Abstract
Amygdalin, um composto natural, tem sido usado por muitos pacientes com câncer como uma abordagem alternativa para tratar a sua doença. No entanto, se esta substância realmente exerce um efeito anti-tumoral nunca foi resolvido. Um estudo in vitro foi iniciado para investigar a influência de amigdalina (1,25-10 mg /mL) no crescimento de um painel de linhas celulares de cancro da bexiga (umuC-3, TCCSUP) e RT112. O crescimento do tumor, proliferação, crescimento clonal e a progressão do ciclo celular foram investigados. O ciclo celular proteínas reguladoras CDK1, CDK2, CDK4, ciclina A, ciclina B, ciclina D1, p19, p27, bem como o alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) sinais relacionados phosphoAkt, foram examinados phosphoRaptor e phosphoRictor. dependentemente da dose Amigdalina reduziu o crescimento e proliferação de todas as linhas celulares de cancro da bexiga de três, que se reflecte num atraso significativo na progressão do ciclo celular e paragem G0 /G1. Análise molecular revelou diminuiu phosphoAkt, phosphoRictor e perda de componentes Cdk e ciclina. Desde foram observados os efeitos mais marcantes da amygdalin no cdk2-ciclina A eixo, siRNA knock down estudos foram realizados, revelando uma correlação positiva entre cdk2 /ciclina A nível de expressão e crescimento do tumor. Amigdalina, por conseguinte, pode bloquear o crescimento do tumor por CDK2-modulação para baixo e ciclina A. Na investigação vivo devem seguir para avaliar o valor prático de amigdalina como uma droga anti-tumoral
citação:. Makarević J, Rutz J, E Juengel , Kaulfuss S, M Reiter, Tsaur I, et al. (2014) Amygdalin Blocos do cancro de bexiga celular Crescimento
In Vitro
diminuindo ciclina A e cdk2. PLoS ONE 9 (8): e105590. doi: 10.1371 /journal.pone.0105590
editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, China
Recebido: 22 de abril de 2014; Aceito: 23 de julho de 2014; Publicação: 19 de agosto de 2014
Direitos de autor: © 2014 Makarevic et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela “Brigitta und Norbert Muth Stiftung” (https://www.muth-stiftung.de) eo “Freunde und der Förderer Goethe -Universität Frankfurt “(https://www2.uni-frankfurt.de). O financiamento foi recebido pelo RAB. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
carcinoma da bexiga é a segunda malignidade mais comum do trato geniturinário em países ocidentais, com uma incidência de 37,9 /100.000 por ano para os homens e 9,6 /100.000 por ano para as mulheres [1]. Aproximadamente 70% dos tumores são diagnosticados inicialmente superficial e pode ser tratada através da ressecção transuretral, em que a bexiga é preservada. Os restantes 30% dos tumores tornam-se músculo invasiva e estão associados com um risco elevado de metástases [2]. Para aqueles pacientes com doença localmente avançado ou metastático, a quimioterapia é uma opção de tratamento. No entanto, o prognóstico de pacientes com metástases continua pobre, com uma sobrevida média de 14 meses e uma taxa de sobrevida em 5 anos de 15% [3].
Mais de 50% dos pacientes com câncer na Europa utilizam complementar /medicina alternativa (CAM), em vez de, ou combinadas com terapia convencional [4]. A insatisfação com o tratamento convencional e redução de efeitos secundários quimioterapêuticos são as razões mais comuns para o uso de CAM [5], [6]. No entanto, embora o uso CAM é popular entre os pacientes com câncer, benefício baseada em evidências a partir de compostos naturalmente com base está faltando. A discrepância entre o uso de um produto natural e o conhecimento sobre as suas propriedades anti-tumorais é reflectida nomeadamente no caso de amigdalina. Amygdalin (D-mandelonitrilo-β-gentiobioside) é um diglucoside cyanogenic presente nos poços de muitas frutas e em numerosas plantas que pertencem à família Rosaceae, como Prunus persica (pêssego), Prunus armeniaca (damasco) e Prunus Amygdalus amara (amêndoa amarga ). O termo “laetrile” é frequentemente utilizado como sinónimo de amygdalin. No entanto, laetrila é estruturalmente diferente do composto mãe, amigdalina, e é um acrónimo (levógiro e mandelonitrilo) para uma forma purificada, semi-sintética de amigdalina. A presente investigação emprega “amygdalin”.
Amygdalin foi um dos mais populares, não-convencionais, tratamentos anti-câncer na década de 1970. Em 1978, 70.000 pacientes com câncer dos EUA tinha usado amygdalin para tratar seu câncer [7]. Ainda assim, a pesquisa baseada em evidências em amygdalin é escassa e seu benefício controversa. Os proponentes consideram amygdalin uma cura de câncer natural, enquanto opositores advertem que amygdalin é ineficaz e até mesmo tóxico. Embora tenha sido argumentado que amygdalin não é seguro, nenhuma toxicidade aguda grave foi encontrado. Também foi concluído que amygdalin não tem potencial anti-tumoral, embora a partir de 368 pacientes com câncer listados em um comentário, 12,5% apresentaram uma resposta completa ou parcial, 6,8% tinham doença estável e 22,9% demonstraram benefício sintomático de amygdalin [8]. Para obter insights sobre como amygdalin pode funcionar, uma investigação in vitro foi iniciada para determinar a sua influência no crescimento e proliferação cancro da bexiga. Além disso, a progressão do ciclo celular e proteínas reguladoras do ciclo celular foram avaliados em amigdalina tratadas e células não-tratadas. siRNA derrubar os estudos foram realizados para explorar proteínas alteradas por amigdalina, que podem ter relevância clínica.
Os dados in vitro aqui apresentados apontam para o crescimento e proliferação de amigdalina efeitos de bloqueio significativa, provavelmente induzida por uma diminuição na reguladoras do ciclo celular proteínas cdk2 e ciclina A.
Materiais e Métodos
cultura celular
RT112, UMUC-3 (ATCC /LGC Promochem GmbH, Wesel, Alemanha) e TCCSUP (DSMZ, Braunschweig, Alemanha), células de carcinoma de bexiga foram cultivadas e subcultivadas em meio RPMI 1640, 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 20 mM de tampão HEPES, 1% Glutamax e 1% de penicilina /estreptomicina (todos: Gibco /Invitrogen, Karlsruhe , Alemanha). RT112 é um procedimento invasivo (estágio T2 patológica) modelo moderadamente diferenciado (grau 2/3) de câncer de bexiga humana, ao passo que TCCSUP é um carcinoma de células transicionais, grau 4. UMUC-3 representa um alto grau 3, câncer de bexiga invasivo. As subculturas foram usadas passagens de 7-24.
Amigdalina tratamento
Amigdalina de sementes de damasco (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha) foi dissolvida de fresco em meio de cultura de células e adicionado a células de tumor em concentrações variando 1,25-10 mg /ml. Os controlos permaneceram sem tratamento. Em todas as experiências, as culturas de células tumorais tratadas foram comparadas com as culturas não tratadas. Para avaliação dos efeitos tóxicos de amigdalina, a viabilidade celular foi determinada pelo azul de tripano (Gibco /Invitrogen). Para a avaliação da apoptose a expressão de anexina V /iodeto de propídio (PI) foi determinada utilizando o kit de anexina V-FITC Apoptosis Detection (BD Pharmingen, Heidelberg, Alemanha). As células tumorais foram lavadas duas vezes com PBS, e depois incubaram-se com 5 jil de anexina V-FITC e 5 ul de PI no escuro durante 15 min à temperatura ambiente. As células foram analisadas num FACScalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). A percentagem de células apoptóticas (precoce e tardia) em cada quadrante foi calculada utilizando o software CellQuest (BD Biosciences).
Medição do crescimento de células tumorais e proliferação
O crescimento celular foi avaliado utilizando o 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) brometo (MTT) de redução do corante -2,5-difeniltetrazólio (Roche Diagnostics, Penzberg, Alemanha). As células de tumor (100 uL, 1 × 10
4 células /ml) foram semeadas em placas de 96 poços de cultura de tecidos. Após 24, 48 e 72 h, de MTT (0,5 mg /ml) foi adicionado durante um adicional de 4 h. Em seguida, as células foram lisadas num tampão contendo SDS a 10% em HCl 0,01 M. As placas foram então incubadas durante a noite a 37 ° C, 5% de CO
2. A absorvância a 570 nm foi medida para cada poço utilizando um leitor de microplacas ELISA. Cada experiência foi realizada em triplicado. Depois de se subtrair a absorvância do fundo, os resultados foram expressos como número médio de células.
A proliferação celular foi medida utilizando um a proliferação de células BrdU ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) kit (Calbiochem /Merck Biosciences, Darmstadt, Alemanha). As células tumorais, semeadas em placas de microtitulação de 96 poços, foram incubadas com 20 ul de solução de marcação com BrdU por poço, durante 8 h, fixadas e detectado utilizando anticorpos anti-BrdU de mAb de acordo com as instruções do fabricante. A absorvância foi medida a 450 nm.
clonogénicas ensaio
células tumorais pré-tratadas com amigdalina durante 2 semanas, foram transferidas para placas de 6 poços a 300 células por poço. Após 10 dias de incubação, durante o qual as células foram expostas quer a amigdalina ou não, as colónias foram fixadas e contadas. As colónias de pelo menos 50 células foram contadas como uma.
análise do ciclo celular
análise do ciclo celular foi realizada com células de tumor subconfluentes. populações de células tumorais foram coradas com iodeto de propídio, usando um teste de ciclo plus kit de ADN Reagente (BD Pharmingen) e, em seguida, submetido a citometria de fluxo com um citómetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson). 10.000 eventos foram recolhidas para cada amostra. A aquisição de dados foi realizada usando o software Cell-quest e a distribuição do ciclo celular foi calculada utilizando o software ModFit (BD Biosciences). O número de células fechadas do grupo G1, G2 /M ou fase S é apresentada como%.
Western blotting
Para investigar proteínas envolvidas na regulação do crescimento celular, os lisados celulares tumorais foram aplicadas a um gel de poliacrilamida a 7% e submetidas a electroforese durante 90 min a 100 V. a proteína foi então transferida para membranas de nitrocelulose. Após o bloqueio com leite seco não gordo, durante 1 h, as membranas foram incubadas durante a noite com anticorpos monoclonais dirigidos contra as proteínas do ciclo celular: Cdk1 (IgG1, clone 1), CDK2 (IgG2a, clone 55), CDK4 (IgG1, clone 97), ciclina A (IgG1, clone 25), a ciclina B (IgG1, clone 18), ciclina D1 (IgG1, clone G124-326), p19 (IgG1, clone 52 /p19), p27 (IgG1, clone 57; todos: BD Pharmingen ). O alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) pathway foi investigado usando os seguintes anticorpos monoclonais: anti fosfo Rictor (pRictor; IgG, Thr1135, clone D30A3), anti Raptor fosfo (pRaptor; IgG, Ser792; ambos: New England Biolabs, Frankfurt, Alemanha), anti fosfo Akt (pAkt; IgG1, Ser472 /Ser473, clone 104A282; BD Pharmingen). modulação epigenética foi investigada por anti H3 acetilada (AH3; IgG, Lys9, clone C5B11) e anti acetilado H4 (aH4; Lis8, policlonal, IgG; ambos: New England Biolabs).
HRP-conjugado de cabra anti -mouse IgG (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, EUA; 1:5.000 diluição) serviu como o anticorpo secundário. As membranas foram brevemente incubadas com reagente de detecção ECL (ECLTM, Amersham /GE Healthcare, Munique, Alemanha), para visualizar as proteínas e, em seguida, analisados pelo sistema de fusão fx7 (Peqlab, Erlangen, Alemanha). β-actina (1:1000; Sigma, Taufenkirchen, Alemanha). serviu como controle interno
software Gimp 2.8 foi usado para realizar a análise de densidade de pixels das bandas de proteínas. foi calculada a proporção de intensidade de cada investigado proteína /intensidade de β-actina, e valores de intensidade foram então expressas em percentagem, em relação a controlos definido como 100%.
Cdk2 e ciclina Uma batida para baixo
As células tumorais (3 × 10
5/6 poços) foram transfectadas com um pequeno ARN interferente (siRNA) dirigido contra CDK2 (ID gene: 1017, sequência alvo: AGGTGGTGGCGCTTAAGAAAA) ou ciclina A (ID de genes: 890, sequência alvo : GCCAGCTGTCAGGATAATAAA; Qiagen, Hilden, Alemanha), com um reagente de ARNsi /transfecção (HiPerFect Transfection Reagent; Qiagen) proporção de 1:06. As células e as células tratadas com 5 nM de ARNsi de controlo não tratados (Todas as estrelas siRNA controlo negativo; Qiagen) serviram como controlos. Posteriormente, o crescimento de células tumorais foi analisada como indicado acima.
Estatísticas
Todos os experimentos foram realizados 3-6 vezes. A significância estatística foi avaliada pelo teste de Wilcoxon-Mann-Whitney-U-teste não-paramétrico de experiências repetidas 6 vezes. Experiências realizadas 3 vezes foram analisados estatisticamente pelo teste t paramétrico. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a um valor de p inferior a 0,05.
Resultados
dose-resposta análise
expondo as células tumorais a amygdalin (aplicação em dose única) levou a uma concentração redução dependente do número de células tumorais, com o efeito mais proeminente aparente na linha celular TCCSUP (Fig. 1, 24 h a aplicação). Nenhum sinal de toxicidade foi demonstrado pelo teste de exclusão de azul de tripano. Uma vez que a redução de células mais forte foi observada com 10 mg /ml de amigdalina, esta concentração foi utilizada para todas seguinte investigação. O tratamento a longo prazo, que consiste de 10 mg /ml amigdalina adicionada a células de tumor três vezes por semana ao longo de um período de duas semanas mostrou que o crescimento celular foi diminuída para um grau semelhante ao encontrado com o protocolo de tratamento a curto prazo (Fig. 1, 2 aplicação semanas).
Controles permaneceu sem tratamento. crescimento de células tumorais após 2 semanas de tratamento com 10 mg /ml amigdalina: Down. Cada experiência foi efectuada em triplicado e repetidas 5 vezes. Os dados de uma experiência representativa é mostrada. * Indica diferença significativa aos controles (p = 0,0022).
Controles permaneceu sem tratamento. O quadrante superior direito mostra percentagem de células no final de apoptose, a percentagem quadrante inferior direito de células em apoptose precoce (um representante de 3 testes; SD
intra-ensaio 10%).
a apoptose
aplicação de curto prazo de amigdalina durante 24 h não induziu a apoptose (dados não apresentados). No entanto, a percentagem de células de tumor submetidas a apoptose precoce cerca do dobro após a exposição amigdalina duas semanas em todas as três linhas de células: p = 0,0026 (UMUC-3), p = 0,0145 (TCCSUP) e p = 0,0208 (RT112). Além disso, a duplicação no final de apoptose ocorreu na linha celular UMUC-3 (Fig 2;. P = 0,0230)
proliferação de células tumorais e o crescimento de células clonal
Proliferação em todas as três linhas de células. foi significativamente diminuído, se amigdalina foi aplicada durante 24 h ou 2 semanas (Figura 3, esquerda). Após 2 semanas de exposição amygdalin às células confluentes, foi então avaliada crescimento clonal, em que amygdalin ou foi adicionado por um período subsequente de 10 dias ( “amygdalin B”) ou não ( “amygdalin A”). O número de clones RT112 foi consideravelmente diminuída pela exposição amigdalina 10 dias durante a formação clonal, e nenhum clone TCCSUP eram aparentes (Fig. 3, direita). Quando amigdalina não foi aplicada durante a formação clonal, o número de clones e RT112 TCCSUP também foi reduzida, mas não tão fortemente como se viu no esquema “amigdalina B” (Fig. 3, direita). A linha de células UMUC-3 não formam colônias e foi, portanto, não avaliou
À direita:. Crescimento clonogênica de células TCCSUP e RT112 (subseqüentes à cultura subconfluentes duas semanas com 10 mg /ml amygdalin) sem (controle ) e com amigdalina. incubação livre Amygdalin A = 10 dias amygdalin durante o crescimento clonogênica. Amygdalin B = 10 dias de crescimento clonogênica com 10 mg /ml amygdalin. As experiências foram efectuadas em triplicado e repetidas 5 vezes. * Indica diferença significativa aos controles (p = 0,0022).
#indicates diferença significativa para amigdalina A (p = 0,0022). 4
ciclo celular progressão
Amigdalina modulado progressão do ciclo celular, dependendo da linha de células de tumor (Fig. ). amigdalina aplicação de curto prazo (24 h) para UMUC-3 aumentou o número de células G0 /G1 (p = 0,0169) e reduziu o número de células em fase S (p = 0,0138). Em células TCCSUP tratamento a curto prazo aumentou o número de células /G1 de fase G0 (p = 0,0121), mas reduziu o número de células no /M-fase G2 (p = 0,0406). Em células RT112 amigdalina exposição de curta duração causadas redução G2 /M-fase (p = 0,0039) e um aumento na fase S (p = 0,0040). Duas semanas de exposição amygdalin baixou o /M-fase G2 (p
UMUC-3 = 0,0036; p
TCCSUP = 0,0080; p
RT112 = 0,0015) e aumentou a /G1 fase G0 em todas as células de tumor linhas (p
UMUC-3 = 0,0019, p
TCCSUP = 0,0143, p
RT112 = 0,0018). O número de células em fase S também foi significativamente diminuída após duas semanas de tratamento em UMUC-3 (p = 0,0093) e as células RT112 (p = 0,0032), em comparação com os controlos.
A população de células é expressa como percentagem do total de células analisadas. Uma experiência representativa de três é mostrado.
ciclo celular que regula a expressão da proteína
Uma vez que o crescimento celular amygdalin influenciado e progressão do ciclo celular, modificações do ciclo celular controle proteínas poderia ser esperado. A expressão de CDK1 e CDK2 (todas as linhas celulares) e de cdk4 (TCCSUP, RT112) foi diminuída de 24 h após a aplicação amigdalina (Fig. 5). Os valores P foram os seguintes cdk1 (p
UMUC-3 = 0,0029, p
TCCSUP = 0,0052, p
RT112 = 0,0007), para cdk2 (p
UMUC-3 = 0,0001, p
TCCSUP = 0,0006, p
RT112 = 0,0001), para a cdk4 (p
TCCSUP = 0,0006, p
RT112 = 0,0001), para a ciclina a (p
UMUC-3 = 0,0001, p
TCCSUP = 0,0001, p
RT112 = 0,0002), para a ciclina B (p
TCCSUP = 0,001, p
RT112 = 0,0001) e para a ciclina D1 (p
UMUC-3 = 0,0001, p
TCCSUP = 0,0001, p
RT112 = 0,0001). p19 foi aumentada em UMUC-3 (p = 0,0013) e RT112 (p = 0,0012), mas reduzido em TCCSUP (p = 0,0001), enquanto que P27 foi reduzido em todas as linhas celulares (p
UMUC-3 = 0,0013, P
TCCSUP = 0,0001, p
RT112 = 0,0001). pAkt bem como pRictor (mas não pRaptor), a partir da via mTOR, foram desactivadas em todas as três linhas de células. Os valores P foram os seguintes pAkt (p
UMUC-3 = 0,0002, p
TCCSUP = 0,0004, p
RT112 = 0,0082) e para pRictor (p
UMUC-3 = 0,0015, p
TCCSUP = 0,0017, p
RT112 = 0,0001). pRaptor foi diminuída apenas em TCCSUP (p = 0,0024).
As células tumorais foram pré-tratados com amygdalin por 24 h ou 2 semanas (controles permaneceu sem tratamento). p-actina serviu como o controlo interno. Um representante de três experiências separadas é mostrado. O painel da direita da figura 5 mostra os valores de densidade de pixels dadas em porcentagem relacionada com os controlos não tratados com amygdalin. * Indica diferença significativa com o controle.
Pequenas diferenças eram evidentes após 2 semanas em oposição à exposição amigdalina 24 horas. Cdk1 mas não CDK2 foi regulada para baixo em UMUC-3 (p = 0,0001). A influência diminuindo 24 h de amigdalina em expressão de p27 em células umuC-3 e TCCSUP foi perdido após 2 semanas, e pRaptor aumentou após 2 semanas em células TCCSUP (p = 0,0019), em contraste com o efeito de diminuição de 24 h (Fig. 5 ).
Cdk2 /ciclina a knockdown
Desde amigdalina fortemente modificada cdk2 e ciclina a em todas as linhas de células de tumor e estas proteínas regulam a entrada no ciclo mitótico, o papel destas proteínas no crescimento tumoral foi avaliada por siRNA knock-down. A incubação de UMUC-3, células RT112 e TCCSUP com ARNsi contra CDK2 ou ciclina A distintamente diminuição do teor de proteínas (Fig. 6, inferior direito) e foi acompanhada por bloqueio significativo crescimento em todas as três linhas de células (Fig. 6).
UMUC-3, células TCCSUP e RT112 foram transfectadas com cdk2 ou ciclina A siRNA e derrubar era controlada por western blot (inferior direito). Um representante de 6 experiências é mostrado. * Indica diferença significativa aos controles (p = 0,0022).
Discussão
A evidência apresentada aqui mostra que amygdalin suprime o crescimento e proliferação em linhas celulares de cancro da bexiga três. O número de células de tumor submetidas a apoptose precoce ligeiramente aumentada, após a exposição a longo prazo amigdalina, embora não depois da exposição de curto prazo e esta inibição da actividade proliferativa não foi causada por um efeito tóxico de amigdalina. Outros pesquisadores também mostraram sinais de apoptotosis induzida por amygdalin. activação rápida da caspase-3, juntamente com a sub-regulação de Bcl-2 e sobre-regulação de Bax, na presença de 0,1 mg /ml amigdalina foi demonstrada em células de cancro da próstata LNCaP e DU145 [9]. A morte celular apoptótica também foi evocado por amigdalina na linha celular de cancro cervical HeLa [10] e em células de leucemia promielocítica humana (HL-60) [11]. No total, estes relatórios indicam que amygdalin podem ser responsáveis por eventos apoptóticos em células cancerosas diversas, incluindo os de bexiga, e contribuir para o crescimento do tumor reduzida.
Amygdalin fortemente alteradas progressão do ciclo celular em todas as linhas celulares de cancro da bexiga três. Durante o tratamento de curto prazo, UMUC-3 e TCCSUP acumulado em G0 /G1, enquanto RT112 foi preso na fase S. A mitose é, por conseguinte, influenciada de forma diferente em diferentes linhas de células por amigdalina. Outra diferença era que p19 aumentou em RT112 mas diminuiu em TCCSUP. Rictor foi desactivada e CDK4 foi suprimida em RT112 mas não em UMUC-3. inibição de CDK4 e aumento p19 foi recentemente demonstrado para dirigir células do tumor na fase S [12]. Uma vez que tanto a inibição CDK4 e p19, em combinação, ocorreu apenas nas células RT112, isto poderia explicar por que RT112 acumulado na fase-S, em vez de na fase G0 /G1. Na verdade, cdk4 não foi reduzida após a aplicação de 2 semanas amygdalin, e as células RT112 foram então preso em G0 /G1. No entanto, a entrada da fase S não é controlada exclusivamente pela CDK4 e p19. Em vez disso, um grupo de proteínas do ciclo celular está envolvido na condução de divisão celular para a frente. Amygdalin Parece, portanto, interferir de uma forma dependente linha de células com várias moléculas de ponto de verificação, perturbando o aparelho mitótico afinado. bloqueio de crescimento é o resultado final.
A relevância do p19 e p27 na progressão do cancro da bexiga não foi totalmente elucidado. Ambas as proteínas foram fortemente modificada após a aplicação amygdalin nesta investigação, p27 ser regulada para baixo em todas as linhas celulares, p19 sendo regulado para cima em UMUC-3 e RT112, mas diminuiu em TCCSUP. Semi-quantitativo de RT-PCR em uma série de 32 espécimes de cancro da bexiga emparelhados com os tecidos normais adjacentes não revelou quaisquer diferenças significativas de p19 e expressão de p27 [13]. Por outro lado, a avaliação prospectiva de pacientes com câncer de bexiga de alto grau tratados com cistectomia radical demonstrou mais p27 positivos do que negativos tumores em pacientes com recorrência da doença [14]. microarrays análise demonstrou uma correlação positiva entre a expressão de p27 e câncer de bexiga avançado [15]. Em contrapartida, outro estudo relatou um efeito desfavorável da perda de p27 associado com carcinoma da bexiga [16]. As experiências in vitro têm apontado para um papel indeterminado de p27 na medida em que a supressão desse crescimento proteína elevado, mas ao mesmo tempo reduziu a invasão [17] – [19]. Com base nesta, não é possível avaliar se finalmente redução p27 após a aplicação amigdalina está ligada à proliferação, invasão de ou para ambos. Para obter informações sobre o processo de invasão, uma nova investigação foi iniciada concentrando-se na ação do amygdalin em células de câncer se espalhe.
Amygdalin reduzida fosforilação de Akt e da subunidade mTOR, rictor. sinalização Akt-mTOR desempenha um papel importante na carcinogênese da bexiga, com a ativação de Akt ocorrendo ao longo de todo o espectro de bexiga urothelial carcinomas [20]. O projeto Cancer Genome Atlas identificou a Akt /mTOR como um alvo terapêutico importante no cancro da bexiga [21]. A ação específica de amygdalin na rictor complexo mTOR é de interesse, uma vez que os mTOR inibidores aprovados, everolimus e temsirolimus, direcionar o raptor complexo mTOR, enquanto rictor é considerado insensível a ambas as drogas [22]. Rictor foi demonstrado ser um determinante importante na migração e invasão do cancro da bexiga [23]. Assim, amygdalin pode não só ser uma ferramenta inovadora para neutralizar disseminação metastática, mas também para complementar regimes baseados mTOR-inibidor.
Cdks, juntamente com ciclinas, são moléculas-chave responsáveis pela progressão do ciclo celular e divisão celular, dando neste contexto particular cdk são filiados com ciclinas particulares. Consequentemente, o crescimento de células de cancro aberrante tem sido atribuída a modulação do nível de expressão de cdk-ciclina. As alterações na proteína mais fortes após 24 h de incubação amigdalina foram observados para cdk2 e ciclina A, e podem representar alvos principais de amigdalina. Embora não há até à data investigadores têm avançado esta hipótese, amigdalina foi mostrado para alterar genes envolvidos na regulação do ciclo celular de células de cancro do cólon humano [24]. O cdk2 de ciclina A eixo promove transição de fase G1 /S, o que poderia explicar por que cdk2 /ciclina A down-modulação pelo amygdalin foi acompanhada por uma prisão fase G0 /G1 em células UMUC-3 e TCCSUP. Na investigação in vitro de células de sarcoma de tecido mole tenha mostrado que a redução da perda de CDK2 combinado com p27 afecta o programa de invasão celular [25]. Uma vez que a redução CDK2 foi acompanhada por uma diminuição p27 no modelo de cancro da bexiga, parece provável que amigdalina não só actua sobre o crescimento do tumor, mas também poderia influenciar a propagação metastática.
Com efeito, apesar de CDK2-ciclina A são alterados em muitas tumores sólidos, informações sobre cdk2-ciclina a em câncer de bexiga é escassa. A proteína e ARNm de análises de tecidos de carcinoma da bexiga têm indicado que CDK2 está estreitamente associada com o desenvolvimento de tumores da bexiga e do progresso [26]. parceiro de ligação de cdk2, ciclina A, tem sido correlacionada com o grau do tumor e sobrevivência específica da doença pobres, evidenciada por imuno-histoquímica e de cDNA microarrays [27]. Nos experimentos atuais, derrubando cdk2 ou ciclina A levou a uma redução substancial do número de células do tumor, indicando a relevância clínica de ambas as proteínas para o câncer de bexiga. Uma vez que as CDKs e ciclinas são reforçadas quando a resistência aos medicamentos desenvolve [28], [29], contrariar este processo pode ser uma estratégia potente para evitar ou ultrapassar a resistência [29]. Durante os últimos anos, várias novas estratégias terapêuticas foram projetados para atingir cdk. Actualmente, estão em vários estágios de desenvolvimento clínico, como ambos os agentes isolados e em combinação [30]. Amigdalina poderia ser uma alternativa “natural”, pelo qual os efeitos secundários graves associados com CDK-inibidores convencionais [31] pode ser evitado.
foram observadas pequenas diferenças entre a curto prazo e amigdalina aplicação de longo prazo, particularmente no a linha celular UMUC-3. Cdk2 não foi diminuída após 2 semanas, mas cdk1 foi mais fortemente diminuída do que após 24 h de aplicação amygdalin. A razão para este interruptor sobre aplicação depois de longo prazo não é clara. Cdk2 acumula no limite de fase G1 /S, enquanto que as células em mitose unidades CDK1 [32]. Os diversos mecanismos de cdk1 e cdk2 foram reflectidas pelo ensaio do ciclo celular demonstrando prisão adicional de UMUC-3 em G2 M após 2 semanas de exposição /amygdalin. Uma vez que o crescimento e proliferação UMUC-3 foi semelhante alterado no 24 h e 2 semanas aplicação amigdalina, CDK2 pode ter tornado insensível à supressão amigdalina, mas isso é compensado por uma supressão da CDK1. Na verdade, cdk1 foi relatado para compensar cdk2, redirecionando cdk1 para a ciclina A via, que é normalmente restrito a cdk2 [33].
Esta é a primeira investigação fornecendo informações sobre a influência de amygdalin em células de câncer de bexiga linhas in vitro. Tais estudos in vitro não pode fazer mais do que apresentar uma previsão da eficácia do amygdalin em pacientes. Os ensaios clínicos com amigdalina não têm sido bem documentadas e estudos aleatórios controlados nunca foram realizadas. Uma análise retrospectiva de 67 pacientes com tumores que tinham tomado amygdalin relataram dois completa e 4 respostas parciais [34]. Um ensaio clínico de fase II foi realizado em 1982, em que os doentes receberam também vitaminas e enzimas pancreáticas. A terapia foi interrompida quando os níveis de cianeto no sangue aumentada e concluiu-se que Laetrile não era um tratamento eficaz do cancro [35]. Outros relatórios sugerem amygdalin de ser um benefício claro em pacientes com câncer [8]. No entanto, o termo “benefício” não foi claramente especificado. Ambivalência também foi refletida em relatos de casos, onde amygdalin foi ineficaz em cinco e eficaz em quatro casos [8].
Ainda não está claro se amygdalin pode também agir em células epiteliais normais, fisiologicamente intactas. Uma vez que as células epiteliais não imortalizadas primárias não mostram actividade mitótica ou perdem rapidamente a actividade mitótica in vitro, essas células não podem ser sujeitos ao ensaio de crescimento com MTT. No entanto, amigdalina foi recentemente demonstrado para bloquear o crescimento de células endoteliais [36]. Se este fenómeno pode ser transferido para outras células permanece aberta. No entanto, o bloqueio do crescimento de células endoteliais por amygdalin indica que amygdalin pode suprimir tumor angiogênese induzida.
O risco de desenvolver envenenamento por cianeto também não foi resolvido. Neste contexto, a via de administração (oral ou intravenosa), a quantidade ea qualidade irá certamente influenciar a relação risco-benefício. Como os relatórios clínicos de tratamento amygdalin são mais de 30 anos [8], e durante este tempo a compreensão dos mecanismos moleculares de cancro tem progredido bastante, seria útil para testar in vitro suposições aqui apresentados em um modelo vivo. Bem concebido, ensaios clínicos controlados de forma crítica amigdalina teste devem, então, ser considerado.
Em geral, amigdalina foi mostrado para bloquear o crescimento de células cancerosas da bexiga in vitro. Supressão de cdk2 e ciclina A pode ser um mecanismo importante definir como amygdalin pode parar ou diminuir a proliferação do tumor.
Reconhecimentos
Nós gostaríamos de agradecer a Karen Nelson pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela “Brigitta und Norbert Muth Stiftung” eo “Freunde und der Förderer Goethe-Universität Frankfurt”.