado-caspase de citoqueratina 18 com CytoDeath (M30). Dependendo do tamanho do tumor, 5-10 campos aleatórios foram escolhidos, e o número de células apoptóticas média por campo foi medida (200x). Anticorpo dirigido contra CD31 foi utilizada para quantificar a densidade microvascular (MVD). Imagens (× 100) foram tomadas a partir de três áreas com a maior densidade de microvasos aparência (isto é, pontos quentes) e o valor médio de contagem de CD31-positivo calculada. Para estimar a área de estruturas de CD31-positivas (área do vaso), as imagens foram salvas como arquivos TIFF. A coloração positiva foi quantificada utilizando a função limite Adobe Photoshop e combinados com análises de histograma. O número médio de pixels positivos por seção tumor a partir de três pontos quentes foi gravado.

Western Blot

Para caspase clivada 3 e CysLT

analisa 1R, as células foram cultivadas durante 5 dias para 70% de confluência. Apenas aderente HCT-116, SW-480 e células HT-29 foram coletadas para CysLT

analisa 1R. Para a análise da caspase clivada 3 foi utilizada tanto células aderentes e flutuantes HCT-116. Os lisados ​​celulares foram preparados e solubilizadas em tampão de amostra, como descrito anteriormente [26]. Extracção de proteínas de tecido de tumor xenoenxertado foi realizada por ultra-sons. Resumidamente, os tecidos de tumor em 700 ul de tampão redução arrefecido com gelo tampão (Tris 62,5 mM, pH 6,8, ureia 6 M, glicerol a 10%, e SDS a 2%) contendo inibidores de protease (2 NA mM

3VO

4, 4 ug /ml de leupeptina, e 60 ug /ml de fluoreto de fenilmetilsulfonilo) foram submetidas a ultra-sons em gelo durante 30 seg. Os lisados ​​de células completas foram centrifugadas a 3400 ×

g

durante 15 min a 4 ° C. Azul de bromofenol (0,003%) e mercaptoetanol (5%) foram adicionados aos sobrenadantes de amostras. As proteínas foram separadas por electroforese em pré-moldado quaisquer kD ™ géis de SDS-poliacrilamida e electrotransferidas para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite em pó magro ou BSA a 5% em 0,05% de Tween /PBS durante 1 h à temperatura ambiente e depois incubadas com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. Finalmente, as membranas foram incubadas com um anticorpo secundário apropriado conjugado com peroxidase de rábano durante 1 h à temperatura ambiente e detectado com um reagente de quimioluminescência. Immunoblotting resultados foram visualizados com o sistema XRS Molecular Imager ChemiDoc e software Image Lab (Bio-Rad Laboratories).

Ensaio de Proliferação

A proliferação celular foi medida utilizando o ensaio de proliferação celular WST-1 de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas em triplicado em placas de 96 cavidades de fundo plano a 1.500 células /poço e cultivadas durante 24 horas em meio contendo 2% de FBS. Em seguida, as células foram tratadas com CysLT

antagonistas 1R para diferentes pontos de tempo. Após incubação com 10 ul de reagente WST-1, durante 90 minutos, a absorção das amostras foi medida a 440 nm utilizando o leitor de placas Tecan Infinito M200.

Citometria de Fluxo

ciclo celular e celular medições de morte foram avaliados por citometria de fluxo. Em resumo, as células HCT-116 foram tratadas durante a noite e com CysLT

1R antagonistas em meio fresco contendo 2% de FBS privadas de soro. Após 24 h, as células aderentes e flutuantes foram recolhidas e lavadas com PBS. Para os perfis do ciclo celular, as células foram imediatamente fixados em 70% (v /v) de etanol, tratou-se com citrato de sódio a 0,1% e 100 ug /ml de RNase A, e incubados durante 30 min a 37 ° C, com /mL de iodeto de propídio 50 ug. A indução de apoptose foi determinada em células viáveis ​​usando o V-PE Apoptosis Detection Kit Anexina de acordo com o protocolo do fabricante. Todas as medições de citometria de fluxo foram realizadas utilizando o fluxo FACS Calibur citômetro (Becton Dickinson, San Jose, CA), e as análises foram realizadas utilizando FCS Express, versão 4.0 (De Novo Software).

Ensaio de aderência de

HCT-116 células foram suspensas em meio contendo 2% de FBS a uma densidade de 2,0 x 10

5 células /ml e tratadas com ou sem CysLT

1R antagonistas durante 30 min a 37 ° C antes do plaqueamento em plano -bottomed placas de 12 poços (Corning, 1 ml /poço). As células foram incubadas a 37 ° C em 5% de CO

2 durante 1 h, seguido de três lavagens com PBS para remover células não ligadas. Após fixação em formaldeído a 4% durante 15 min, as células foram lavadas duas vezes com PBS e coradas com violeta de cristal (5 mg /ml em etanol a 2%) durante 10 min à temperatura ambiente. Em seguida, as células foram lavadas exaustivamente, e foi libertado coloração utilizando SDS a 2% em PBS. A intensidade da coloração foi quantificada por espectrofotometria a 550 nm utilizando o leitor de placas Tecan Infinito M200.

agar mole Ensaio

células HCT-116 foram cultivadas em meio contendo 2% de FBS com ou sem CysLT

1R antagonistas. Em resumo, 1 mL de 0,5% bem (camada inferior de agar) /foi adicionado em placas de 6 poços e deixou-se solidificar durante pelo menos 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, 1,0 × 10

4 células foram suspensas em 1 ml de meio com 0,35% de agarose (camada superior). Diferentes doses de CysLT

1R antagonistas foram adicionados ao agarose (a camada superior) e agar (camada de fundo), antes de serem colocadas nos poços. Um adicional de 2 ml de meio de cultura contendo o CysLT

1R antagonistas foram colocados por cima da camada superior. O meio foi trocado a cada 3 dias com ou sem a adição de CysLT

antagonistas 1R. Após 14 dias de incubação a 37 ° C, as colónias foram visualizadas por coloração com violeta de cristal de 0,005%. As imagens foram adquiridas usando o ChemiDoc ™ XRS + Sistema e as colónias foram contadas usando software ImageJ.

leucotrieno cisteínico de ensaio imunoenzimático

As células foram cultivadas durante 5 dias a 70-80% de confluência. No dia 4, o meio foi mudado e recolhidos no dia 5 de separação cisteinil leucotrienos por extração em fase sólida Sep-Pak Vac RC (C18-500 mg) cartuchos de Água Corporation (Milford, MA). produção cisteinil leucotrienos foi medida com um ensaio imunoenzimático de acordo com as instruções do fabricante.

Análise Estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas em Prism Software (GraphPad, Inc.), e a significância estatística dos dados foi determinado como

P Art 0,05. Para comparação entre dois grupos, ou um

t

pareado ou não pareado (Student

t

teste) foi utilizado. One-way ou two-way ANOVA foi utilizada para comparar vários grupos. Todos os valores são expressos como a média ± erro padrão da média (SEM).

Resultados

CysLT

1R Antagonistas Diminuir xenoenxerto de tumor Crescimento

A xenotransplante do cancro do cólon modelo foi utilizado para investigar os efeitos da CysLT

antagonistas 1R sobre o crescimento do câncer

in vivo

. Para examinar os efeitos de CysLT

1R antagonistas na iniciação do tumor, nós inoculados camundongos nu com HCT-116 células pré-tratadas com CysLT

1R antagonistas. O tratamento foi iniciado imediatamente com qualquer ZM198,615 ou Montelukast (5 mg /kg /dia) no dia da inoculação. Os ratinhos foram sacrificados no dia 21, antes de os volumes dos tumores atingiu 1 cm

3, de acordo com a permissão ético (Figura 1A). Como mostrado na Figura 1B, a ocorrência do tumor foi um atraso significativo no grupo de pré-ZM (4 tumores) em comparação com o grupo I DMSO (12 tumores) no dia 6. Além disso, o montelucaste de pré-tratamento inibiu completamente a geração HCT-116 tumor. O peso médio do tumor foi significativamente reduzida no grupo de pré-ZM em comparação com o grupo I de DMSO (0,165 ± 0,048 g

vs

0,372 ± 0,082 g;. A Figura 1C).

Além disso, foram examinados os efeitos de CysLT

antagonistas 1R na progressão tumoral através da inoculação de ratinhos nus com células sem pré-tratamento HCT-116. Após iniciação do tumor de gravação (no dia 6), CysLT

1R tratamentos antagonistas foram realizadas durante 2 semanas (Figura 1E). No dia 21, o tamanho médio do tumor dos grupos ZM198,615 e montelucaste não foi significativamente menor do que os tumores no grupo DMSO II (490,1 ± 66,21 milímetros

3 e 336,9 ± 55,38 milímetros

3

vs

711,6 ± 82,6 milímetros

3,

P Art 0,05 ou

P Art 0,001, respectivamente) (Figura 1F). Da mesma forma, o peso médio do tumor nos grupos ZM198,615 e Montelucaste DMSO versus o grupo II foi significativamente reduzida (Figura 1G;. 0,31 ± 0,037 g e 0,22 ± 0,036 g

vs

0,424 ± 0,038 g, respectivamente,

P Art 0,05). A Figura 1D e H são imagens representativas recolhidas do tumor de cada grupo. Em conclusão, estes resultados suportam a hipótese de que CysLT

1R é importante para o crescimento do câncer de cólon.

CysLT

1R Antagonistas reduzir a proliferação e induz a apoptose

próxima investigados os mecanismos subjacentes pelo qual sub CysLT

1R antagonistas exercida seus efeitos inibitórios sobre o crescimento do tumor. secções de tumor HCT-116 foram coradas com o marcador de proliferação Ki-67 ou o marcador de apoptose M30 CytoDeath. O mais prevalente Ki-67 área manchada foi selecionado para cada tumor xenoenxerto e três imagens de alta campo de energia dentro desta área foram ainda analisados. O nível de Ki-67 nestas áreas selecionadas estavam moderadamente diminuídas no grupo pré-ZM (Pre-ZM

vs

DMSO I grupo;. Figura 2A e B) e estatisticamente significativa (

P

0,05) diminuiu nos grupos de tratamento (ZM198,615

vs

DMSO grupo II;. a Figura 2C e D). número de celular por apoptose aumentou ligeiramente em tumores do grupo Pré-ZM (Pre-ZM

vs

DMSO I grupo;. Figura 2E e F) e os grupos de tratamento (ZM198,615 ou montelucaste

vs

DMSO grupo II;. Figura 2G e H)

(A e C) imagens representativas Ki-67-manchados de secções de parafina de tumores de xenoenxerto (× 400). (B e D) Uma Ki-67-coradas ponto quente foi seleccionado a partir de cada tumor e 3 domínios distintos dentro destes pontos quentes foram analisados ​​pelo campo de alta potência (400 ×). Ki-67 fração de área positiva foi determinada como relação entre a área manchada ao total de área de campo de alta potência. (E e G) representativos M30 imagens CytoDeath-manchados de secções de parafina de tumores de xenoenxerto (× 200). preto e branco setas indicam células marcadas positivamente. regiões enquadradas dentro dos painéis principais mostra as células coradas positivamente indicadas pelas setas brancas com maior ampliação (400x). (F e H) Número de celular por apoptose médio por campo foi determinado por contagem positivos M30- (setas pretas) em secções de tumor xenoenxerto de tamanho mediano-tiradas da parte do meio. Os dados quantitativos apresentados são a média ± SEM. *

P

. 0,05 por

t

Student

Os efeitos da CysLT

1R antagonistas sobre a vascularização do tumor foram estudados através da coloração para CD31 , um antigénio específico da célula endotelial. Observou-se uma diminuição do número de vasos ligeiramente nas secções tomadas a partir do grupo pré-ZM em comparação com o grupo I de DMSO (46,1 ± 6,7

vs 56,0 ± 7,9;. A Figura 3A e B). número Vascular não é o único parâmetro para indicar o fornecimento de sangue tumor adequada; área do vaso é também um determinante crítico do fluxo de sangue do tumor [33]. Em secções de tumor do grupo Pré-ZM, percebemos que os vasos apareceu menor e mais fino, e tinha menos ramificações. Os vasos tumorais no grupo DMSO I apareceu mais maduro, com lumens, paredes grossas e forte coloração CD31 ao longo dos seus comprimentos. Nós, portanto, mediu as áreas de coloração CD31-positivo. Como mostrado na Figura 3C, os tumores do grupo pré-ZM198,615 teve um aumento estatisticamente significativo (

P

0,05) diminuiu a área média de CD31-positivo em relação aos tumores do grupo de DMSO I (± 2596 121,4 pixels

vs. 3900 ± 522,3

pixels, respectivamente), o que corresponde a uma redução de 33%. Não houve diferenças estatisticamente significativas no número médio de vasos e tamanho vascular entre os ratinhos nos grupos de tratamento (DMSO II

vs

ZM198,615 ou montelucaste;. Figura 3D, E e F). O tamanho vascular reduzida nas secções tumorais tomadas a partir do grupo pré-ZM indicou que CysLT

1R tratamento com o antagonista durante 21 dias poderia inibir a vascularização do tumor e tem um efeito mais pronunciado sobre a progressão do tumor.

(A e D) Representante CD31 imagens manchadas (× 100). (B e E) densidade de vasos foi determinada com contagem de CD31-positiva em três campos diferentes (hot spots). (C e F) Análise quantitativa das áreas CD31-positivos usando o Adobe Photoshop. Os dados quantitativos apresentados são a média ± SEM. *

P Art 0,05 por Student

t

teste

Em seguida, os níveis de proteínas selecionadas envolvidos no ciclo celular, apoptose e angiogênese de expressão foram. investigada. p21

WAF /Cip1, um potencial inibidor do ciclo celular, foi mostrado para ser significativamente sobre-regulada em amostras de tumor do grupo pré-ZM em comparação com o grupo de DMSO I (

P

0,01; Figura 4A) . Observou-se também moderadamente aumento dos níveis de caspase 3 clivada fragmentos (Figura 4B) e reduziu significativamente os níveis de expressão de VEGF (

P

0,05; Figura 4C) em tumores do grupo pré-ZM comparado com o DMSO I grupo. Análise semelhante foi feita para os grupos de tratamento (ZM198,615 ou montelucaste

vs.

DMSO II). Significativamente aumento dos níveis de p21 expressão

WAF /Cip1 (

P Art 0,01; Figura 3D) e diminuição dos níveis de VEGF expressão (

P Art 0,05; Figura 4D) poderia ser observada para o grupo tratado com montelucaste, mas não para o grupo tratado com ZM198,615 em comparação com o grupo II DMSO. Aumento dos níveis de caspase clivada 3 fragmentos também foram observados nos grupos de tratamento (ZM198,615 ou montelucaste

vs.

DMSO II) (Figura 4E).

amostras de tumor (três ou quatro tumores de cada grupo) foram submetidos a análise de Western blot. As membranas foram sondadas para p21 (A e D)

WAF /Cip1; (B e E) caspase 3; e (C e D) de VEGF. Os dados foram normalizados com base nos níveis de p-actina. A análise densitométrica de expressão de proteínas representa a média ± SEM. *

P Restaurant 0,05, **

P

. 0,01 por

t

Student

CysLT

1R Antagonistas reduzir a proliferação e induzir G

1 detenção do HCT-116 Cells

Porque observamos que CysLT

1R tratamento antagonista pode inibir o crescimento tumoral

in vivo

, em parte, através da indução de parada do ciclo celular , nós próximo interessados ​​para confirmar esta conclusão

in vitro

. Para investigar se a sub CysLT

antagonistas 1R teve qualquer efeito directo sobre a proliferação de células de cancro do cólon, foi realizado o ensaio de proliferação celular WST-1. O tratamento com concentrações crescentes de ZM198,615 causou a inibição da proliferação de células HCT-116 de uma forma dependente da dose. No dia 4, o crescimento de células tratados com 12,5, 25 e 50 uM ZM198,615 foi reduzida em 11%, 31%, e 88% respectivamente, em comparação com células de controlo tratadas com DMSO (Figura 5A). Quando foram usadas as mesmas concentrações de montelucaste, tal como ZM198,615, observou-se um efeito ainda mais forte na inibição do crescimento celular; 35%, 88%, e 100% para 12,5, 25, e 50 uM montelucaste, respectivamente, em comparação com as células de controlo tratadas com DMSO (Figura 5B). A seguir, analisou se o CysLT

1R inibição do crescimento mediada por antagonista da HCT-116 células foi devido à intervenção do ciclo celular. Descobrimos que montelucaste induzida paragem do ciclo celular de células HCT-116 no prazo de 24 horas a G

1 fase. Como mostrado na Figura 5C, painel da direita, 81% e 87% das células tratadas com 25? M e de 12,5 montelucaste, respectivamente, foram em G

1 fase em comparação com 64% das células tratadas com DMSO.