Abstract

Finalidade

NCIC Clinical Trials Group PA.3 foi um ensaio clínico aleatório, que demonstrou melhora da sobrevida global (OS) em doentes que receberam erlotinib, além de gemcitabina para localmente avançado ou metastático câncer de pâncreas. Antes da terapia, os pacientes tinham amostras de plasma elaborado para o estudo futuro. Procurou-se identificar biomarcadores dentro destas amostras.

Experimental Design by

Usando o ensaio de proximidade ligadura (PLA), um painel sonda foi construída a partir de anticorpos disponíveis comercialmente por 35 proteínas-chave selecionados a partir de uma genética mundial análise dos cancros pancreáticos, e usadas para quantificar os níveis de proteína em 20 uL de plasma do paciente. Para determinar se qualquer um desses níveis proteínas independentemente associados com o OS, uni e modelos de Cox mulitbaraible foram utilizados. Além disso, nós examinamos as associações entre a expressão de biomarcadores e estágio da doença no momento do diagnóstico pelo teste exato de Fisher. A correlação entre a sensibilidade Erlotinib e cada biomarcadores foi avaliada através de um teste de interação entre tratamento e biomarcador.

Resultados e Conclusão

Dos 569 pacientes elegíveis, 480 tiveram amostras disponíveis para estudo. As amostras foram alocados aleatoriamente em formação (251) e conjuntos de validação (229). Entre todos os pacientes, os níveis elevados de interleucina-8 (IL-8), antígeno carcinoembrionário (CEA), fator de hipoxia-inducible 1-alfa (HIF-1 alfa) e interleucina-6 foram independentemente associados com menor OS, enquanto IL 8, CEA, alfa do receptor do factor de crescimento derivado de plaquetas e, mucina-1 foram associados a doença metastática. Os doentes com níveis elevados de receptor de tirosina-cinase de proteína erbB-2 de expressão (HER2) tinha melhorado OS quando tratados com erlotinib em comparação com o placebo. Em conclusão, PLA é uma poderosa ferramenta para a identificação de biomarcadores de amostras de soro arquivadas, volume pequeno. Esses dados podem ser úteis para estratificar os resultados dos pacientes, independentemente da intervenção terapêutica

Registro de Estudos

ClinicalTrials.gov NCT00040183

Citation:. Shultz DB, Pai J, Chiu W, Ng K, Hellendag MG, Heestand L, et ai. (2016) um biomarcador Painel Novel Examinando Resposta a gemcitabina com ou sem Erlotinib para a terapia do cancro do pâncreas em NCIC Clinical Trials Group PA.3. PLoS ONE 11 (1): e0147995. doi: 10.1371 /journal.pone.0147995

editor: Anthony Federação das Índias Ocidentais Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG

Recebido: 24 de setembro de 2015; Aceito: 10 de janeiro de 2016; Publicação: 25 de janeiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Shultz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante estão disponíveis no papel e seus arquivos de suporte de informação de dados

Financiamento:. o financiamento para este estudo foi fornecido pelo meu azul pontos e do Fundo Memorial Ng Sydney. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e os autores deste manuscrito ter a seguinte competindo interesses: GH tem servido como consultor para a Bayer, Merrimack, e Genomic Health. Isto não altera a adesão dos autores para as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

adenocarcinoma ductal pancreático (PDCA) é um tumor maligno agressivo com um prognóstico pobre. Pacientes com diagnóstico de tumores ressecáveis ​​são potencialmente curável, porém localmente avançado (LA) ou metastático PDCA é uniformemente fatal. [1, 2] biomarcadores melhoradas são necessários para refinar a abordagem terapêutica do PDCA avançada e melhorar os resultados

.

Validado biomarcadores de prognóstico em adenocarcinoma ductal pancreático (PDCA) são limitadas. CA 19-9, o biomarcador mais estabelecido para PDCA, tem uma sensibilidade e especificidade para o cancro pancreático de aproximadamente 80% e 90%, respectivamente [3] e em alguns cenários níveis são preditivos de quimioterapia ou radioterapia respostas [4, 5]. No entanto, CA 19-9 pode ser falsamente elevados em doentes com doença obstrutiva do fígado ou pancreatite, e falsamente negativos em pacientes que não dispõem de Lewis-antigénio glicosiltransferase (5-10% da população). Além disso, CA 19-9 níveis fornecem uma visão limitada sobre as funções biológicas do PDCA que possam direcionar a terapêutica sistémica. Portanto, melhores biomarcadores são necessários para orientar a assistência ao paciente.

PA.3 foi um ensaio de fase III randomizado conduzido pelo NCIC Clinical Trials Group, que demonstrou melhora da sobrevida em pacientes tratados com erlotinib mais gemcitabina em comparação com gemcitabina sozinho, em que, expressão EGFR não foi preditiva de uma resposta ao erlotinib [6]. Neste estudo, no pré-tratamento de amostras de plasma de pacientes inscritos em PA.3, buscou-se identificar biomarcadores que estavam prognóstico de sobrevivência, bem como preditivo de uma resposta ao erlotinib.

Métodos

As amostras de plasma foram obtidas de 480 dos 569 pacientes inscritos no NCIC grupo ensaios clínicos (CTG) PA.3 (Clinical.Trials.gov identificador NCT00040183), um duplo cego internacional fase III julgamento de erlotinib (235) versus placebo mais gemcitabina (245) pacientes com adenocarcinoma do pâncreas localmente avançado ou metastático [6]. As amostras foram obtidas no momento do arrolamento. O desfecho primário para este julgamento foi OS. O estudo descrito neste manuscrito foi aprovado pela Research Compliance Office Stanford: IRB # 5136 (protocolo 27492). No momento da inscrição nos PA.3, consentimento informado por escrito do paciente foi obtida e, sob aprovação do nosso próprio escritório cumprimento pesquisa, não obtivemos separado informado por escrito ou consentimento verbal de pacientes para o nosso estudo.

Antes a análise de laboratório, as amostras foram aleatoriamente designados para uma formação (total 251, 129 erlotinib recebido) ou uma validação (total 229, 106 erlotinib recebido) coorte. O ensaio de proximidade de ligação (PLA) [7] foi usada para medir a concentração relativa de 35 proteínas de biomarcadores (Tabela 1). Em breve, PLA conjuntos de sondas foram adicionadas a soro bloqueado e incubou-se a 37 ° C durante duas horas. Em seguida, talas de ADNcs com ligase foram adicionados roboticamente (Velocity11, Agilent Technologies) e incubada a 30 ° C durante 15 minutos. Finalmente, uracilo-ADN mistura Excisão (Epicentre) foi adicionado, e o ADN resultante foi amplificada utilizando PCR com Taq Platinum (Invitrogen) e o produto de PCR foi depois amplificado com iTaq com SYBR (Bio-Rad) utilizando PCR quantitativa (Modelo 7500, Applied Biosystems) para determinar as concentrações relativas de cada potencial biomarcador.

sondas biomarcadores foram desenvolvidos para estudos anteriores e os adicionais foram sintetizados para este estudo. [7, 8] biomarcadores potenciais foram identificados através de um mundial análise genética [9] e consistiu de uma pesquisa bibliográfica abrangente para identificar conjuntos de dados publicados, seguido de uma avaliação sobre se potenciais biomarcadores foram expressos em qualquer superfície da célula ou no plasma, e, finalmente, se biomarcadores foram especificamente elevados no cancro do pâncreas contra pancreatite crônica . Dos potenciais candidatos identificados na referida publicação, 320 foram confirmados para ser excretada e presente em níveis elevados no soro de pacientes. Em seguida, obteve-se um conjunto de dados análise de expressão gênica em adenocarcinoma ductal pancreático da Expressão Gênica Omnibus [10, 11], e depois de identificar os níveis de expressão do gene para os 320 biomarcadores putativos de câncer de pâncreas descritas acima, foi utilizado um k-means clustering para identificar 13 sub-categorias separadas. A partir de cada um destes, foram selecionados 5 biomarcadores para ser incluído no nosso painel, para um total de 65 sondas. Vários biomarcadores adicionais foram identificados por busca direta literatura. Uma vez que anticorpos disponíveis comercialmente para muitos dos biomarcadores identificados estavam indisponíveis, menos de metade dos potenciais sondas foram construídas PLA (Tabela 1).

os níveis de biomarcadores foram dicotomizados em categorias de alta e baixa com base no facto que eles eram superiores a mediana. Nós próxima testado para uma associação estatisticamente significativa com a sobrevida global (OS), tanto no treinamento e coortes de validação utilizando modelos de regressão de Cox. Idade ( 70 vs. ≥70), sexo (feminino versus masculino), raça (branca versus não-branco), estado de desempenho ECOG (0-1 vs. 2), a intensidade da dor (≤20 vs. 20), e estágio da doença (III vs. IV) foram outras variáveis ​​incluídas nos modelos de regressão multivariada. Cada biomarcador foi analisada individualmente usando os modelos de Cox incluindo o mesmo conjunto de co-variáveis ​​listadas acima. Em uma análise separada, examinamos se a expressão de biomarcadores (acima ou não acima da mediana) foi associada com o estágio da doença. Biomarkers cuja expressão foi significativamente associada com o estágio foram determinados pelo teste exato de Fisher. Finalmente, para cada biomarcador, testou-se o seu efeito na predição para a sobrevivência melhorada devido ao erlotinib utilizando um modelo de Cox multivariável incluindo um período adicional de interacção entre o tratamento (erlotinib vs. placebo) e o nível de expressão binário biomarcador.

resultados

proteínas cuja concentrações, após dicotomizando baseada em ser maior do que médio, associado de forma significativa (p 0,05) com oS tanto na coorte de formação e validação em análise univariada ou multivariada são apresentados na Figura 1A e 1B, respectivamente . Os resultados são indicados para pacientes na coorte de validação. Como mostrado, na análise multivariada, alta interleucina 8 níveis (IL-8) foram associados com pior sobrevida em ambos os grupos de tratamento, enquanto o maior antígeno carcinoembrionário (CEA) e hipóxia fator induzida 1 alfa (HIF-1alpha) níveis foram associados com pior sobrevida nos doentes tratados com erlotinib. Os resultados completos estão disponíveis nos quadros S1 e S2

As razões de risco (HR) (de alta para baixa concentração de biomarcadores) e p-valores são mostrados de biomarcadores que foram significativamente associados (p 0,05). com a sobrevivência. Os resultados apresentados são das coortes de validação.

Vinte e quatro por cento dos pacientes inscritos no PA.3 teve estágio III (localmente avançado) ao invés de doença metastática (estágio IV). Em uma análise separada, examinamos se ou não concentração biomarcador (superior a mediana) foi associado a etapa (III vs. IV). Significativamente mais doentes com altos níveis de IL-8, CEA, factor de crescimento derivado de plaquetas de alfa (PFGFRalpha), e mucina MUC-1 (1) níveis tinham doença metastática estádio IV. (Figura 2). Os resultados apresentados são de coorte de validação

RUP e p-valores são mostrados para biomarcadores que foram significativamente associados (p 0,05).. Os resultados apresentados são de coorte de validação.

Por fim, buscou-se identificar biomarcadores que predizem uma resposta à terapia medindo o efeito da interação entre o tratamento erlotinib, o nível de biomarcadores e OS. Em uma análise multivariada, onde os níveis de biomarcadores foram analisados ​​por ser maior ou menor do que a mediana, nenhum foi significativamente associado com a resposta erlotinib, tanto na formação e conjuntos de validação. No entanto, quando o nivel de cada marcador foi examinada como uma variável contínua e as restrições estatísticos foram relaxado para p 0,1 para o conjunto de treino e p 0,05 no conjunto de validação, do receptor tirosina-cinase de proteína erbB-2 (HER2) sozinho foi identificada como tendo um efeito de interação significativa com a resposta erlotinib (HR para interação 0,95, 95% CI 0,72-1,26, p = 0,08 na coorte de treinamento e 0,7, IC 95% 0,5-0,99, p = 0,004 na coorte de validação). Na coorte de validação, os pacientes com HER2 acima da mediana tinha melhorado sobrevivência quando tratados com erlotinib (OS mediana 8,2 vs. 5 meses, HR 0,36, 95% CI 0,21-,63, p 0,0001), enquanto que não houve diferença significativa entre erlotinib e placebo foi de encontrados a partir de pacientes com HER2 2 níveis inferiores a mediana (OS mediana 6,0 vs 8,3 meses, HR 1,28, 95% CI 0,8-2,1, p = 0,3) (Fig 3).

mediana de sobrevida global (com 95 CI%) foi melhorada com o tratamento erlotnib em pacientes com maior do que os níveis medianos de HER2 plasma (8,2 vs. 5,0 meses), mas não em pacientes com menor plasma HER2 (6.0 vs. 8,3 meses).

discussão

NCIC CTG PA.3 provou a sua hipótese de que erlotinib mais gemcitabina resulta na melhoria oS comparação com gemcitabina sozinho por localmente avançado ou metastático PDCA, no entanto oS mediana no experimental e controle de armas diferiram em apenas 0,3 meses (6,2 versus 5,9). Os objetivos deste estudo foram identificar biomarcadores que estavam prognóstico em cada braço, correlativo ao metastático versus doença localmente avançada ou preditiva para melhorar a sobrevivência em pacientes tratados com erlotinib versus placebo, quando adicionado a gemcitabina.

O plasma proteínas cujos níveis foram associados com a sobrevivência em nosso estudo, IL-6 [12], IL-8 [13], CEA [14], e HIF-1 alfa [15, 16], tenham sido previamente identificado como prognóstico em localmente avançado ou câncer pancreático metastático. HIF-1 alfa, um factor de transcrição essencial para a sinalização hipóxia, não é segregada e é detectável no plasma, presumivelmente devido à lise do tumor. IL-6 [17] e IL-8 [18], que pode ser segregada a partir de tecidos tumorais ou do estroma, são proteínas de hipoxia induzida, o que sugere que o cancro do pâncreas podem propagar-se através de hipóxia a sinalização através de HIF 1 alfa, embora o seu papel na promoção de doença progressão é clara. IL-8 e CEA também foram mais susceptíveis de ser elevados em pacientes com doença metastática, como estavam, MUC-1 e PDGFRalpha. Tais biomarcadores pode ser utilizado para identificar doença metastática oculta em pacientes que seria então ser optimamente tratados com quimioterapia sistémica, omitindo agressiva terapia local. MUC-1 é sobre-expresso em cancros do pâncreas e tem sido demonstrado para associar com HIF 1 alfa para dirigir a expressão de oncogenes induzida por hipoxia, incluindo PDGF [19, 20], cujos receptores, PDGFRalpha e PDGFRbeta regulam a migração celular PDCA e metástase [ ,,,0],21, 22].

HER2 foi identificado como potencialmente preditivos para resposta erlotinib em nosso estudo. Este é o primeiro exemplo clínico para ligar resposta doença para erlotinib com um biomarcador de sangue. Recentemente,

HER2

foi mostrado para ser amplificado em 2% de 469 tumores PDCA sem pré-tratamento [23]. HER2 de sinalização, que é inibida por erlotinib [24], tem sido alvo de HER2 + PDCA, avaliada por imuno-histoquímica, utilizando trastuzumab, em pelo menos 2 dos ensaios anteriores de fase II [25, 26], nenhum dos quais apresentaram resultados favoráveis ​​em comparação com os resultados históricos . Tem sido reconhecido que a amplificação de HER2 deve ser verificada utilizando peixes ou de outros métodos, em oposição a IHC sozinho [27], que pode ter levado para os ensaios anteriores negativos. Nossa hipótese é que o benefício modesto sobrevivência de adição de erlotinib com gemcitabina no julgamento de PA.3 pode ter sido melhorada através de biomarcadores, como HER2 para selecionar para os pacientes com maior probabilidade de responder a erlotinib.

CA 19-9 foi não identificado como um biomarcador de prognóstico no presente estudo, ao contrário de relatórios anteriores [28-31]. Uma possibilidade para este resultado é que, no presente estudo, o PLA foi usado apenas para relatar quantidades relativas de proteínas neste ensaio altamente multi-plexed. Analisando CA 19-9 por um valor de corte mediano em vez de uma concentração de proteína absoluta pode ter afetado estes resultados. Um estudo prévio utilizando PLA descobriram que, embora CA 19-9 níveis eram 16 vezes maior em pacientes do pâncreas em comparação com controles normais, dentro desta população de pacientes localmente avançados, CA 19-9 também não não era prognóstico do resultado. [8].

Nosso estudo tem várias limitações. Medimos um relativamente pequeno número de proteínas, e, não é claro que todas as sondas PLA foram capazes de detectar o seu alvo com uma gama dinâmica suficiente. Por causa de amostras de tecido limitadas, não foram capazes de confirmar se os marcadores identificados também foram sobre-expressos no tecido e, igualmente, por causa da disponibilidade limitada de amostras de plasma, não somos capazes de verificar os resultados por outro método, como ligado a enzimas immunosorbent assay (ELISA). No entanto, a precisão do PLA foi verificada através de ELISA em estudos anteriores, e os marcadores que foram identificados no estudo atual foram implicados pelos outros como sendo prognóstico para resultados PDCA. Finalmente, o informou recentemente grande ensaio randomizado em câncer pancreático (LAP07 estudo) l não conseguiram confirmar o benefício de erlotinib para PDCA, [32] destacando a necessidade de biomarcadores preditivos de erlotinib e outras terapias para o tratamento desta doença maligna desafiador.

Conclusões

foram identificados vários biomarcadores que foram associados à sobrevivência e estágio da doença no PDCA. Her2 também podem ser indicativos de uma resposta ao erlotinib. Mais estudos são necessários para confirmar estes resultados em um conjunto de dados independente.

Informações de Apoio

Tabela S1. Os resultados das análises uni e multivariada, para gemcitabina com placebo e gemcitabina mais erlotinib coortes, incluindo a validação e de formação conjuntos, da associação entre os níveis de biomarcadores e sobrevivência

doi: 10.1371. /Journal.pone.0147995.s001

( DOCX)

S2 Table. . Detalhes de análises multivariáveis ​​para os biomarcadores identificados como sendo correlacionados significativamente (P 0,05) para a sobrevida global (dados de amostras de validação)

Os resultados apresentados indicam a correlação de cada variável para a sobrevivência: HR (CI) e valor de p

doi: 10.1371 /journal.pone.0147995.s002

(DOCX)

Reconhecimentos

Nós gostaríamos de agradecer a Justin Bui para revisão e formatação deste manuscrito. A.C. também reconhece o apoio de My Blue Dots.