Abstract

Fundo

RNAs Micro são pequenos, não-codificação, RNAs de fita simples que negativamente regular a expressão do gene ao nível pós-transcricional. Uma vez que o miR-143 verificou-se ser sub-regulada em células de cancro da próstata, queríamos para analisar a sua expressão em cancro da próstata humano, e testar a capacidade de miR-43 para parar o crescimento de células de cancro da próstata in vitro e in vivo.

resultados

Expressão de miR-143 foi analisada em cancros da próstata humana por PCR quantitativo, e por hibridização in situ. miR-143 foi introduzido em células de cancro in vivo por electroporação. análise bioinformática e ensaios baseados em luciferase foram usadas para determinar o miR-143 alvos. Mostramos neste estudo que os níveis de miR-143 está inversamente correlacionada com estágios avançados de câncer de próstata. Resgate de expressão de miR-143 em células cancerosas resulta na prisão de proliferação celular e da revogação do crescimento do tumor em ratinhos. Além disso, mostra-se que os efeitos de miR-143 são mediados, pelo menos em parte, pela inibição de 5-quinase actividade extracelular regulada por sinal (ERK5). Mostramos aqui que ERK5 é um alvo miR-143 no cancro da próstata

Conclusões

miR-143 é como um novo alvo para o tratamento de câncer de próstata

Citation:.. CLAPE C, Fritz V, Henriquet C, Apparailly F, Fernandez PL, Iborra F, et al. (2009) miR-143 Interfere com ERK5 Signaling, e revoga o cancro da próstata Progressão em camundongos. PLoS ONE 4 (10): e7542. doi: 10.1371 /journal.pone.0007542

editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de junho de 2009; Aceito: 29 de setembro de 2009; Publicação: 26 de outubro de 2009

Direitos de autor: © 2009 CLAPE et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os financiadores não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Agence Nationale pour la Recherche (ANR physio2006), Institut National Cancer du (INCA) Association pour la Recherche contre le Cancer (ARC) e Fondation pour la Recherche Medicale (FRM). CC é apoiado por uma bolsa da Região Languedoc-Roussillon, e ARC. PLF é suportada pelo Ministerio de Ciencia e Innovacion FIS-PI080274

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de próstata (CAP) é o câncer mais frequente e a segunda principal causa de morte por câncer em homens nos países ocidentais. receptor de andrógeno (AR) é provável um fator crucial para a progressão do câncer de próstata. O cancro da próstata é inicialmente dependente de androgénios para o crescimento, e a terapêutica hormonal de ablação provoca a regressão do tumor [1], provavelmente através da inactivação da transcrição dos genes alvo AR. No entanto, a resposta a esta terapia é muitas vezes transitória e muitos homens desenvolver cancro da próstata independente de androgénios recorrente, que tem um prognóstico muito pobre, porque nenhum tratamento eficaz está disponível (ver [2] para revisão).

Recentemente, uma nova classe de pequenos RNAs foi descrito, denominado microARNs, que são encontrados para regular a função do ARNm através da modulação tanto a estabilidade do ARNm e a tradução [3], [4]. MiRNAs são pequenas não-codificante, ARN, de cadeia simples de ± 22 nucleótidos que regulam negativamente a expressão do gene ao nível pós-transcricional, principalmente por meio de emparelhamento de bases de região 3 ‘não traduzida (UTR) de mRNAs alvo. Existem evidências crescentes de que indica miARNs controlar as funções celulares básicas, que vão desde a proliferação de apoptose [5], [6], [7]. Cerca de 50% dos genes de miARN estão localizados em regiões genómicas ou associados ao cancro em locais frágeis [8] e alguns deles têm sido mostrados para ser directamente envolvido no desenvolvimento e progressão do cancro [9]. perfis de expressão microRNA também classificar os tumores de linhagem desenvolvimento e estado de diferenciação [10]. Várias microARNs têm sido mostrados como tendo propriedades oncogénicas ou agir como genes supressores de tumor [9], [11]. Este é o caso para o miR-15A e miR-16-1, cuja expressão é perdido no cancro da próstata avançado. Estes dois miARNs mostram actividade anti-oncogénica através de direccionamento de ciclina D1 e Wnt3a, que são mediadores da proliferação de células cancerosas e sobrevivência [12]. Diminuição da expressão de outros miRNAs, como miR-23b, -100, -145, -221 e -222 também foi documentada. Além disso, a expressão ectópica destes miARNs resulta na inibição de células do cancro da próstata [13]. Contrariamente a estes miARN anti-oncogénicas, oncogénica miR-106b ou miR-32 foram identificadas no cancro da próstata. Estes proliferação de células de suporte miARN e sobrevivência de células cancerosas gamela segmentação de p21 /WAF1 e proteínas Bim, respectivamente [14]. Mais interessante é a observação de que alguns miARN, tais como o miR-141 são secretadas pelas células cancerosas, e são encontradas no soro dos pacientes com cancro da próstata. Estes resultados estabelecem a medição de miARNs derivadas de tumores em soro ou plasma como uma ferramenta de diagnóstico para um novo método não-invasivo de detecção de cancro humano [15].

Nós mostramos anteriormente que um tratamento de combinação usando PPARy agonistas e inibidores de HDAC resulta na inibição do crescimento de células de cancro da próstata em ratos [16]. análise global da expressão do RNA micro nestas células tratadas correlacionados aumentou miR-143 com a paragem do crescimento. No presente estudo, foi investigada a expressão de miR-143 no cancro da próstata e descobriram que o nível de expressão de miR-143 foi significativamente diminuída. Além disso, o nível de expressão foi inversamente correlacionado com o grau histopatológico no câncer de próstata humano. A transfecção de células LNCaP e C4-2 in vitro com o precursor de miR-143, ou a electroporação de miR-143 em xenoenxertos de cancro da próstata em ratos demonstraram que o miR-143 contribui negativamente para o crescimento de células de cancro da próstata. Finalmente, análises de bioinformática ERK5 identificado como um potencial gene alvo para miR-143. ERK5 é conhecido por promover o crescimento celular e proliferação em resposta a factores de crescimento e activação da tirosina-quinase. Portanto, persistente diminuição dos níveis de miR-143 em células cancerosas podem estar directamente envolvidos na carcinogénese através da activação da cascata de proteína-quinase activada por mitogénio (MAPK) por meio de ERK5. Em conjunto, estes resultados sugerem que a mir-143 poderia ser um supressor de tumor e um potencial novo marcador diagnóstico ou prognóstico no câncer de próstata.

Resultados

miR-143 expressão é diminuída durante a progressão do câncer de próstata

a primeira indicação da participação de miR-143 no cancro da próstata foi observado diminuição da expressão desse miRNA em LNCaP, e câncer de próstata C4-2, em comparação com linhagens de células epiteliais normais, como analisado por RT-PCR quantitativo (Fig. 1A). Consistente com esta observação, a expressão de miR-143 foi fortemente diminuída no cancro da próstata humano, em comparação com os tecidos normais da próstata (Fig. 1B). Além disso, os níveis de transcritos de miR-143 estavam inversamente correlacionados com o grau histopatológico no cancro da próstata humana, atingir o limite de detecção em cancros de grau elevado (Gleason 7; A Fig. 1B). Para analisar mais precisamente a expressão de miR-143,

in situ

hibridação foi realizada em arrays de tecido de alta densidade, contendo 40 tecidos de cancro da próstata versus 10 tecidos da próstata normais. miR-143 de expressão não pôde ser detectado especificamente em células de cancro da próstata de alto valor de Gleason, ao passo que o miR-143 foi expressa no epitélio da próstata normal, e glândulas da próstata (Fig. 1C). Estes resultados sugerem que a regulação negativa da expressão de miR-143 poderia ser um evento obrigatório para o desenvolvimento ou progressão do câncer.

A

, Quantitative PCR em tempo real (qPCR) de miR-143, normalizados para a quantidade de alvo RNU48 em linhas celulares de cancro da próstata. Os níveis relativos de expressão de miARN foram medidas através da determinação dos valores ΔCt da linha celular indicada contra células PNT2. Os dados são médias ± SEM para três experiências independentes. significância estatística, aqui e nas figuras subsequentes, * 0,05; ** 0,01; *** 0,001.

B

, QPCR de miR-143, normalizada para a quantidade de alvo RNU48 em amostras de tecido da próstata. Os níveis relativos de expressão de miARN foram medidas através da determinação dos valores ΔCt do cancro da próstata Gleason indicado contra próstata normal. Os dados são médias ± SEM de onze amostras de próstata para cada grupo.

C

, Representante

in situ

coloração hibridização de miR-143 em não-tumorais humanas e tecido da próstata tumor. TMA apresenta 40 tecidos de cancro da próstata vs. 10 tecidos prostáticos normais. (TMA, ampliação, 400 ×).

proliferação diminuída e aumento da apoptose em miR-143 expressando células cancerosas da próstata

diminuição da expressão no câncer de próstata sugeriram que miR-143 pode ter efeitos anti-proliferativa. Para testar esta hipótese de miR-143 foi ectopicamente expressa em linhas celulares de cancro da próstata LNCaP e C4-2. miR-143 foi expressa 5- e 12-vezes mais elevada em LNCaP transfectadas e células C4-2, respectivamente, em comparação com células de controlo transfectadas com miARN não relevante, ou com anti-miR-143, que é um inibidor de miR-143 (Fig. 2A). Não foram observadas diferenças no número de células quando não relevante miARN ou anti-miR-143 foram usadas nestas células. Em nítido contraste, o número de células foi inversamente correlacionado com os níveis de expressão de miR-143 em ambos LNCaP, e linhas de células C4-2 (Fig. 2B-C). Isto sugeriu que o miR-143 regula negativamente a proliferação celular. Consistente com isto, experiências de incorporação de BrdU demonstrou que a expressão de miARN resulta na inibição da síntese do ADN, e, por conseguinte, a revogação de proliferação celular nestas linhas celulares de cancro (FIG 2D). Curiosamente, estes efeitos citostáticos também foram correlacionados com aumento da morte celular no miARN expressando células de cancro da próstata, tal como avaliado por ensaios de azul tripano (Fig. 2E). Além disso, a análise do ciclo celular mostraram um aumento na L

0-L

uma população, concomitante a um decréscimo na fase S em miR-143 expressando células (Fig. 2F). Curiosamente, a análise por FACS indicou um aumento na morte celular (Fig. 2G). A apoptose foi, no entanto, não mudou em miR-143, em comparação com células de controlo tal como avaliado por ensaios de incorporação annexine (dados não mostrados), ou por nível de caspase 3 48 h após transfecção (Fig. 2H). Isto sugeriu que a morte celular observada não está dependente de apoptose, necrose, mas sim eventos. Em conjunto, esses dados sugerem que miR-143 controla negativamente a proliferação celular e controla de forma positiva a morte celular das células cancerosas da próstata.

A

, QPCR de miR-143 em células C4-2 (barras brancas ) e células LNCaP (barras pretas), normalizados para RNU48 48 h após a transfecção com miR mexidos (controle), miR-143 precursor ou antimiR-143. Os dados são médias ± D.P. para cinco experiências independentes.

B-C

, o crescimento celular em LNCaP (B) ou C4-2 (C) células durante 48 h após transfecção com miR mexidos (losango preto), miR-143 precursor (cruz preta) ou antimiR-143 (triângulo branco). Os dados são médias ± SEM para três experiências independentes.

D

, Quantificação da incorporação de BrdU 48 h após a transfecção em células C4-2 e LNCaP na ausência de miR-143 (em cima), na presença de miR-143 (meio) ou antimiR-143 (inferior). Os dados são representativos de três experiências independentes.

E

, células com azul de tripano incorporação em C4-2 (barras brancas) e LNCaP (barras pretas) 48 h após a transfecção na ausência ou na presença de miR-143 ou na presença de antimiR-143.

F

, porcentagem de células em diferentes fases do ciclo celular em LNCaP e C4-2 linhas de células 36 horas após a transfecção com controle 5 (não relevante), miR-143 ou antimiR-143. Foram obtidos resultados semelhantes em duas experiências independentes. Os resultados são expressos como média ± EPM (n = 2-4).

L

, análise FACS da apoptose em C4-2 (barras brancas) e células LNCaP (barras pretas), as células 48 h após a transfecção na ausência ou na presença de miR-143 ou na presença de antimiR-143.

H

, Relativa activa concentração da caspase 3 em C4-2 (barras brancas) e LNCaP (barras pretas), as células 48 h após a transfecção na ausência ou na presença de miR-143 ou na presença de antimiR-143. A concentração de caspases ativo 3 é normalizado com a concentração de proteína global.

ERK5 é um miR-143 gene alvo

Queríamos identificar miR-143 alvos que poderiam ser implicados em a progressão do câncer de próstata. análise bioinformática indicaram que o 3 ‘UTR do gene ERK-5 humana abriga um putativo local de consenso para a ligação de miR-143 (nucleótidos 2917-2932) (Fig 3A). Para validar experimentalmente este objectivo, foram analisados ​​primeira expressão ERK5 em linhas celulares de cancro da próstata. ERK5 proteína foi altamente aumentado em LNCaP, células cancerosas e C4-2 próstata, em comparação com PNT2 células epiteliais prostáticas não cancerosos (Fig. 3B). Curiosamente, a expressão ERK5 foi inversamente correlacionada com a expressão de miR-143 nestas linhas celulares (Fig. 1A). Uma análise mais aprofundada no cancro da próstata humana em matrizes de tecidos de alta densidade mostraram que a expressão ERK5, tal como analisada por IHC foi altamente aumentada no cancro, em comparação com o tecido normal da próstata (Fig 3C, painéis inferiores). Surpreendentemente, a expressão ERK5 foi inversamente correlacionada com a expressão de miR-143, tal como analisada por hibridação in situ, o que sugere que poderia ser um ERK5

fidedigno

miR-143-alvo (Fig. 3C, comparar superior a painéis inferiores). Para provar esta hipótese foram realizados experimentos superexpressão. A expressão ectópica de miR-143 em LNCaP, e linhas celulares de cancro da próstata C4-2 resultou numa diminuição significativa na expressão da proteína ERK5, em comparação com células transfectadas com miARN não relevante, ou com o anti-sentido de miR-143. (Fig. 3D). Redução da expressão ERK5 correlacionada com a proliferação diminuída nestas linhas celulares após expressão de miR-143 (Fig. 2). Além disso, diminuiu ERK 5 expressão em miR-143 células tratadas também se correlacionou com a diminuição da expressão de junho, que é um alvo conhecido ERK5 (Fig. 3E).

Um

, a representação esquemática do previu local alvo de miR-143 na 3 ‘UTR do mRNA ERK5. sequência de semente de correspondência é indicado. H.s ERK5 3’UTR é o Homo Sapiens 3’UTRsequence.

B

, análise de Western blot de expressão ERK5 endógena em linhas de células normais e cancerosas da próstata. As expressões relativas, normalizadas para GAPDH, foram medidos por um software Image J. como uma prega de a situação indicada contra miR mexidos. Os dados são médias ± SEM para três experiências independentes. C, coloração imuno-histoquímica representativas de ERK5, e hibridação in situ de miR-143 em secções consecutivas da matriz de tecido de alta densidade.

D

, análise de Western blot de expressão ERK5 endógena em células C4-2 e LNCaP 48 h após transfecção transitória do indicado miR-143. A expressão relativa, quantificado por software Imagem J é normalizado para GAPDH, e medido por vezes da situação indicada contra miR mexidos. Os dados são médias ± SEM para três experiências independentes.

E

, a medida da actividade da luciferase em células COS transfectadas com um gene de luciferase pGL3 repórter fundido com a ERK-5 UTR 3 ‘não mutado ou com concentrações crescentes ou miR-143 (0; 25; 50; 100 nM). Os valores estão normalizados para actividade beta-galactosidase e expressas em vezes em relação ausência de miR-143. barras pretas, ERK5 3’UTR, barras brancas, mutante 3 ‘UTR; dados são médias ± SEM para quatro experiências realizadas em triplicado.

F

, a análise Western blot da expressão de c-Jun endógena em células LNCaP de 48 h após a transfecção transitória do indicado miR-143. Os dados são representativos de três experiências independentes.

L

, QPCR de ERK5 em células C4-2 (barras brancas) e células LNCaP (barras pretas), normalizadas para 18 s do gene 48 h após a transfecção com pSUPER-shNeo (controlo) ou pSUPER-shERK5. Os dados são médias ± SEM para três experiências independentes.

H

, Quantificação da incorporação de BrdU nas células C4-2 (barras brancas) e células LNCaP (barras pretas) 48 após a transfecção com pSUPER-shNeo (controlo) ou pSUPER-shERK5. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Em seguida, para demonstrar ainda mais a hipótese de que os efeitos observados na proliferação são o resultado da inibição ERK5, foram realizadas experiências de silenciamento. shRNA expressão dirigida para ERK5 resultou numa diminuição significativa na proliferação das células LNCaP e em C4-2, em comparação com células transfectadas com não relevante shRNA (Fig. 3F). ERK5 nível de expressão foi reduzido cerca de 90% em ambas as linhas celulares transfectadas com o específico shERK5 (Fig. 3G).

Finalmente, para provar ainda que ERK5 é um miR-143 do gene alvo experiências de transfecção transiente foram realizadas utilizando o região 3’UTR de ERK5 contendo o local putativo de harmonização de miR-143, mutado ou não, a jusante da grelha de leitura aberta de luciferase. A actividade da luciferase do construto UTR 3 ‘de ERK-Luc foi diminuída na presença de miR-143, enquanto que a actividade da luciferase de construção -Luc mutado não foi afectada, o que sugere que o miR-143 modular a expressão de ERK5 através da ligação a ERK5-3’UTR ( Figura 3F).

salvamento da expressão de miR-143 diminui a progressão do tumor em ratinhos

Para investigar o efeito de miR-143 no crescimento do tumor, os ratinhos nus atímicos foram enxertados subcutaneamente com cancro da próstata LNCaP e células C4-2. Duas semanas após a inoculação das células, quando os tumores atingiram um volume médio de 392 mm

Foram realizadas 3, miR-143 experimentos de resgate. injecção intratumoral de miR-143, seguido por electroporação, como descrito na secção de materiais e métodos resultaram na anulação ou diminuição do crescimento do tumor em ratinhos enxertados com células LNCaP e C4-2, respectivamente (Fig. 4A e 4B), enquanto que a electroporação de controlo não -relevant miR não teve efeito sobre o crescimento do tumor (Fig. 4A e 4B). Apesar de o miR-143 degradação rápida in vivo esperada, expressão de miR-143 permaneceram significativamente aumentada em miR-143 electroporadas tumores (Fig. 4C). Consistente com o decréscimo observado no crescimento do tumor, a razão de proliferação de tumores LNCaP e C4-2 também foi diminuída, tal como quantificado por coloração com PCNA em tumores electroporadas com miR-143 (Fig. 4D). Finalmente, a análise do nível de proteína ERK5 por imuno-histoquímica que a expressão indicada ERK5 foi diminuída em presença de miR-143, em tumores LNCaP e C4-2 (Fig. 4E). Tomados em conjunto, estes resultados provam que o miR-143 funciona como um supressor de tumor em células de cancro da próstata.

A-B

, crescimento de tumores de LNCaP (A) ou C4-2 células (B) injectado por via subcutânea e electroporado três vezes com não relevante miR (controle, branco quadrado) ou miR-143 precursor (losango preto). Os dados são médias ± SEM para sete ratinhos analisados ​​por cada grupo.

C

, QPCR análise de miR-143 expressão em C4-2 (barras brancas) e xenoenxertos de LNCaP (barras pretas), normalizado para RNU48. Os dados são médias ± SEM para sete ratinhos analisados ​​por cada grupo.

D

, Análise de proliferação celular por coloração com PCNA em secções de xenoenxertos de ratinhos nus atimicos injectados subcutaneamente com C4-2 (barras brancas) ou LNCaP (barras pretas) células após três electroporações com miR mexidos ou miR-143 precursor . Os dados são médias ± SEM para sete ratinhos analisados ​​por cada grupo.

E

, coloração imuno Representante da ERK5 em tumores C4-2 e LNCaP. ratinhos nus injectados subcutaneamente com C4-2 (barras brancas) ou LNCaP (barras pretas) células após três electroporações com miR mexidos ou miR-143 precursor. Os dados são representativos de sete ratos analisados ​​por cada grupo. (Ampliação, 400 ×).

Discussão

Analisamos a expressão e os efeitos de miR-143 no desenvolvimento e progressão do câncer de próstata. Alguns estudos têm mostrado previamente que o miR-143 poderia desempenhar um papel na tumorigénese uma vez que a sua expressão é diminuída em vários cancros [19]. Relatamos dois resultados principais deste estudo. Primeiro, mostramos que a expressão de miR-143 é claramente regulada negativamente durante a progressão do câncer de próstata. estratégias de triagem têm resultou na detecção de cancro da próstata em estádios anteriores progressivamente e níveis mais baixos de prognóstico risco [20]. Em muitos homens, o câncer de próstata tem uma longa história natural, enquanto outros vão avançar para o estágio metastático e morrer de sua doença (revisto em [21]). Apesar do valor aceite de medir os níveis próstata-specifc antígeno (PSA) para o rastreio de diagnóstico de câncer de próstata, o seu valor como um marcador de prognóstico ainda é uma questão de debate. Outros parâmetros relacionados ao tumor, incluindo o estadiamento clínico utilizando o sistema TNM, Gleason score biópsia e nível sérico pré-tratamento antigénio específico da próstata (PSA) são actualmente utilizados para classificar os pacientes como sendo de baixo, médio ou alto risco para desenvolvimento de câncer agressivo [22] – [24]. Nenhuma análise individual é capaz, no entanto identificar adequadamente todos os pacientes com câncer de próstata localizado que têm uma alta probabilidade de progressão após terapêutica. Nossa descoberta de que o miR-143 está no limite de detecção do câncer de próstata agressivo poderia ajudar a identificar tais pacientes. Consistente com nossa expressão descobertas de miR-143 foi encontrado para ser reduzida também em outros tipos de câncer, como câncer de cólon [25], malignidades de células B [26], cancro da próstata [27], tumores hipofisários [28], ou cervical cancro [29]. Este sub-regulação de miR-143 em amostras de cancro da próstata tem sido sugerido para reflectir o estágio de diferenciação inferior do tecido de tumor em relação ao tecido normal [30]. Outros estudos prospectivos para validar miR-143 como um alvo preditivos de progressão do câncer de próstata são garantidos.

O segundo grande achado do nosso estudo é a constatação de que o resgate de miR-143 expressão em células de câncer de próstata resultados na revogação de crescimento de células de cancro, quer in vitro e em ratinhos. Mostrámos, pela primeira vez que o miR-143 é um supressor de tumor em ratinhos. Outros estudos têm apontado para um papel supressor de tumor de miR-143 em dois pontos, e outras células cancerosas [26], em particular através da inibição do KRAS e proteínas ERK5 [26], [31]. Tem sido demonstrado que ERK5 pode ser um alvo directo ou indirecto de miR-143 [32]. Mostramos que temos agora e fornecer provas suficientes para demonstrar que ERK5 é um alvo direto de miR-143 no câncer de próstata. Isto é suportado pela presença do sítio de ligação de miR-143 na 3’UTR do ARNm ERK5. Além disso, o miR-143 inibe a expressão de uma proteína repórter, quando este local de ligação do substitui a 3 ‘UTR do mRNA da luciferase. Finalmente, a expressão da proteína ERK5 é inversamente correlacionada com a expressão de miR-143 em cancros da próstata humanos. ERK5 tem sido implicada na regulação da proliferação celular, e é o MAPKK mais recentemente identificado [33]. As actividades dos vários factores de transcrição, principalmente implicados no cancro têm sido mostrados para ser regulada por ERK5, incluindo MEF2, c-Fos e Fra1, Sap-1, c-Myc e NF-kappaB [34] – [37]. Consistente com nossa superexpressão resultados ERK5 está associado com o cancro da próstata metastático e induz a proliferação, invasão e motilidade em células de cancro da próstata [38].

Em resumo, têm mostrado que o miR-143 é um supressor tumoral no cancro da próstata miARN , que controla a proliferação e sobrevivência celular através da modulação de, pelo menos, em parte ERK5 expressão. Resgate de expressão miRNA em tumores de próstata deve ser, portanto, considerada como um novo alvo para o tratamento do câncer de próstata.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Todas as amostras humanas foram comprados. Nossos provedores Biochain (Hayward, CA), Cytomix (Lexington, MA) tem as permissões necessárias.

Amostras clínicas

Trinta e sete (13 normais e 24 RNAs não-pareadas de tumores de diferentes doentes ) e um emparelhado tumor da próstata e as suas vizinhas ARN dos tecidos não afectados foram obtidos a partir de Biochain (Hayward, CA), Cytomix (Lexington, MA).

Animais., e em electroporação in vivo

atímicos macho os ratinhos nus (Foxn1 nu /nu) (Harlan, Grannat, França) foram utilizados com a idade de 7 semanas. Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com a Convenção Europeia para a Protecção dos Animais Vertebrados Utilizados para Experimentação e aprovados pelo Comité d’Ethique du IRCM de Montpellier, que é a comissão de ética local. Os xenoenxertos foram estabelecidas por injecção subcutânea de 2 x 10

6 LNCaP ou C4-2 células em 100 ul de uma solução de Matrigel. medições de volume de tumor foram realizadas a cada dois dias, pouco antes eletroporação. Na eutanásia, os tumores foram extirpados e quer congelados, para a extração de RNA ou fixo em formalina 4% para análise imuno. Para electrotransferência intra-xenoenxerto, os ratinhos foram anestesiados por injecção intraperitoneal de uma mistura de cetamina (30 mg /kg) e xilazina (/10 mg kg) de solução. 500pmole de miR-143 percursor ou mexidos miR foram injectados em 100 uL de PBS para o xenoenxerto. Antes de injecções, gel de ecográfico foi aplicado, impulsos eléctricos transcutâneos foram aplicadas utilizando-se dois eléctrodos de aço inoxidável placa feitos por medida colocados em ambos os lados do xenoenxerto, como descrito anteriormente (Takei et ai., 2008). Resumidamente, 8 onda quadrada pulsos elétricos de 50 comprimento ms e uma tensão de 100 V /cm de saída foram gerados por um electropulsator ECM-830 (BTX, San Diego, CA, EUA).

cultura celular e transfecções

A linha de células epiteliais da próstata PNT2 foi obtido a partir de ECACC (Sigma-Aldrich, Lyon, França). O LNCaP sensíveis ao androgénio e as linhas celulares independentes de androgénios C4-2 humanas de carcinoma da próstata foram compradas a partir de ViroMed Laboratories (Minnetonka, MN). Estas linhas de células foram mantidas como descrito anteriormente [16]. As transfecções com o miR-143 precursor, anti-miR 143 (HSA-miR-143, Ambion) foram realizados a uma concentração de 50 nM com Dharmafect 2 (Dharmacon, Lafayette, CO). O controlo é um precursor de miR não-relevantes, a qual irá ser amadurecido de uma forma estável pela maquinaria de RNAi. O anti-miR-143 é capaz de inibir o miR-143 presente em células por hibridação. Para transfecções knockdown ERK5 nível de proteína foram realizadas com 2 ug de plasmídeo pSUPER-shERK5 ou com um controlo negativo, com pSUPER-shNeo JetPEI transfectante. Após 48 h, as células foram tratadas com BrdU e depois fixadas com paraformaldeído a 4% para posterior análise.

isolamento de ARN, transcrição reversa e quantitativa PCR em tempo real

experiências

O ARN total e foram realizadas QPCR como [17] .As sequências oligonucleotídicas descritas utilizadas para várias experiências neste manuscrito estão disponíveis mediante solicitação.

Quantitative PCR em tempo real para madura microRNA

cDNA foi reverso transcrito a partir de 10 ng do total as amostras de ARN utilizando iniciadores específicos de Taq Man microARN ensaios e reagentes do kit de transcrição reversa microRNA Taq Man (Applied Biosystems). O ADNc resultante foi amplificado por PCR utilizando iniciadores de Taq Man MicroRNA de ensaio com Taq Man universal de PCR Master Mix e analisados ​​com as instruções de um Detector de 7300 Sistema de ABI PRISM Sequência de fabrico de acordo com (Applied Biosystems). Usando o método comparativo TC, foi utilizada controle endógeno (RNU48) para normalizar os níveis de expressão de miARN. Os nomes de ensaio para miR-143 e U48 foram os seguintes:. HSA-mir-143 para miR-143 e RNU48 para U48 RNA

previsão alvo MicroRNA

Nós usamos Metas miRBase (http: //microrna.sanger.ac.uk/targets/v5/) e TargetScan (https://www.targetscan.org/) para a previsão alvo microRNA.

miR repórter da luciferase Ensaios

a 3’UTR 3 ‘UTR ou mutante de ERK5 foram clonados no local XbaI do vector pGL3-Controlo, imediatamente a jusante do codão de paragem da sequência de codificação da luciferase. As células COS foram co-transfectadas com 0,5 ug de vectores baseados em pGL3 e diferentes concentrações de miR-143 precursor, tal como indicado, utilizando Lipofectamine 2000. As medições de actividade de luciferase foi normalizada para a actividade β-galactosidase para corrigir as diferenças na eficiência de transfecção.

Imunotransferência

extracção de proteína, e análises de western blot foram realizados como previamente descrito [18]. Os filtros foram incubados durante a noite a 4 ° C com anticorpo de coelho anti-ERK5 (Cell Signaling Tecnologia, Danvers, MA) e, em seguida, durante 1 h à temperatura ambiente com um anticorpo secundário anti-coelho peroxidase-conjugada. O complexo foi visualizado com quimioluminescência aumentada (Interchim, Montluçon, França).

imunohistoquímica do ERK5

disposições do tecido (TMA) ACCUMAX Array contendo 7 normal e 39 pontos de adenocarcinoma de diferentes pacientes foram obtidos a partir Alphelys (Plaisir, França). Para coloração imuno-histoquímica, TMA foram esgotadas de parafina com xileno, re-hidratados e fervidos (95 ° C, 30 minutos) em tampão de citrato de sódio 0,01 M. Após o bloqueio dos receptores de Fc com PBS contendo 5% de soro de cabra, as secções foram incubadas com anticorpo policlonal de coelho anti-ERK5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante a noite a 4 ° C. A imunocoloração foi revelada utilizando conjugado com peroxidase anti-coelho ou de anticorpo secundário anti-ratinho (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) e diaminobenzidina cromogénio (Dako, Carpinteria, CA) como substrato. As secções foram contrastadas com hematoxilina (Vector, Burlingame, CA). solução de montagem (Dako), e incluem deslizamentos foram adicionados às seções.

BrdU coloração

células

Proliferating C4-2, LNCaP e PNT2 foram incubadas durante 6 h com BrdU. As células cultivadas sobre lamelas foram fixadas com formaldeído a 4% em PBS durante 15 min a 4 ° C e depois lavadas em PBS e permeabilizadas durante 10 minutos em 0,25% de Triton X-100 em PBS. Depois de permeabilização, o DNA foi desnaturado em HCl 2 N durante 10 min, e as células foram incubadas com tampão (PBS-BSA a 1%) de bloqueio. BrdU foi, em seguida, detectados com o anticorpo monoclonal anti-BrdU (Dako, Carpinteria, CA) e visualizadas com um anticorpo secundário anti-ratinho FITC (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA).

A hibridação in situ

sondas modificado com LNA (Exiqon) foram extremidade 3 ‘marcada com digoxigenina-ddUTP com transferase terminal utilizando o kit de marcação de Dig-extremidade 3’ (Roche Diagnostics, França). 5 uM secções-finas foram esgotadas de parafina com xileno e re-hidratadas em uma diluição em série de etanol (2 × 100%, 75%, 50%, 25%). As lâminas foram lavadas com PBS, digeridas com proteinase K (10 ug /ml) durante 5 min a 37 ° C, enxaguadas em 0,2% de glicina /PBS, em seguida, em PBS, e pós-fixados com formaldeído a 10% em PBS (10 min). As lâminas foram então enxaguadas com PBS (2 x). As lâminas foram então pré-hibridados a 54 ° C durante 2 horas em tampão de hibridação (formamida 50%, 5 x SSC, 0,1% de Tween-20, ajustado para pH 6,0 com ácido cítrico 9,2 mM, 50 ug /ml de heparina, 500 ug /ml de ARNt de levedura) . Em seguida, as lâminas foram hibridados durante a noite em câmaras húmidas a 54 ° C num forno com movimento constante, usando 2 ul de sonda de aproximadamente 200 ul de tampão de hibridação pré-aquecida. As secções foram lavadas duas vezes em 2 x SSC, seguindo-se 3 lavagens de 30 min a 54 ° C em formamida a 50% /SSC 2x. As secções foram então lavadas 5 vezes em PBS /0,1% de Tween-20 (PBST), e bloqueados durante 1 h em solução (2% de soro de ovelha, 2 mg /ml de BSA em PBST) de bloqueio. O anticorpo anti-digoxigenina (Roche) foi pré-adsorvido em 1:1000 diluição em solução de bloqueio durante 2 horas e, em seguida, aplicado em secções durante a noite a 4 ° C. Em seguida, as lâminas foram lavadas 3 vezes em PBST e lavou-se 2 vezes em tampão de AP (Tris-HCl 100 pH 9,5, MgCl 50 mM

2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20), seguido de NBT /BCIP desenvolvimento solução (50 ml solução de coloração, 240 ul de 50 mg /ml de NBT, 175 ul de 50 mg /ml de BCIP, Levamisol 1 mM).