Abstract

A autofagia é descrito para ser envolvido na homeostase, desenvolvimento e doença, tanto como uma sobrevivência e um processo de morte. Seu envolvimento na morte da célula procede de inter-relações com a via apoptótica. Estamos focados em autofagia sobrevivência e investigado seus interplays com a maquinaria apoptótica. Descobrimos que, enquanto Mcl-1 permaneceu ineficaz, Bcl-2 e Bcl-xL eram necessários para as células em jejum para exibir uma via autophagic totalmente funcional como mostrado pela actividade proteólise e detecção de vesículas autofágicos. Tais funções pró-autofágicos de Bcl-2 e Bcl-xL eram independentes da Bax. No entanto, eles apareceram para operar através de mecanismos não redundantes como Bcl-xL exercia um controlo mais apertado do que Bcl-2 sobre a regulação da autofagia: ao contrário de Bcl-2, Bcl-xL e manipulação Atg7 rendeu fenótipos idênticos, sugerindo que poderiam ser componentes da mesma sinalização via; Bcl-xL localização subcelular foi modificado após a fome, e mais importante, Bcl-xL agiram independentemente da beclin 1. Ainda um local de ligação BH3 intacta foi necessário para Bcl-xL para estimular uma via autofágica totalmente funcional. Este estudo sugere que, para além da sua função de anti-morte bem estabelecida durante a apoptose, Bcl-2 e Bcl-xL ter um papel mais amplo na sobrevivência celular. Deve Bcl-2 e Bcl-xL stand na encruzilhada entre pró-sobrevivência e autofagia pró-morte, este estudo apresenta o novo conceito que a regulação da autofagia por Bcl-2 e Bcl-XL é ajustado de acordo com a sua sobrevivência ou resultado a morte

Citation:. Priault M, Hue e, Marhuenda F, Pilet P, Oliver L, Vallette FM (2010) Dependência Diferencial em beclin 1 para a Regulamentação da Pro-Survival Autophagy por Bcl-2 e Bcl -XL em células HCT116 câncer colorretal. PLoS ONE 5 (1): e8755. doi: 10.1371 /journal.pone.0008755

editor: Rafael Linden, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brasil

Recebido: 15 Setembro, 2009; Aceite: 15 de dezembro de 2009; Publicação: 18 de janeiro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Priault et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), o Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Université de Nantes, Université de Bordeaux, o Conseil Regional d’Aquitaine (a UMR 5095), e Agence Nationale pour la Recherche (projeto MABA para FV). M. P. foi apoiado por uma bolsa de pós-doutoramento da INSERM. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Macro-autofagia (doravante referida como a autofagia) é um processo catabólico orquestrada pelos

ATG

genes conservados evolucionários (por autofagia) [1], [2], e consistem na aleatório sequestro de macromoléculas por vesículas de membrana ligada duplas ou múltiplas recém-formada chamada autofagossomas. Devido ao seu tamanho (geralmente entre 500-1500 nm, em células de mamífero) [3], [4], autofagossomas pode incluir material solúvel, bem como organelos inteiros. Degradação da carga é alcançada após vacúolos autofágicos nascentes ter fundido com lisossomas [5]. Os produtos resultantes são então disponível para reciclagem em vias biossintéticas; assim autofagia é uma das principais vias lisossomais para rotação material biológico.

Autophagy foi caracterizada inicialmente como um mecanismo de sobrevivência, uma vez que permite que as células de superar as condições rigorosas estendendo assim o tempo de vida. Após a fome, as mutações no

ATG

genes resultar em morte celular em leveduras, clorose nas plantas, e diminuição da esperança de vida adulta no

daf-2

Caenorhabditis elegans mutante [1]. Nos mamíferos, autofagia existe a um nível basal e controla funções homeostáticas. Estimulação de autofagia foi desde há muito conhecida como uma resposta à estimulação hormonal fome ou [6]; No entanto, estudos recentes têm ampliado o papel citoprotector da autofagia a manutenção da viabilidade celular, mostrando que

ATG

genes são necessários para a sobrevivência em ambientes diferentes em mamíferos [7] – [10]. Aliás nestas obras, a autofagia foi elegantemente mostrado para ser crítico para a bioenergética manutenção e viabilidade celular in vitro, mas também para jogar uma parte essencial in vivo na sobrevivência de todo o organismo.

Ao lado deste papel fisiológico no tecido homeostase, autofagia é paradoxalmente também associada com a morte celular. Este conceito surgiu da observação de que a autofagia é frequentemente observado em células que morrem quando a eliminação maciça é necessária em órgãos [11]. A existência de “morte celular autofágica” em vez de “morte celular com autofagia” [12] foi por muito tempo questionou porque autofagia e apoptose são frequentemente activados ao mesmo tempo em resposta ao estresse [13] – [15], embora exibindo morfologias distintas [16]. A evidência direta de um

morte ATG

dependente de células foi trazido tanto pela perda de estudos da função mostrando que a regulação da

ATG7

ou

Atg5

poderia suprimir a morte celular em células da apoptose deficiente [17], [18], e também pela sobre-expressão experiências que mostram que a expressão ectópica de mutantes de

ATG6

/beclin 1 poderia desencadear estimulação autofagia que resultou em

Atg5

morte celular dependente de [19]. Assim, autofagia pode ser considerado como um programa de morte alternativa, pelo menos em células com maquinaria apoptótica prejudicada. No entanto, se a morte autofágica é hoje reconhecida, o evento causal para o seu início ainda é desconhecido como (i) nenhuma prova definitiva da autofagia como o iniciador primário de morte foi relatada, e (ii) provas ainda falta de um estímulo que faria inclinação autofagia pró-sobrevivência em um programa mortal.

Mais recentemente, o campo de interesse para a morte celular autofágica ampliou devido à constatação de que a autofagia desregulamentação está implicado no cancro, e por causa interplays moleculares têm comprovado a interferência entre apoptose e autofagia [20]. Assim, o destino das células é, sem dúvida, governado pela regulação coordenada da apoptose e autofagia, mas a quando e como são ainda questões por resolver [21], [22]. Um avanço decisivo quanto a este último ponto, foi a descoberta de que o regulador chave da autofagia beclin 1 abriga um domínio BH3 [23], que se liga aos domínios BH1-BH2 de anti-apoptótica de Bcl-2 [19] ou a Bcl-xL [24 ]. Consecutivamente, análises exaustivas da regulação da autofagia por Bcl-2 e Bcl-xL foram realizadas e revelou que a sua ligação ao beclin 1 resultou na inibição da autofagia. Esta ligação foi inicialmente proposto para desviar beclin 1 de interagir com e estimulando classe III fosfatidilinositol-3-quinase actividade Vps34 [19], mas a um consenso agora argumenta contra a interacções mutuamente exclusivos de beclin 1 com Bcl-2 e Vps34 [24] – [26], sublinhando que a atividade autofágica não é apenas dirigido por beclin 1 associação com Bcl-2 /Bcl-xL. Por conseguinte, Zeng et al. relataram locais onde beclin 1 não se ligam Bcl-xL ou Bcl-2 [27], mostrando que essas interações não são obriga. Todas estas observações indicam que a relevância funcional de Bcl-2 /beclin 1 ou Bcl-XL /beclin 1 interacções não é ainda completamente compreendido. Ainda mais, a vista de Bcl-2 como uma proteína anti-autophagic [28] – [30] foi desafiado pela verificação de que a sobre-expressão de Bcl-2 em células de apoptose deficiente poderia em vez potenciar autofagia [18]

para investigar mais este assunto, decidimos explorar as funções autofágicos dos membros da família Bcl-2, sob condições onde a estimulação autofagia serve como um processo de sobrevivência: semelhantes ao que foi observado com a morte de promoção de autofagia, descobrimos que a autofagia sobrevivência está especificamente envolvido com funções anti-apoptóticos de Bcl-2 e Bcl-xL; No entanto, curiosamente, ambos foram encontrados para estimular a autofagia e exibiu dependência diferente em beclin 1 a desempenhar tais funções pró-sobrevivência.

Resultados

A autofagia é um processo de sobrevivência em células HCT116 Induzido por inanição

a controvérsia sobre a pró-sobrevivência [7], [10] ou pró-morte [17] – [19] resultado da manipulação da autofagia em condições limitantes de nutrientes tem sido alimentado pelo confronto de vários estudos . Portanto, primeiro estabelecido para resolver o destino das células esfomeados em nosso meio: células HCT116 colorretais foram escolhidos como eles apareceram, entre as todas as linhas de células que testamos, para expor a resposta mais forte autofágica, quando confrontado com limitação de nutrientes (os nossos dados não publicados ). As células foram transferidas para meio de privação e seguido por microscopia de vídeo ao longo de 48 horas. Análises morfométricas (Fig. 1A) revelou que as células parentais HCT116 principalmente exibida características apoptóticas (~55%) como confirmado por activação da caspase 3 (Fig. 1B) enquanto -30% foram submetidos a um padrão de morte resultante de um desaparecimento osmótica rápida (dentro de 20 a 30 minutos depois da separação a partir da placa), e menos do que 5% permaneceram vivos. HCT116-BaxKO subclone foi também analisada para testar o resultado de fome em células deficientes apoptose: como análise morfométrica esperado (Fig. 1A) e Western blot (Fig. 1B) não conseguiram detectar qualquer função apoptótica, e observou-se que a fracção de células passando o fim osmótica permaneceu inalterada (~ 30%). Curiosamente, um outro fenótipo predominaram como mais do que 50% de células HCT116-BaxKO isoladas a partir da placa, mas manteve a viabilidade uma vez que eles recuperaram a adesão normal e proliferação, quando transferidos de volta em meio completo (Fig. 1C). É de notar que estas células isoladas não poderiam ser responsáveis ​​por células mitóticas após 48 horas de jejum, uma vez que a limitação de nutrientes é conhecido por induzir um rápido detenção do ciclo celular [10], [31]. Para verificar se esse reversível “estado de estase” foi relevante do autofágica metabolicamente inativo fenótipo Lum et al. descreveram [10], que em seguida ensaiou-se os requisitos para uma maquinaria autophagic funcional. Autofagia utiliza dois sistemas de conjugação de ubiquitina-like para autofagossomas conclusão, que ambos envolvem Atg7, uma proteína que lembra os E1 enzimas de activação de ubiquitina [32] essenciais para a autofagia [33]. Como resultado, é conjugado com Atg5 Atg12 autofagia quando está activado; western blot revelou que a fome autofagia induzida maciçamente em HCT116 BaxKO subclone em comparação com células parentais (Fig. 1B). deficiência genética de autofagia também foi realizada utilizando shRNA segmentação de Atg7, e fome células HCT116-BaxKO shAtg7 foram encontrados para submeter a massa morte celular osmótico (~ 80%), devido a entrada de defeito para o estado de estase autophagic ( 5%) (Fig . 1A), como confirmado pela diminuição drástica do Atg5-Atg12 conjugado nessas células (Fig. 1B). O estado de estase foi, assim, dependente de autofagia e provou ser um meio para manter a morte à distância. Conclui-se que, embora transitória porque as células acabam por morrer, se a fome é prolongada, a autofagia confere uma vantagem de sobrevivência em nosso meio.

analisa (A) morfométrica de células sedentos por 48 horas. As células foram colocadas em microscopia completa de vídeo de mídia e lapso de tempo foi iniciado após a transferência em HBSS. As células viáveis ​​são definidas como células aderentes, as células apoptóticas são definidas como células que exibem várias vesículas de membrana, a morte por perda de integridade osmótica é definido como células que apresentam o inchaço de uma única bolha, e células de estase são definidas como células que foram isoladas a partir do substrato mas manter a integridade da membrana plasmática. Um mínimo de 700 células foram analisadas sobre experiências em triplicado. Barra de escala: 50 ^ m. (B) Western blot mostrando a activação de caspase 3 e Atg5-Atg12 conjugado em extractos de células inteiras a partir de células em jejum durante os tempos indicados. (C) As células não aderentes HCT116-BaxKO de 24 horas de fome culturas foram recolhidas e transferidas para meio completo. As células foram deixadas aderir durante 6 horas, em seguida, microscopia vídeo lapso de tempo foi iniciada durante 48 horas. Barra de escala:. 100 mm

O autofágica Capacidades de células colorretal HCT116 é independente da Bax

O experimento anterior sugeriu que quando as células pode executar tanto a apoptose e autofagia, fenótipos apoptóticos prevalecer sobre características autofágicos. Fomos, portanto, preocupado com a possibilidade de que a resposta autofágica poderia realmente ser prejudicada pela execução de apoptose. Para resolver esta questão, comparamos a capacidade autofágica de células HCT116 e HCT116-BaxKO sob condições onde macroautofagia é a forma predominante de degradação de proteínas, ou seja, após 6-9 horas de inanição [34]. FIG. 2A mostra a degradação de L – [

14C] proteínas de longa duração rotulados-valina. A proteólise basal medida em condições de controlo foi comparável em ambas as linhas de células e, respectivamente, definido como referência interna (barras brancas). A inanição semelhante resultou num aumento de duas vezes a proteólise em ambas as linhas celulares (barras pretas). Esta proteólise era (i) essencialmente lisossomal desde bafilomicina A1 (Baf A1, um inibidor de bomba de protões lisossomal ATPase) preveniu completamente seus potencialização (barras cinza escuro), e (ii) associado com autofagia desde a sua estimulação foi significativamente revertida por 3-MA (barras cinza claro). Como um controle, uma indução de apoptose por etoposídeo em relação ao mesmo período de tempo não estimulou qualquer proteólise (barras tracejadas). Nós também ensaiada a conversão de Atg8 citosólica /LC3-I no ligados a fosfatidiletanolamina autophagosome conjugado LC3-II, que é uma das marcas do autofagia. Western blot (Fig. 2B) confirmou que HCT116 e HCT116-BaxKO ambos produzidos quantidades comparáveis ​​de LC3-II sobre a fome. A citosólica difusa da localização pontuada de mCherry-LC3, também foi monitorada em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) como uma linha de células alternativa, e mostrou que a fome desencadeada a mesma relocalização autophagosomal de LC3 em MEFs de tipo selvagem e Bax bateu-out MEFs (Fig . S1). Tomados em conjunto, os nossos ensaios mostram que a execução da apoptose não compromete a resposta autophagic, e conclui-se que a capacidade autophagic é independente da Bax

células HCT116 e HCT116-BaxKO (A) foram incubados com L -. [

14C] valina, e perseguido por 9 horas em meio completo (barras brancas), HBSS (barras pretas) ou HBSS suplementado ou com 0,1 mM Baf A1 (barras cinza escuro), ou 10 mM de 3-MA (cinza claro bares), ou em meio completo 20 mM etoposídeo (barras tracejadas). Os resultados relatam a estimulação da proteólise em relação aos respectivos níveis basais medidos sob condições de não-fome (barras brancas). Os valores são as médias de pelo menos 3 experiências independentes ± S.D. (B) Western Blot e quantificação da conversão de LC3-I em fosfatidiletanolamina-conjugado LC3-II. As células foram cultivadas em meio completo ou fome durante 9 h na presença de E-64D (20 ug /ml) e leupeptina (20 ng /ml) para evitar a degradação da pressão intra-autophagosomal LC3-II. 150 ug de lisado de células inteiras foram carregados em 15% SDS-PAGE. * Teste de Student p . 0,02

A expressão ectópica de Bcl-2 e Bcl-xL, mas não Mcl-1, estimula a autofagia

O último resultado desde aterramento para o nosso resolução de usar a apoptose deficiente subclone HCT116-BaxKO para tratar a regulação da autofagia pró-sobrevivência por proteínas anti-apoptóticas, ao mesmo tempo que separa a contribuição dos membros da família Bcl-2 para a apoptose. células HCT116-BaxKO foram transfectadas com plasmídeos codificando quer Bcl-2, Bcl-xL ou Mcl-1, resultando respectivamente em 9, 2 e 3 aumento de proteína de dobragem (Fig. 3A). A fome não modificar os perfis de expressão (Fig. S2). microscopia de vídeo de células esfomeados mostrou que a sobre-expressão de Bcl-2 e Bcl-xL aumentou significativamente o número de células que entram no estado autophagic estase (Fig. 3B, respectivamente, 88% e 82%), ao passo que Mcl-1 sobre-expressão aumentada em vez do número de células viáveis ​​aderentes (Fig. 3B, barra branca = 48%). Assim, a Bcl-2 e Bcl-xL claramente teve um efeito diferente de Mcl-1 em autofagia. Isto foi confirmado por proteólise autophagic (Fig. 3C) e microfotografias electrónicas de transmissão (TEM) em que as vesículas de degradação foram mais abundantes nas células que expressam Bcl-2 e Bcl-xL, enquanto aqueles que expressam Mcl-1 permaneceram como células não transfectadas (Fig. 3D, e a Fig. S3 para ampliação); de nota, ocasionalmente, vacuolização vasta apareceu no citoplasma de células que sobre-expressam Bcl-XL (Fig. 3D, painel esquerdo). Quando utilizado BaxKO MEFs e monitorizada mCherry-LC3 padrão de fluorescência, verificou-se que a relocalização da proteína para estruturas puntiformes foi significativamente estimulada em Bcl-2 ou Bcl-xL de células transfectadas (Fig. 3E), mostrando assim que o fenómeno foi conservada em alternativa uma linha celular. Todas as técnicas padrão de ouro utilizados até agora por unanimidade mostrou que apenas as vesículas autofágicos (EVA) são afectadas por Bcl-2 ou Bcl-xL sobre-expressão, enquanto outras vesículas lipídicas como organismos multi-vesiculares não são; portanto, usamos monodansylpentane (MDH) [35] (um corante lipof�ico que já provou AVs mancha [36]) para executar análises assistidas por computador de AVs, medir o seu tamanho e determinar a respectiva frequência de detecção (Fig S4.): Starved células HCT116-BaxKO transfectadas com Bcl-2 ou Bcl-x revelou um aumento do número de AVs, correlacionado com um aumento da frequência de aparecimento de AVs maiores, alguns sendo duas vezes maior que autofagossomas clássicos como confirmado por TEM ocasional. Pelo contrário, Mcl-1 transfectadas não foram estatisticamente diferentes das células não transfectadas. Daí conclui-se que, enquanto que Mcl-1 não desempenha um papel essencial na autofagia sobrevivência, Bcl-2 e Bcl-xL estimular especificamente a capacidade autophagic e aumentar o número e tamanho AVs.

Western blots (A) de células transfectadas com um vector vazio, ou os vectores que codificam para Bcl-2 ou Bcl-xL ou Mcl-1. 50 ug de extractos proteicos foram analisados ​​em um 12% de SDS-PAGE. Mcl-1 foi detectada como uma proteína madura (m), uma variante de splicing (s) e um produto de clivagem de caspase-(c). (B) Análises morfométricas de linhas estáveis ​​de células HCT116-BaxKO-derivados: As células foram plaqueadas em meio completo e microscopia de vídeo de lapso de tempo iniciado quando as células foram transferidas para HBSS (de fome) ou não (completar). Um mínimo de 700 células foram analisados ​​em experiências de, pelo menos, em triplicado. (C) a estimulação relativa de degradação 3-MA-sensível induzida por inanição de proteínas de longa duração em linhas de células HCT116-BaxKO transfectadas ou não com Bcl-2 ou Bcl-XL ou Mcl-1. As células foram perseguidos por 6 horas em HBSS ou HBSS + 3-MA. A actividade sensível 3-MA medida em células HCT116-BaxKO foi fixado em 1 e os resultados representam as actividades sensíveis 3-MA de cada linha celular em relação ao encontrado em células não transfectadas. Os dados são a média (± D.P..) De pelo menos 3 experiências independentes. teste de Student foi usado para significância estatística dos resultados em comparação com as células não transfectadas: (*) p = 0,010 (**) p = 0,001 e (***) p = 0,479. (D) MET de células HCT116-BaxKO sobre-expressão de Bcl-2 ou Bcl-XL ou Mcl-1 após 6 horas de jejum, em HBSS. As setas indicam a autofagossomas de degradação. Barra de escala: 2 uM. (E) 24 h após a transfecção, quer sozinho com mCherryLC3, ou com mCherryLC3 e Flag-Bcl-xL ou Bcl-Flag-2, células MEF BaxKO cultivadas em meio completo ou em jejum durante 6 horas foram corrigidos. Immonocytochemistry revela construções Flag-tag (verde). As imagens são representativos de pelo menos 4 expericias independentes. Barra de escala:. 10 um

Down-Regulamento de Bcl-XL é um inibidor mais potente da autofagia do que a Bcl-2

A seguir, explorou o efeito de Bcl-2 e Bcl-xL regulação negativa em comparação com a de células em Atg7 esfomeados. Uma multiplicidade de infecção (MOI) de 4 causado, pelo menos, um silenciamento de 90% dos genes-alvo (Fig. 4a), sem qualquer efeito cruz umas sobre as outras (não mostrado). Durante o período da experiência, a viabilidade das células transduzidas manteve-se em valores de controlo ( 90%, dados não apresentados) quer em meio completo ou após a inanição 6h. TEM mostraram que a dupla membrana vesículas ligadas foram apenas detectável em células em jejum, em que a Bcl-2, Bcl-xL ou Atg7 havia sido regulada para baixo, em comparação com as células transduzidas SCR (Fig. 4B). O plasmídeo utilizado para transduzir a shRNAs codifica a proteína verde fluorescente (GFP) e que pode assim correlacionar a eficiência de infecção com a resposta autophagic revelado por mCherryLC3 localização (Fig. 4C). Após a fome, as células que indica um elevado grau de transdução com shAtg7 (células altamente positivas para GFP) apresentaram uma distribuição difusa citosólica de mCherryLC3 mostrando que autofagia foi prejudicada de forma eficiente, enquanto que as células não transduzidas exibida ponteada organização mCherryLC3. Em consonância, as células morreram de fome em que shBcl-2 ou shBcl-xL foi eficiente transduzidas apresentaram uma coloração mCherryLC3 difusa, embora shBcl-xL reproducibly provocou um fenótipo inibidor mais forte do que shBcl-2. Assim, a Bcl-2 ou Bcl-xL regulação negativa tinha um efeito inibidor sobre a autofagia, no entanto esta experiência pode indicar que a Bcl-2 e Bcl-xL, pode não ser completamente redundante para o controlo molecular de autofagia sobrevivência. Numa tentativa de quantificar uma tal diferença, finalmente ensaiadas proteólise induzida pela inanição de células transduzidas shRNAs: para uma MOI de 4, Bcl-2 de células knocked-down retidos 75% da proteólise sensível 3-MA, em comparação com uma precipitação shRNA (SCR). Este planalto já foi atingido com um MOI de 2 e manteve-se inalterada mesmo para MOI mais elevados (não mostrados). Em contraste, a Bcl-xL e Atg7 silenciamento diminuiu a taxa de degradação respectivamente a 15 e 17% (Fig. 4D). Assim, a Bcl-2 e Bcl-xL knock-down ambos teve um efeito inibidor sobre a proteólise autophagic convincente. No entanto, apenas a Bcl-xL sub-regulação de que imitou Atg7 e provou ser uma chave de controle molecular autofagia.

(A) Western blots de células HCT116-BaxKO infectadas com quantidades crescentes de partículas virais de transdução shRNA contra Bcl 2, Bcl-xL ou Atg7, ou um shRNA mexidos (SCR). extractos de proteína total foram realizadas, e 50 ug de proteínas foram analisadas em SDS-PAGE. (B) Células HCT116-BaxKO infectadas com as partículas virais portadoras shRNA contra Bcl-2, Bcl-xL ou Atg7 com uma MOI = 4 foram analisadas para a degradação de proteínas autophagic durabilidade logo após a infecção. As células foram perseguidos por 6 horas em HBSS ou HBSS + 10 mM de 3-MA. actividade sensível 3-MA medida em células SCR-infectados foi definido como 100%, e os resultados representam as 3-MA actividades sensíveis de cada linha de célula infectada em relação ao encontrado em células infectadas por SCR. Os dados são a média (± D.P..) De pelo menos 3 experiências independentes. Quando o erro não é indicada, bar era pequeno demais para ser visto. células (C) HCT116-BaxKO estavelmente transfectadas com mCherryLC3 foram infectadas com as partículas virais portadoras shRNA contra Bcl-2, Bcl-xL ou Atg7 com uma MOI = 4. As células foram analisadas quanto à sua fluorescência da GFP (células infectadas) e relocalização LC3 após seis horas de inanição. Barra de escala: 15 ^ m. (D) TEM após 6 horas de inanição de células HCT116-BaxKO onde Bcl-2 ou Bcl-XL ou expressão Atg7 foi silenciada. Barra de escala:. 2 um

Bcl-xL Regula Survival Autophagy Independentemente do beclin 1 |

Estudos relatando funções anti-autofágicos de Bcl-2 e Bcl-xL retratam condições em que estimularam a autofagia resultou na morte de células, e mostraram que a sua ligação ao beclin 1 bloqueou o aparecimento de autofagia. Pelo contrário, Zeng et al. informou que em não-fome U-251 células de glioblastoma, nem Bcl-2 nem Bcl-xL eram entidades ligantes endógenos normais para beclin 1 [27], o que sugere que, dependendo das configurações, essas proteínas não são obriga parceiros.

Em nosso paradigma de autofagia citoprotetora, endógena beclin 1 foi imunoprecipitada a partir de controlo ou lisados ​​celulares esfomeados (Fig. 5a). Bcl-2 foi eficientemente puxada para baixo, mas não Bcl-xL; de nota, Bcl-2 /beclin 1 associação não variou em Starved contra células controle. A imunoprecipitação inverso de endógena de Bcl-2 confirmou estas observações, enquanto a Bcl-xL falhou novamente para puxar para baixo qualquer beclin detectável 1. Estas experiências apoiam uma regulação diferencial de autofagia pró-sobrevivência de Bcl-2 e Bcl-xL, mas mais experiências foram necessários para verificar que Bcl-xL agiram independentemente da beclin 1. fracionamento subcelular demonstraram que com exceção da porção mitocondrial de Bcl-2, quantidades substanciais de Bcl-2 e beclin 1 sobreposição em frações leves, e em maior sintonia com a PI, nenhum destas proteínas alteradas localização no controle ou células famintas. Em contraste, a Bcl-xL foi detectada ao longo de todo o gradiente em células de controlo e foi relocalizados para fracções muito leves em células em jejum; dado o número de compartimentos em que Bcl-XL é presente, é razoável supor que ele pode interagir com muitos parceiros, e isto pode explicar o fato de que beclin 1 não é encontrado como seu principal parceiro interagindo através de experimentos IP. confocais análises mostraram que a Bcl-xL de co-localizada com o ATP1 proteína de membrana interna mitocondrial no controlo e na fome células (Figura 5C.); portanto, as frações leves de hospedagem Bcl-xL em células famintos estão nas imediações das mitocôndrias.

(A) Co-imunoprecipitação de beclin endógena 1 com endógena Bcl-2 e Bcl-xL em HCT116-Bax células KO cultivadas em meio completo ou fome durante 6 horas. (B) fraccionamento subcelular das células HCT116-Bax KO cultivadas em meio completo ou em jejum durante 6 horas. As células foram quebradas com um homogeneizador de Dounce, os sobrenadantes pós-nucleares foram carregados no topo de um gradiente de sacarose de 10-55% contínuo durante a noite ultracentrifugação. As fracções de 500 ul foram colhidas, e proteína total precipitado. O mesmo volume de cada fracção foi separada em uma Tris-Tricina SDS-PAGE 14%. Ocidentais-blots foram como descrito na secção de métodos. (C) imunocitoquímica, em endógena de Bcl-xL e ATP1 em células HCT116-BaxKO cultivadas em meio completo ou fome durante 6 horas.

Porque as experiências de IP mostrou uma interacção entre a Bcl-2 e 1 mas foram beclin inconclusivos para Bcl-xL e beclin 1, nós finalmente decidiu criar uma última série de experimentos para explorar ainda mais as diferenças funcionais entre Bcl-2 e Bcl-xL e sua dependência de beclin 1. Analisamos a autofagia em células sobre-expressando beclin 1 ou a mutantes de BH3 beclin 1

F123A e beclin 1

125A que, respectivamente, solto ou conservam a sua ligação a Bcl-2 e Bcl-xL, [19], [37] (níveis de expressão de proteína são apresentados na Fig. S5 ). Fig.6a mostra que, conforme esperado, beclin uma expressão ectópica estimulada autophagic proteólise induzida pela inanição. Uma tal característica foi estritamente dependente de um domínio funcional de BH3 (isto é, capaz de interagir com BH1-BH2 contendo parceiros) desde beclin 1

125A imitou a proteína de tipo selvagem, enquanto beclin 1

F123A foi completamente incapaz de desencadear autofagia. Os mutantes BH1 de Bcl-2 e Bcl-xL (isto é, a Bcl-2

G145A ou Bcl-xL

G138A), que tanto solta a sua interacção com o domínio BH3 dos beclin 1 [19], [24] eram reciprocamente analisados. Os níveis de super-expressão em células HCT116-BaxKO foram semelhantes aos de ectópica de Bcl-2 e Bcl-xL (Fig. S2). Impedindo a ligação de Bcl-2 para um beclin revogada completamente a estimulação de proteólise observada autophagic com Bcl-2 nativo. TEM confirmou que a quantidade e o tamanho das vesículas autofágicos em Bcl-2

células G145A expressando eram muito diferentes de Bcl-2 de células que expressam, e foram, de facto comparável com as células não transfectadas (comparar Fig. 3D e a Fig. 6B direita). Portanto, as funções de Bcl-2 pró-autofágicos inteiramente contar com a ligação de um parceiro contendo BH3 (provavelmente beclin 1 de acordo com experiências de IP e com os dados obtidos com proteólise beclin 1

F123A). Em contraste, a Bcl-xL

G138A ainda retida uma ligeira capacidade de estimular a degradação autophagic, embora foi muito menos eficiente do que a sua contrapartida nativa (Fig. 6A). TEM indicou que Bcl-xL

G138A estimularam a síntese de AVs tão eficientemente como Bcl-xL (compare Fig. 6B deixado com Fig. 3D). Relocalização de mCherry-LC3 em BaxKO-MEFs transfectadas com Bcl-xL

G138A confirmou esta observação (compare Fig. 6C com a Fig. 3E). Colocalisation de LC3 e Lamp1A em células HCT116 BaxKO esfomeados que expressam Bcl-xL ou Bcl-xL

G138A mostrou que as vesículas continham autofágicos ambos os marcadores, e, consequentemente, representam autofagossomas degradativas. Portanto, a mutação do local de ligação a Bcl-xL de BH3 resultou numa via autophagic estruturalmente intacta, mas funcionalmente deficiente. Este conjunto de dados indicam que AVs de degradação são formados em Bcl-xL

G138A mas mais experimentos são necessários para explicar por que essas AVs são menos funcional do que em células que expressam Bcl-XL. A comparação da quantidade de Atg5-Atg12 conjugado em células não transfectadas ou em células que expressam Bcl-xL ou Bcl-xL

G138A não conseguiram identificar qualquer diferença, o que indica que o passo de conjugação não limitativo e não pode ser ainda estimulada pela Bcl expressão xL (Fig. S6). experimentos futuros terá como objectivo comparar a cinética de AVs de maturação em Bcl-xL

células G138A expressando Bcl-xL e. Como conclusão, Bcl-2 e Bcl-xL exibem uma dependência diferencial sobre beclin 1 exibem suas funções pró-autofágicos. Enquanto Bcl-2 baseia-se totalmente na sua ligação a beclin 1, Bcl-xL não controla a formação de autofagossomas através beclin 1, e nós propomos que uma proteína que usa o domínio BH3 de ligação ajuda a Bcl-xL estimular uma via autophagic funcional.

(a) estimulação relativa de degradação 3-MA-sensível induzida por inanição de proteínas de longa duração em linhas de células HCT116-BaxKO transfectadas ou não com Bcl-2, Bcl-2

G145A, Bcl xL, Bcl-xL

G138A, beclin 1, beclin 1

F123A ou beclin 1

I125A. As células foram perseguidos por 6 horas em HBSS ou HBSS + 3-MA. Os resultados representam as actividades sensíveis 3-MA de cada linha celular em relação ao encontrado em células não transfectadas. Os dados são a média (± D.P..) De pelo menos 3 experiências independentes. teste de Student foi usado para significância estatística dos resultados em comparação com as células não transfectadas; os valores de p não indicados no gráfico são p 0,01. (B) TEM de células HCT116-BaxKO transfectadas com Bcl-xL

G138A (esquerda) ou Bcl-2

G145A (à direita) após 6 horas de inanição. Barra de escala: 2 uM. (C) 24 horas após a co-transfecção de mCherryLC3 com a bandeira-Bcl-xL

G138A, MEFs BaxKO cultivadas em meio completo ou morreram de fome durante 6 horas foram corrigidos. Immonocytochemistry revela construções Flag-tag (verde). As imagens são representativos de pelo menos 4 expericias independentes. Barra de escala: 10 ^ m. células (D) HCT116BaxKO que sobre-expressam Bcl-xL ou Bcl-xL

G138A foram transfectadas com mCherryLC3 e mEGFP-Lamp1A. Após 6 h de fome, as células foram fixadas e observou com um objetivo de 100x. (Barra de escala: 5 mm)

Discussão

As bases moleculares para prever o citoprotetora ou a pro-