Abstract
Introdução
O câncer colorretal é um tumor maligno comum. Identificação de marcadores prognósticos genéticos podem ajudar a estimativas de prognóstico no câncer colorretal. Os genes que regulam a resposta à hipóxia, e outros genes que são regulados nas condições hipóxicas foram mostrados para desempenhar papéis na progressão do cancro. Neste estudo, a hipótese de que variações genéticas nos genes da via de hipóxia foram associados com o risco de desfecho em pacientes com câncer colorretal.
Métodos
Este estudo foi realizado em duas fases. Na primeira fase, 49 SNPs de seis genes da via hipóxia (
HIF1A
,
HIF1B
,
HIF2A
,
LOX
,
MIF
e
CXCL12
) em 272 pacientes com câncer colorretal foram analisados. Na segunda fase, 77 SNPs de sete genes da via hipóxia (
HIF1A
,
HIF1B
,
HIF2A
,
HIF2B
,
,
LOX
e
CXCL12
) foram analisados em um conjunto adicional de 535 pacientes. Kaplan Meier, análises de regressão uni e multivariada de Cox foram realizadas para analisar a relação entre os SNPs e sobrevida global (OS), sobrevida livre de doença (DFS) ou sobrevida específica da doença (DSS). Uma vez que este foi um estudo gerador de hipóteses, nenhuma correção foi aplicada para testes múltiplos.
Resultados
Na fase I, um SNP (
HIF2A
rs11125070) foi encontrado para ser associado com DFS na análise multivariada; ainda associação de um polimorfismo proxy (
HIF2A
rs4953342) não foi detectado no grupo de pacientes de fase II. Na fase II, as associações de dois SNPs (
HIF2A
rs4953352 e
HIF2B
rs12593988) foram significativos em ambos OS e análise multivariada DFS. No entanto, a associação de
HIF2A
rs4953352 não foi replicado na fase I de coorte usando um SNP proxy (
HIF2A
rs6706003).
Conclusão
No geral, nosso estudo não encontrou um evidência convincente de associação dos polimorfismos investigados com os resultados da doença em câncer colorretal
Citation:. Haja Mohideen AMS, Hyde a, Squires J, Wang J, Dicks E, Younghusband B, et ai. (2014) Examinando os polimorfismos nos genes hipóxia Caminho em relação ao desfecho no câncer colorretal. PLoS ONE 9 (11): e113513. doi: 10.1371 /journal.pone.0113513
editor: Armin Gerger, Medical University of Graz, Áustria
Recebido: 25 de fevereiro de 2014; Aceito: 29 de outubro de 2014; Publicação: 18 de novembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Haja Mohideen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Research e Development Corporation of Newfoundland (RDC; Ignite fundo para SS: número do contrato: 5404.1201.101 e fundo de alavancagem para SS, RG, PP: número do contrato: 5404.1201.102), o Instituto canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR ) fundo de maneio (a SS, RG, PP; FRN: 110045), a Fundação de Pesquisa médica (MRF) COX Award 2010 (a SS e RG), fundo de CIHR para a Equipa de Investigação de Saúde colorectal Cancer Interdisciplinar da Universidade de Toronto e Universidade Memorial, o National Cancer Institute of Canada (concede 18223 e 18226) e do Fundo de Inovação Atlântico pela Equipa de Investigação Interdisciplinar em Genética Humana. Angela Hyde foi apoiado pelo Walter e Jessie Boyd Charles Scriver MD /PhD Studentship Award (Canadian Institute of Health Research Institute de Genética e da Fundação Canadense Gene Cure). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Por favor note que SS autor é um editor acadêmico para PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para PLoS ONE políticas e critérios editoriais. Nenhum dos outros autores têm qualquer conflito de interesses para relatar.
Introdução
A hipoxia é uma condição caracterizada por baixos níveis de oxigênio. células de tumores sólidos podem experimentar condições de hipóxia, devido à diminuição do fluxo sangüíneo. Enquanto isto pode causar a proliferação celular reduzida ou morte, em algum momento ele também ajuda as células a se adaptar às condições de hipóxia, alterando seu metabolismo energético da via de fosforilação oxidativa via glicólise. Tais alterações influenciar a expressão de genes indutíveis por hipoxia e o resultado do tratamento em pacientes com cancro. Além disso, condições hipóxicas foram implicadas para promover a replicação do ADN, angiogénese e invasão do tumor e o potencial metastático. Todas essas mudanças facilitar a progressão do tumor e pode afetar negativamente o resultado paciente. Estes e outros papéis de condições hipóxicas em progressão do tumor e os resultados têm sido extensivamente revisto por muitos na literatura (por exemplo, [1], [2]).
sob condições hipóxicas, células activar mecanismos moleculares específicos por cima -Regulamentação ou para baixo-regulação da expressão de certos genes. Isto é facilitado pelos factores indutíveis por hipoxia (HIFs). HIFs são factores de transcrição heterodiméricas constituídos por subunidades a e p. Nos seres humanos, há três HIF-α (HIF-1α, HIF-2α e HIF-3α) e duas HIF-β (HIF-1β e HIF-2β). Cada uma destas subunidades é codificada por genes distintos (
HIF1A
,
ARNT
/
HIF1B
,
EPAS1
/
HIF2A
,
ARNT2
/
HIF2B
, e
HIF3A
). HIFs se ligam a elementos responsivos a hipoxia (HREs) ao longo dos genes regulados por hipóxia para regular sua expressão. Estes genes indutíveis por hipoxia incluem genes que funcionam no crescimento celular, metabolismo, resposta a danos no ADN, angiogénese e metástases (revisto em [2], [3]). Além disso, HIFs também activar os genes que funcionam em mecanismos celulares que levam a resistência a terapias anti-cancro convencionais (revisto em [3]).
Entre os genes regulados pelos HIFs são a lisil-oxidase (
LOX
) [4], o fator inibidor da migração de macrófagos (
MIF
) [5] e CXC motivo de quimiocinas 12 (
CXCL12
) [6].
LOX codifica para uma enzima que ajuda a manter a integridade estrutural do tecido conjuntivo e tem sido identificada como um factor crítico da metástase induzida por hipoxia em tumores da mama humanos [7]. MIF é conhecido predominantemente como uma proteína do sistema imunitário, ainda em linhas celulares de cancro do cólon que promove a apoptose impulsionado por hipoxia [8]. CXCL12 é outra proteína conhecida principalmente para o seu papel no sistema imunitário, no entanto, tem sido demonstrado para influenciar a morte de células tumorais e reduzir o risco de metástase em linhas celulares de tumor colorectal [9].
cancro colorectal é um comum câncer nos países desenvolvidos. No Canadá, de acordo com as Estatísticas-2012 Canadian Cancer Society, é uma das principais causas de mortalidade relacionadas ao câncer [10]. marcadores actualmente estabelecidas são insuficientes para a previsão precisa do prognóstico em pacientes com câncer colorretal. Portanto, a identificação de novos marcadores prognósticos podem ajudar melhorar os modelos de prognóstico, que por sua vez pode ajudar a melhorar os resultados de sobrevivência de pacientes com câncer colorretal. Neste estudo, a hipótese de que as variações genéticas no interior dos genes seleccionados da via de hipoxia está associada com o risco de resultados em pacientes com cancro colo-rectal. Para testar a nossa hipótese, realizamos este estudo em duas fases: Na fase I, nós nos concentramos em três genes codificadores de HIF (
HIF1A
,
HIF1B
, e
HIF2A
) e três genes regulados sob as condições de hipóxia (
LOX
,
MIF
, e
CXCL12
) e investigou a relação de seus SNPs (n = 49), com os resultados em um pequeno grupo de pacientes com câncer colorretal (n = 272). Na fase II, nós nos concentramos em cinco genes codificadores de HIF (
HIF1A
,
HIF1B
,
HIF2A
,
HIF2B
e
) e dois genes de hipóxia-inducible (
LOX
e
CXCL12
) e investigou a relação de seus SNPs (n = 77), com o risco de resultado em um câncer colorretal coorte adicional do paciente (n = 535)
Materiais e Métodos
O projeto de pesquisa foi realizada em duas fases:. fase I e fase II. Fase II foi iniciado após a conclusão da fase I quando os dados do genótipo em larga escala para um grupo maior de pacientes foi obtido pelo nosso grupo como parte de um outro projecto. Como ilustrado na Figura 1, existem diferenças entre a fase I e fase II em termos de genes, SNPs e coortes de pacientes investigados.
declaração Ética
exigência de consentimento do paciente foi dispensado pelo o comitê local REB (Comitê de Investigação Humana (HIC) da Memorial University; recentemente renomeado como Autoridade a Saúde Ética em Pesquisa (HREA)) para os pacientes em fase I. foi obtido consentimento escrito de ambos os pacientes ou seus familiares (em caso de pacientes falecidos) na coorte de fase II. Durante este estudo, todos os dados relacionados com o paciente foi investigada de forma anónima. Este estudo particular, também foi aprovado pelo HIC.
As amostras do estudo
a) Fase I de coorte.
A primeira coorte consistiu de 280 pacientes e foi descrito em detalhe anteriormente [11 ]. Estes pacientes foram diagnosticados com câncer colorretal entre 1997-1998 na península Avalon, Newfoundland. Paciente nesta coorte foram acompanhados até 2009. Para este projeto, amostras de DNA de 272 dos pacientes estavam disponíveis para as reacções de genotipagem.
b) Fase coorte II.
O segundo grupo é um sub-grupo de pacientes recrutados para o Registro de Câncer Colorretal Newfoundland (NFCCR). A coorte NFCCR foi recrutado entre 1999 e 2003 e descrita em outras publicações [12], [13]. Na coorte NFCCR, existem 736 pacientes com tumores fase I-IV e com dados clínico-patológicos e prognósticos recolhidos até 2010 [11]. Entre esses pacientes, um total de 535 pacientes com genótipos disponíveis obtidos pelo método genoma SNP genotipagem (
veja abaixo
) foram incluídos nesta fase do projeto.
Seleção de genes
a) Fase I.
Seis genes da via hipóxia (
HIF1A
,
HIF1B
,
HIF2A
,
LOX
,
MIF
e
CXCL12
) foram selecionados.
b) fase II.
Na fase II deste projecto, o nosso principal objectivo foi investigar as associações de polimorfismos dos genes selecionados na fase I (
HIF1A
,
HIF1B
,
HIF2A
,
LOX
,
MIF
e
CXCL12
) em uma coorte maior de pacientes. Tirando proveito da disponibilidade de genótipos, também teve como objetivo incluir dois genes codificadores de HIF adicionais (
HIF2B
e
HIF3A
) nesta fase.
Seleção de SNPs
a) Fase I.
a fim de evitar redundância na polimorfismos investigados, seguimos uma abordagem que envolvia o cálculo de coeficientes de correlação (r
2) entre os genótipos de polimorfismos por gene; a partir desses SNPs que foram altamente correlacionadas com cada (r
2≥0.8), apenas um representante SNP foi incluído no estudo.
Para este fim, para cada gene incluídos neste estudo os dados de genótipos para as amostras caucasianos foram transferidos do banco de dados HapMap [14] antes do início do projeto, que foram utilizados para construir mapas de desequilíbrio de ligação dos genes usando o software Haploview [15]. r
2 valores foram calculados e tagSNPs foram determinadas usando o pegador pares procedimento [16] implementado em Haploview. Ambos os tagSNPs e SNPs que não são marcadas pelos tagSNPs foram destinadas a serem incluídos para ter uma análise completa de cada gene. Na fase I, total de 49 desses SNPs foram genotipados com sucesso utilizando esta abordagem (Tabela S1 no arquivo S1). Entre os 49 SNPs,
HIF2A
rs2346175 polimorfismo teve 15% dos dados em falta e três polimorfismos (
HIF1B
rs3738483,
HIF2A
rs6753127 e
HIF2A
rs11687512) tiveram freqüências alélicas menores (Mafs). 10% na fase I coorte
b) fase II
Oitenta e um SNPs foram selecionados a partir dos genes da via de oito hipóxia usando o. abordagem descrita na fase I. a partir dos SNPs selecionados, quatro SNPs que tiveram um MAF 10% foram excluídos da análise estatística (
HIF1B
rs10305724,
HIF1B
rs3738483,
HIF2B
rs16972160, e
HIF2B
rs1139651), o que resultou em 77 SNPs para ser incluída nessa fase (Tabela S2 no ficheiro S1). Nenhum polimorfismo tinham mais de 15% dos dados de genótipos em falta. Genótipos de não SNP do
MIF
gene estava disponível para este grupo. Assim, um total de 77 SNPs a partir de sete genes (
HIF1A
,
HIF1B
,
HIF2A
,
HIF2B
,
HIF3A
,
LOX
e
CXCL12
) foram incluídos na fase II.
Treze SNPs foram investigados em ambos os grupos de pacientes. Além disso, houve 15 SNPs investigados na fase I que tinha genótipos altamente correlacionada com outros SNPs investigados na coorte de fase II (Tabela S3 no ficheiro S1): os SNPs restantes foram investigadas em qualquer grupo I ou grupo II, mas não em ambas . Desde SNPs com genótipos altamente correlacionadas podem servir como substitutos para o outro, durante este estudo, também verificado (além de SNPs idênticos) se os resultados dos testes estatísticos obtidos para SNPs de proxy em ambos os grupos eram semelhantes em termos de suas associações com o tempos de sobrevivência.
a genotipagem
a) fase I.
Nesta fase, as amostras de DNA foram extraídos de amostras de sangue ou de não-tumor blocos de tecido colorectal obtidos durante a cirurgia . Os genótipos dos 49 polimorfismos incluídos nesta fase do estudo foram obtidos através de qualquer tecnologia Sequenom MassARRAY em uma instalação de terceirização genotipagem (University Health Network Analytical Genetics Technology Centre, no Canadá; n = 35 SNPs) ou in-house ensaios TaqMan SNP genotipagem ( n = 14 SNPs). Para os ensaios de genotipagem tanto MassARRAY e TaqMan SNP, pelo menos 5% dos sujeitos do estudo foram genotipados duas vezes e todos os genótipos obtidos foram 100% concordantes. Cada reacção genótipo também continham controles não-modelo para detectar a contaminação do DNA externo. Essas amostras de DNA que foram fracassadas de ser genotipados por ensaios de genotipagem TaqMan SNP foram tentou ser genotipados duas ou mais vezes, dependendo da disponibilidade de amostras de ADN.
TaqMan SNP genotipagem
ensaios de genotipagem TaqMan SNP foram realizados em placas de 96 reacção bem rápido usando o fast real-Time PCR System ABI 7900HT. Tipicamente, as reacções de genotipagem continha 9 ul de mistura de reacção e 1 ul de amostra de DNA (4 ng /ul). A mistura de reacção consistiu em 5 ul de TaqMan Universal PCR Master Mix (2 ×) (Applied Biosystems PN 4.304.437), 0,25 ul de mistura de ensaio de genotipagem de SNP (20 ×) (específicos para cada SNP) e 3,25 ul de água estéril. Em alguns casos, especialmente aqueles que mostraram fraca amplificação, o volume de reacção foi de 5 ul (contendo ADN de 4 ng); isso foi feito para aumentar as concentrações de ADN em reacções. As identificações do ensaio para os SNPs genotipados por este método são apresentados na Tabela S4 em S1 Ficheiro. Um exame de pré-corrida foi realizada antes do início da amplificação. As condições de reacção de PCR foram as seguintes: a) activação de AmpErase UNG a 50 ° C durante 2 min, b) AmpliTaq Gold de activação da polimerase a 95 ° C durante 10 minutos, e c) 40 ciclos de desnaturação de ADN a 95 ° C durante 15 seg seguido por emparelhamento do iniciador e extensão a 60 ° C durante 1 min. Após a conclusão das reacções, uma varredura pós-corrida foi realizada e os dados foram analisados utilizando o software de detecção de sequências (SDS). Os resultados de genotipagem SDS também foram verificados manualmente chamar os genótipos finais por um de nós (SS).
b) Fase II.
Na Fase II deste projeto, os dados de genótipos do 77 SNPs foram obtidas como parte de um estudo de genotipagem de SNP do genoma inteiro. Genótipos foram obtidos utilizando o Illumina Humano Omni1-Quad Bead Chip em um provedor de serviços (Centrillion Genomic Serviços, EUA), utilizando as amostras de DNA extraídos de amostras de sangue.
Métodos estatísticos
genótipos obtidos foram organizada em folhas Microsoft Excel e as análises estatísticas foram realizadas utilizando o Statistical Package for the social Sciences (SPSS). Antes da análise estatística, todas as variáveis foram verificadas por falta de dados. Além disso, MAFs de SNPs foram calculados e os genótipos foram verificados dos desvios à Hardy Weinberg (HWE). HWE foi calculada utilizando o teste do qui-quadrado. Variáveis que tiveram mais de 15% de dados em falta ou que se afastem do HWE foram incluídos na análise univariada para fins exploratórios, mas foram excluídos da análise multivariada. Os genótipos foram codificados assumindo o modelo genético dominante. Exceto idade, todas as outras variáveis incluídas na análise foram categóricos; idade foi analisada como uma variável contínua
três diferentes medidas de resultado foram utilizados para a análise estatística:. sobrevida global (OS), sobrevida livre de doença (DFS) e doença sobrevida específica (DSS). Para OS, a morte era o ponto final clínico (definida como morte por qualquer causa). Para DFS, a ocorrência de recorrência da doença ou metástase ou morte foi o ponto final clínico. Para DSS, a morte específica por câncer colorretal foi o ponto final clínico. informações DSS estava disponível apenas para a fase I de coorte. Os pacientes que não experimentam o evento de interesse durante o período de acompanhamento, foram censurados na data do seu último acompanhamento.
As curvas de sobrevida foram gerados pelo método de Kaplan Meier. A relação entre cada variável e as medidas de resultado (OS, DFS, DSS) foi analisada individualmente utilizando o método de regressão de Cox na análise univariada. Os valores de p, taxas de risco (HR) e os intervalos de confiança de 95% (IC) para os RHs também foram calculados pelo método de regressão de Cox. Variáveis que foram estatisticamente significativas na análise univariada (p 0,05) foram incluídas nos modelos de regressão de Cox multivariados. As características dos pacientes entre dois grupos de estudo foram comparados utilizando o teste estatístico Qui-quadrado para variáveis categóricas e teste de Mann-Whitney para as variáveis contínuas. Um valor p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo; como esta foi uma análise exploratória nenhuma correção para testes de múltipla foi realizada. Todos os testes foram de dupla face.
Resultados
Fase I
As características iniciais da fase I coorte são apresentados na Tabela 1. Nesta coorte (n = 280), o média de idade no momento do diagnóstico foi de 68,4 anos (variação: 25,3-91,6), o oS mediana e DSS tempo de seguimento foi de 5,3 anos (variação: 0-12.5 anos) eo DFS mediana do tempo de seguimento foi de 3,4 anos (intervalo: 0-12,5 anos).
Dentre 49 polimorfismos investigados nesta fase, as freqüências genotípicas para sete SNPs (
LOX
rs10040971,
HIF1B
rs10847,
CXCL12
rs2236534,
CXCL12
rs2236533,
CXCL12
rs11592974,
HIF2A
rs9973653 e
HIF2A
rs4145836) desviou HWE (Tabela S1 no arquivo S1 ). . Estes SNPs foram incluídos na análise univariada para fins exploratórios
Na análise univariada para a sobrevida global, três SNPs foram encontrados para ser significativamente associada (p 0,05) com o resultado:
LOX
rs10519694 (p = 0,046; HR = 0,735; IC 95%: 0,543-0,994),
HIF2A
rs11125070 (p = 0,003; HR = 0,616; 95% CI: 0,447-0,848) e
HIF2A
rs1868084 (p = 0,024; HR = 0,678; IC 95%: 0,483-0,950; Tabela S5 em S1 Arquivo). No entanto, em um modelo multivariada, as associações de nenhum desses SNPs permaneceu estatisticamente significativo quando ajustado para idade, grau, estágio e estado MSI (Tabela 2).
Na análise univariada para a sobrevivência específica da doença, a associação de nenhum dos SNPs foram significativas (Tabela S6 em S1 Arquivo)
na análise univariada para sobrevida livre de doença, dois SNPs (
LOX
rs10519694;. p = 0,012; HR = 0,685; 95 % CI: 0,510-0,919 e
HIF2A
rs11125070; p = 0,003; HR = 0,629; IC 95%: 0,461-0,858) foram associados (p 0,05) com o tempo de sobrevivência (Tabela S7 em S1 Arquivo) . Um desses SNPs (
HIF2A
rs11125070) manteve-se estatisticamente significativa na análise multivariada quando ajustado para
LOX
genótipos rs10519694, idade, grau, estágio e status MSI (HR: 0,619, 95% CI: ,446-,859, p = 0,004; Tabela 3)
fase II
Após a conclusão da fase I, um estudo mais abrangente (fase II) foi realizada pela adição. polimorfismos de dois genes mais de codificação HIF (
HIF2B
,
HIF3A
) e investigando suas associações com oS e DFS em um segundo e maior grupo de pacientes.
as características basais da fase II coorte estão apresentados na Tabela 4. na coorte de fase II (n = 535), a idade média era de 61.2 anos (intervalo: 20.7-75.0 anos), o tempo de sobrevida média foi de 6,34 anos (gama: 0,38-10,88 ) eo tempo DFS média foi de 5,98 anos (intervalo:. 0,22-10,88)
de 77 SNPs (Tabela S2 no arquivo S1), freqüências genotípicas de sete polimorfismos desviaram HWE (
HIF2B
rs8041826,
HIF2B
rs7172914,
HIF2B
rs1020398,
HIF2B
rs4778600,
HIF2B
rs8033706,
HIF3A
rs12461322 e
HIF3A
rs11665853); esses SNPs foram incluídos apenas na análise univariada para fins exploratórios
Nesta fase do projeto,
HIF2A
rs4953352 (p = 0,012; HR = 1,596; IC 95%:. 1,107-2,300 ) e
HIF2B
rs12593988 (p = 0,024; HR = 0,690; 95% CI: 0.500-0.952) polimorfismos foram associados com o risco de morte na análise univariada (p 0,05) (Tabela S8 no arquivo S1 ). Na análise multivariada, as associações de
HIF2A
rs4953352 (p 0,001; HR = 2,189, IC 95%: 1,468-3,265) e
HIF2B
rs12593988 (p = 0,009; HR = 0,627; 95 CI%: 0,442-0,890), com sobrevida global permaneceu significativa quando também ajustado para o estado vascular invasão, sexo, fase e estado MSI (Tabela 5)
Na análise de sobrevida livre de doença univariada,
. HIF2A
rs4953352 (p = 0,009; HR = 1,574; IC 95%: 1,122-2,207),
HIF2B
rs12593988 (p = 0,042; HR = 0,736; IC 95%: 0,548-0,988), e
HIF2B
rs8033706 (p = 0,023; HR = 0,704; 95% CI: 0,521-0,953) polimorfismos foram associados com o risco de recorrência, metástase ou morte (p 0,05) (Tabela S9 em S1 Arquivo). Na análise multivariada,
HIF2A
rs4953352 (p 0,001; HR = 1,965; 95% CI: 1,366-2,828) e
HIF2B
rs12593988 (p = 0,017; HR = 0,678; 95% CI : 0,493-0,931) permaneceu significativamente associada com o tempo DFS quando ajustado para sexo, localização, estágio, invasão vascular e estado MSI (Tabela 6). De nota, uma vez que as freqüências genotípicas do
HIF2B
rs8033706 polimorfismo desviou HWE, não foi incluído neste modelo multivariável.
SNPs investigados tanto em fase I e fase II coortes
Um total de 13 SNPs foram investigados em ambos os grupos. Além disso, de acordo com os dados do HapMap, havia 15 polimorfismos investigados na fase I, cujos genótipos foram altamente correlacionados (r
2≥0.8) com 15 outros polimorfismos investigados na fase II (Tabela S3 em S1 arquivo). Nós fundamentado que os SNPs com genótipos altamente correlacionadas podem servir como substitutos para o outro. Estes SNPs de proxy nos levou a verificar se uma associação de um polimorfismo detectado em uma coorte foi replicada no outro grupo.
Para o
HIF2A
rs11125070 polimorfismo associado com sobrevida livre de doença na fase I coorte, a
HIF2A
rs4953342 polimorfismo investigado na coorte de fase II foi um proxy (r
2 0,90). Nossos resultados mostraram que
HIF2A
rs4953342 não foi associada com DFS na coorte de fase II (Tabela S9 em S1 Arquivo). Além disso, para o
HIF2A
rs4953352 polimorfismo que foi detectada a ser associado com ambos os sobrevida livre globais e doença na coorte de fase II, houve um polimorfismo (
HIF2A
rs6706003) genotipados na fase I com genótipos altamente correlacionados (r
2 = 0,87). Da mesma forma, este polimorfismo não foi detectada a ser associada com qualquer OS (Tabela S5 no ficheiro S1) ou DFS (Tabela S7 em S1 Ficheiro) na fase I da coorte.
Não houve SNP de proxy estudados na fase I coorte para o
HIF2B
rs12593988 polimorfismo que detectado como associado com tempos de oS e DFS na coorte paciente II.
as diferenças entre a fase I e fase II coortes em termos de suas características clinicopatológicas
fase I e fase II coortes diferiram significativamente entre si em termos das seguintes características basais: idade: p 0,001, sexo: p = 0,037, grau: p 0,001, invasão linfática: p 0,001, localização : p 0,001 e estágio:. p = 0,018
Discussão
neste estudo, o objetivo foi investigar as associações de variações genéticas de genes selecionados em funcionamento na via hipóxia e o resultado clínico em colorectal pacientes com câncer. Este estudo envolve duas coortes de algum modo diferentes e sobrepostas ainda não idênticos conjuntos de genes e SNPs como representado na Figura 1. Excluindo os 13 SNPs que eram comuns entre a fase I e II, um total de 113 SNPs diferentes foram investigados em qualquer fase I ou fase II.
na fase I do projeto, 49 SNPs de seis genes na via hipóxia e sua relação com desfecho no grupo de pacientes foi analisado utilizando três diferentes medidas de resultado (oS, DFS e DSS). Nossos resultados mostraram que não houve associação desses polimorfismos com OS ou DSS nesta coorte. No entanto, um SNP frequente localizada na região de mRNA codificante do
HIF2A
gene (rs11125070, NM_001430.4: c.27-21086A T; menor freqüência do alelo: 30,4% na fase I coorte) foi associado com DFS em análise multivariada independente de outros indicadores de prognóstico. Especificamente, os pacientes com os genótipos AT e TT (genótipos contendo o alelo menor T) tiveram ~0.4 vezes diminuição do risco de recorrência, metástase ou morte em comparação com os pacientes com o genótipo AA. No entanto, quando a associação entre um polimorfismo altamente correlacionados investigado na fase II coorte (
HIF2A
rs4953342) foi testada em relação à sobrevivência livre de doença, esta associação não foi detectada na coorte de fase II. Portanto, embora as diferenças entre os dois grupos em termos de suas características clinicopatológicas podem ter contribuído para esta discrepância, considerando o fato de que nenhuma correção para testes de múltipla foi aplicada neste estudo, assumimos que a associação observada na fase I coorte foi um falsa associação positiva.
na fase II do projeto, dos 77 SNPs investigados dois SNPs (
HIF2B
rs12593988 e
HIF2A
rs4953352) foram associados com o resultado em ambas OS e DFS análise multivariada.
HIF2B
rs12593988 (NM_014862.3: C.31 + 8939A G) e
HIF2A
rs4953352 (NM_001430.4: c.27-8490T C) são os dois polimorfismos frequentes (minor alelo frequências de 19% e 49%, respectivamente). Actualmente as suas consequências biológicas são desconhecidos, no entanto, um papel regulador destas variantes em influenciar a expressão ou função do gene não pode ser excluída. Para
HIF2A
rs4953352, outro polimorfismo com genótipos altamente correlacionadas (
HIF2A
rs6706003) não foi associada com qualquer sistema operacional ou DFS na fase I de coorte. Não-replicação desta associação pode ser atribuída às diferenças entre as duas coortes ou ao pequeno tamanho da amostra da fase I coorte que pode levar a uma fonte de estudo insuficiente para detectar esta associação. No entanto, se foi aplicada uma correção para o procedimento de testes múltiplos, a associação observada não iria permanecer significativa. Assim, a explicação mais provável é que a associação observada na coorte de fase II foi uma associação falso-positivo
Não houve SNP proxy para o
HIF2B
rs12593988 em nossa coorte I conjunto de dados.; portanto, não fomos capazes de testar sua associação com a evolução das doenças em uma coorte independente.
Atualmente, estuda testar as associações dos polimorfismos dos genes de hipóxia com sobrevida livre globais ou doença no cancro colorectal são bastante raros. Por exemplo, de acordo com o banco de dados dbCPCO [17] e uma pesquisa bibliográfica realizada, a partir de janeiro 2014 apenas quatro estudos analisaram os polimorfismos dos genes investigados neste estudo (
HIF1A
,
ARNT /HIF1B
, e
CXCL12
). O único estudo estudou o
HIF1B
rs2228099 (Val174Val G /C) polimorfismo não encontrou uma associação dela com a sobrevida global em um grupo de pacientes [18]. Além disso, dois polimorfismos do
gene HIF1A
(rs11549465 Pro582Ser C /T [18], [19] e rs11549467 Ala588Thr G /A [19] foram investigadas em relação ao total ou doença gratuitos sobrevivências em outras coortes: no entanto, estes estudos não encontraram uma associação destes polimorfismos com esses resultados em seus grupos de pacientes. Finalmente, um
CXCL12
polimorfismo do gene, G /a em 3′-UTR (rs1801157 G801A), foi examinado em relação ao sobrevida livre de doença em dois estudos publicados. Enquanto em um estudo desse polimorfismo não foi associada a sobrevida livre de doença [20], em outro estudo, foi encontrado para ser associado com a sobrevida livre de doença em ambos os uni e análise multivariada apenas nos pacientes sem linfático metástase [21]. estes achados da literatura mostrar a raridade de pesquisas publicadas incluindo os polimorfismos de nossa lista de genes. Além disso, entre esses polimorfismos previamente investigados, apenas o
HIF1B
rs2228099 polimorfismo foi investigada em nosso estudo ( tanto em fase I e II). Isso indica que, exceto um polimorfismo (
HIF1B
rs2228099), polimorfismos relatados neste manuscrito são investigados pela primeira vez em relação aos resultados de sobrevivência no cancro colorectal.
Nosso estudo tem algumas limitações e pontos fortes . A) Como esta foi uma análise exploratória, a fim de minimizar os resultados falso-negativos que uma correção para testes de múltipla não foi realizada. Devemos notar que nenhuma das associações detectadas neste estudo continua a ser significativo após a aplicação, por exemplo, o teste de Bonferroni para correção. B) O grupo de doentes estudados na fase I foi caracterizada por um tamanho relativamente pequeno da amostra (n = 272) e a fase I e II coortes diferiram significativamente umas das outras em termos de algumas características clinicopatológicas da linha de base. Além disso, a fase II coorte paciente foi inclinado para as fases anteriores, e, assim, não era representativa da coorte NFCCR (dados não mostrados). No entanto, para o nosso conhecimento da fase II coorte (n = 535) também é um dos maiores coortes investigados em tal estudo no cancro colo-rectal. C) Este estudo foi limitado com oito genes funcionando na via hipóxia (
HIF1A
,
HIF1B
,
HIF2A
,
HIF2B
, e
HIF3A
,
MIF
,
CXCL12
, e
LOX
); muitos outros genes desta via não foi investigada.