Humana

Abstract

Fundo

células endoteliais

vasculares contribuem para a patogênese de numerosas doenças humanas através do controlo activo da resposta inflamatória do estroma; No entanto, pouco se sabe sobre o papel da inflamação endotelial no crescimento de tumores humanos e sua influência sobre o prognóstico dos cancros humanos.

Métodos

Usando um modelo experimental de fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) inflamação mediada, que caracterizado inflamatória expressão de genes em células endoteliais associadas ao tumor imunopurificados. Estes genes formaram a base de um preditor molecular multivariada de sobrevida global que foi treinado e validado em quatro tipos de câncer humano.

Resultados

Nós relatamos que a expressão do tumor obtida experimentalmente genes endoteliais patológicas distinguido espécimes de tecidos a partir de controlos normais em várias doenças humanas associadas com a inflamação crónica. Nós treinamos esses genes em conjuntos de dados cancerosas humanas e definiu uma assinatura inflamatória seis gene que predisseram reduziu significativamente a sobrevida global no cancro da mama, cancro do cólon, cancro do pulmão, e glioma. Esta assinatura previu resultado derivado do endotélio independentemente, mas em cooperação com, fatores prognósticos clínicos e patológicos padrão. Consistente com estes resultados, o meio de cultura condicionado de células endoteliais humanas estimuladas por citocinas pró-inflamatórias acelerou o crescimento de tumores do cólon e da mama humano em ratinhos imunodeficientes, em comparação com o meio condicionado a partir de células endoteliais não tratados.

Conclusões

Este estudo fornece a primeira assinatura de prognóstico do cancro gene derivado de um modelo experimental de inflamação endotelial associado a um tumor. Estes resultados suportam a noção de que a activação de vias inflamatórias em células endoteliais que se infiltram no tumor para não-malignas contribui para o crescimento tumoral e progressão em vários cancros humanos. É importante ressaltar que estes resultados identificar fatores derivados do endoteliais que podem servir como potenciais alvos para a terapia em diversos cancros humanos

Citation:. Pitroda SP, Zhou T, Sweis RF, Filippo M, Labay E, Beckett MA, et al . (2012) Tumor endotelial Inflamação prediz a evolução clínica em cancros humanos diversificada. PLoS ONE 7 (10): e46104. doi: 10.1371 /journal.pone.0046104

editor: Sharon A. Glynn, da Universidade Nacional da Irlanda Galway, Irlanda |

Recebido: 14 Março, 2012; Aceite: 28 de agosto de 2012; Publicação: 04 de outubro de 2012

Direitos de autor: © Pitroda et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Estes estudos foram apoiadas por financiamentos do Fundo de Virgínia e DK Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer (RRW), Lung Cancer Research Foundation (RRW), Chicago Tumor Institute (RRW), e do Projeto Programa de tumor cerebral (PO1 CA 07.193.312) (RRW), além de , Estados Unidos Institutos Nacionais de Saúde concede HL58064 (JGNG), HL98050 (JGNG) e HL105371 (JGNG) e uma generosa doação da família Foglia (RRW). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Durante a última década, a nossa compreensão da biologia do tumor se expandiu para incluir elementos do estroma do hospedeiro como determinantes importantes na transformação maligna e progressão [1]. Terapias dirigidas células estromais foram, em parte, o resultado de interações Caracterização molecular de tumor-estromal. Existem evidências consideráveis ​​de que a inflamação estromal contribui para a proliferação e sobrevivência de células malignas, facilita a instabilidade genómica, estimula a angiogénese e metástase, e altera a resposta a terapias anti-cancerosas [2], [3]. Quando produzidos cronicamente no microambiente tumoral, o TNF-α é um importante mediador da inflamação estromal [3]. TNF-α é importante em eventos precoces na tumorigénese, controlar uma cascata de citocinas, quimiocinas, moléculas de adesão, e as actividades pró-angiogénicos [2], [3]. As acções mais bem caracterizados de células malignas derivadas de TNF-α estão em células endoteliais vasculares. As células endoteliais vasculares participar activamente e regular a resposta inflamatória em ambos os tecidos normais e doentes [4], e os dados emergentes sugerem que as células endoteliais directamente influenciar o comportamento do tumor [5] – [7]. No entanto, pouco se sabe sobre o papel da inflamação endotelial na promoção do crescimento do tumor e a sua influência no prognóstico de cancros humanos.

A expressão de genes de perfis de tumores clínicos tem conduzido à descoberta de numerosas assinaturas moleculares. Uma limitação dos estudos de perfis de expressão de gene actual é a falta de validação em conjuntos de dados clínicos independentes [8], [9]. É importante ressaltar que muitas assinaturas clínicos empiricamente derivados são específicos para um único tipo de câncer e muitas vezes não fornecem informações sobre vias biológicas relevantes que afetam o prognóstico do câncer. Utilizou-se um modelo experimental de inflamação mediada por TNF-α para caracterizar expressão do gene inflamatória nas células endoteliais associadas ao tumor. Neste estudo, foi demonstrado que a indução da expressão do gene inflamatória nas células endoteliais associadas ao tumor acelera significativamente o crescimento de tumores humanos. Notavelmente, que derivam da primeira assinatura gene do cancro associado com a inflamação endotelial que prediz o resultado clínico em quatro tipos de cancros humanos, independentemente de factores de prognóstico clínico-patológicos padrão. Nossos resultados fornecem um método biologicamente derivado novo de prognóstico do câncer e sugerir possíveis caminhos para o desenvolvimento de terapias anti-cancro visando o estroma tumoral.

Métodos

Os métodos utilizados para linhas de células de cultura e estabelecer tumores em ratinhos são descritos em detalhe no Apêndice S1, que está disponível com o texto completo deste artigo em www.plosone.org. células endoteliais associadas a tumores foram isolados usando um imunopurifica�o gradual do tecido tumoral (Apêndice S1 para mais detalhes). Em resumo, isto foi realizado pelo apuramento das células hematopoiéticas a partir de tecidos tumorais homogeneizados por incubação com marcado com biotina anti-CD19, anti-CD45 e anti-F4 /80, que havia sido separado previamente ligado a Dynabeads ligadas a estreptavidina (Dynal; Lake Success, NY), seguindo-se a remoção das células ligadas a grânulo com um íman Dynal-50. Fc-Bloco (anti-CD16 /32 anticorpos) foi adicionado à suspensão celular para impedir a ligação não específica do receptor de Fc contendo as células para a selecção positiva. Subsequentemente, anti-VE caderina e anticorpos anti-CD105 foram adicionados para ligar células endoteliais, o que foi seguido pela adição de Dynabeads ligadas a estreptavidina e capturar com Dynal-íman 50 até que as células apenas se ligam-grânulo permaneceu em solução. Os métodos utilizados para a extracção de RNA, recolha de dados e análise de microarray, e reacção em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real são também descritos no Apêndice S1. Estão disponíveis dados de microarranjos em Gene Expression Omnibus (GEO) [número de acesso: GSE33253] (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=dfyldgammaawwjw acc=GSE33253).

Patient Amostra de dados

As informações do paciente, incluindo os dados clínicos e dados de expressão gênica, foi obtido a partir de várias fontes independentes. conjuntos de dados de expressão de genes que representam doença inflamatória do intestino (GSE13367), artrite reumatóide (GSE12021), e cirrose (GSE14323) foram baixados de GEO. Estes conjuntos de dados foram seleccionados com base na disponibilidade de ambas as amostras de tecidos doentes e normais, bem como ter um grande número de amostras disponíveis no momento da análise. conjuntos de dados de expressão de genes que representam cancro da mama humano, câncer de cólon, câncer de pulmão e glioma foram baixadas a partir de repositórios de acesso público. Estes conjuntos de dados foram escolhidos com base no grande número de amostras, a disponibilidade de dados de resultados clínicos, e a diversidade de tipos de tumores. Para cada tipo de tumor, coortes de formação e validação foram construídos. No cancro da mama [10] (n = 295; Netherlands Cancer Institute; https://bioinformatics.nki.nl/data.php) e câncer de cólon [11] (n = 232; Vanderbilt Medical Center (VMC; Nashville, TN) e H. Lee Moffitt Cancer Center (MCC; Tampa, FL); GSE17538 [177 da MCC, 55 de VMC]), as amostras de tumor foram separados aleatoriamente em duas partes (2/3 para treinamento e 1/3 para validação) usando números aleatórios gerados por computador para atribuir amostras para treinamento ou validação coortes. Para glioma, conjuntos de dados distintos [12], [13] foram utilizados para treinamento (n = 77; Universidade da Califórnia em San Francisco e MD Anderson Cancer Center; GSE4271) e validação (n = 50; Canadian Brain Tumor Tissue Bank (Londres, Ontário, Canadá), Hospital Geral de Massachusetts (Boston, MA), Hospital Brigham and Women (Boston, MA), e do Hospital Charite ‘(Berlim, Alemanha)); https://www.broadinstitute.org/cgi-bin/cancer/datasets.cgi). Por fim, para o cancro do pulmão [14], quatro conjuntos de dados (n = 441) foram disponíveis a partir de um único estudo e separados em formação (n = 257) e coortes de validação (n = 184) como foi descrito na publicação original. Estes conjuntos de dados foram obtidos a partir da Universidade de Michigan Cancer Center, Moffitt Cancer Center, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center e do Dana-Farber Cancer Institute (disponível em https://caarraydb.nci.nih.gov/caarray/publicExperimentDetailAction.do? expId1 /41015945236141280. as características clínicas dos pacientes utilizados para treinamento e validação estão listados na Tabela S1.

Análise estatística

Affymetrix NetAffx Analysis Center foi usado para identificar conjuntos de sondas correspondentes a orthologs humanos da calculado experimentalmente genes murinos. Sem o pré-processamento de dados específica foi realizada antes da análise da significância dos microarrays (SAM) [15] foi usado para comparar a expressão dos ortólogos humanos em amostras de tecidos doentes e normais. a expressão diferencial foi definida como uma taxa de detecção falsa (FDR) valor de p inferior a 0,05 -adjusted e dobra-mudar superior a 1,5. os genes diferencialmente expressos em pelo menos dois dos três conjuntos de dados testados foram definidos como mutuamente desregulado. agrupamento hierárquico via regra ligação de Ward com a distância euclidiana métrica usando JMP 7.1 (SAS Institute Inc .; Cary, NC) foi usado para visualizar as diferenças de expressão gênica.

Em cada conjunto de dados de treinamento câncer, foi utilizada regressão de Cox de risco proporcional uni para avaliar a associação entre a sobrevivência e o nível de expressão de genes derivados na análise de microarray experimental que foram diferencialmente expressos em conjuntos de dados de doenças humanas associadas com a inflamação crónica. Seis destes quarenta e nove genes tiveram coeficientes de regressão concordantes em todos os quatro tipos de tumor. A expressão de cada gene individual esteve associada com um risco aumentado de morte. Para esses seis genes, uma combinação linear dos valores de expressão gênica ponderados pelos coeficientes de regressão foi utilizada para calcular uma pontuação de risco para cada paciente. Os modelos e os seus coeficientes de escalonamento associados foram fixadas, com base nos grupos de formação, e, em seguida, avaliados nos grupos de validação (Tabela S2). Deixando e

ki denotar o nível de gene i para o paciente k expressão, e deixando w

i denotar o peso para mim gene, a pontuação gene para o paciente k é s

k = Σw

i ( e

ki-μ

i) /τ

i, onde μ

i e τ

i é a média eo desvio padrão dos valores de expressão de genes para o gene i em todas as amostras no conjunto de dados de validação. Os pacientes foram classificados como tendo um gene assinatura de alto risco ou de um gene assinatura de baixo risco, com a mediana do escore de risco como o valor limite. Uma pontuação elevada indicou um mau resultado. Para cada análise Cox univariada, fatores clínicos e patológicos associados à sobrevida global pobres foram identificados entre os fatores disponíveis fornecidos no conjunto de dados. Fatores significativos na análise univariada foram entrou em análise multivariada de Cox. A sobrevida global foi analisada e comparada pelo método de Kaplan-Meier. As diferenças de sobrevida foram testadas para significância estatística pelo teste de log-rank. Foram considerados os valores de P inferiores a 0,05 como nível de significância estatística. Bicaudais valores de P foram calculados para conjuntos de dados de treinamento, enquanto os valores P de uma cauda foram calculados para os conjuntos de dados de teste. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando JMP 7.1.

Resultados

Caracterização de expressão inflamatória gene no tumor-associados endotélio

Para examinar o papel da inflamação estromal TNF-α-mediada no crescimento do tumor, foi utilizado um modelo de tumor singeneico de células B16-F1 de melanoma de murídeo estabelecida em murganhos de tipo natural e de murganhos (WT) com disfunção imune, como resultado de deleções da linha germinativa de ambos os receptores TNF-α (TNFR 1, 2 – /- , aqui referido como knockout [KO]). Perturbação de estroma de TNF-α sinalização significativamente prejudicado o crescimento de tumores em ratinhos KO, em comparação com que em ratinhos WT (volume relativo (V /V

0) [média ± SEM]; KO: 9,0 ± 0,9; WT: 21 ± 2,5; p = 0,0033; Fig. 1A), apoiando assim um papel para o estroma de sinalização de TNF-α no crescimento do tumor. Em associação com estes dados, verificou-se um aumento da expressão da enzima pró-inflamatória, COX2, em vasos que se infiltram no tumor de ratinhos WT, em comparação com os ratinhos KO, tal como medido pela percentagem de células endoteliais vasculares COX2-positivas (WT: 65 ± 4,9%; KO: 9,3 ± 5,1%, p = 0,0014; Fig 1B e C).. Numa experiência repetição, que purificado células endoteliais de tumores excisados ​​WT e KO de igual volume e o gene realizada perfil de expressão de células endoteliais associadas ao tumor isolados (TAECs). Foram identificados expressão diferencial de 993 conjuntos de sondas correspondentes a 808 genes. WT TAECs exibiram expressão aumentada de 686 conjuntos de sondas e a diminuição da expressão de sonda 307 define em relação ao KO TAECs (Tabela S3). Estes genes codificam enzimas (104), reguladores da transcrição (66), quinases (35), transportadores (20), e quimiocinas /citocinas (7). Utilizamos Ingenuity Pathway Analysis (IPA) para classificar os genes diferencialmente expressos e identificados “Resposta Inflamatória” como o conjunto mais significativamente enriquecida de funções sobre-expressos em WT TAECs. Como medido pelo teste exato de Fisher, a incidência de genes envolvidos em funções de resposta inflamatória foi altamente significativa com valores de pa variar entre 2,4 × 10

-11 a 7,4 × 10

-3. análise IPA demonstrou uma ligação significativa deste gene definido como TNF-alfa relacionadas com vias inflamatórias conhecidas mediados por NF-kB e interferons (p = 10

-38; A Fig. 1D). Estes resultados indicaram que a sinalização do estroma TNF-α contribui para o crescimento do tumor acelerada e expressão do gene inflamatória no endotélio associado ao tumor

(A), o crescimento do tumor de melanoma B16-F1 foi significativamente suprimida em TNFR 1, 2 -. /- ratinhos (KO) com a sinalização de TNF-α estromal interrompido quando comparada com a em ratinhos de tipo selvagem (WT). O volume do tumor foi medido em relação ao dia 0 de volume, que foi igual em ratinhos WT e KO (P = 0,19; teste t de 2 caudas de Student). Dia 7, p = 0,002. Os dados são média ± SEM. (B) As células endoteliais associadas ao tumor (TAECs) em ratinhos KO reduziram significativamente a expressão da COX2 enzima pró-inflamatória. Imagens representativas de imuno-histoquímica para COX2 realizada em tumores B16-F1 (dia 7) e (C) Quantificação da COX2 TAECs-positivos. Barra de escala, 20 mm. Os dados são média ± SEM. P = 0,0014 (2-tailed t-teste de Student). (D) WT TAECs sobre-expressar uma rede de genes altamente significativo “resposta inflamatória” (p = 10

-38; o teste exato de Fisher). As linhas contínuas representam relacionamentos diretos, enquanto que as linhas tracejadas representam relacionamentos indiretos. A cor vermelha indica superexpressão no WT TAECs. (E) A estimulação de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) com uma combinação de citoquinas pró-inflamatórias TNF-α, IFNp, e IFNy induziu a expressão de ambos os genes inflamatórios endoteliais experimentalmente derivados (barras pretas), bem como, conhecido marcadores de inflamação endotelial (barras brancas). O ARN total foi analisado por RT-PCR quantitativo. Os dados são média fold-change ± SEM relação ao controlo tratado com HUVECs. P 0,01 entre os genes (2-tailed t-teste de Student). (F) meios de cultura condicionado de HUVEC tratadas acelerou o crescimento de tumores de cólon humano em ratinhos atímicos xenoenxertados. Pré-tratados indica incubação prévia das células tumorais com meio de cultura condicionado de HUVEC estimulada, enquanto que o controle indica incubação com meio condicionado de HUVEC falsamente tratados. O volume do tumor foi medido em relação ao Dia 0 Volume (8 dias pós-injecção). Os dados são média ± SEM. Dia 18, p = 0,0009 (teste t de 2 caudas Student).

avaliado directamente a expressão do gene do endotélio em resposta a sinais pró-inflamatórios por estimulação de células endoteliais da veia umbilical humanas cultivadas (HUVEC) com uma combinação de TNF-α e β interferões (IFN) e γ. Conforme determinado pela RT-PCR quantitativo, a expressão de

VCAM1

(molécula de adesão celular vascular 1),

ICAM1

(molécula de adesão inter-celular 1), e

SELE

( selectina-E), que são marcadores do endotélio activado [4], foram induzidas 1,8 a 2,6 vezes, respectivamente (Fig. 1E). Em conjunto com estes resultados, genes marcadores inflamatórios sobre-expressos em WT TAECs, incluindo

STAT1

(transdutor de sinal e ativador de transcrição 1),

cassete TAP1

(transportador, ATP vinculativo, complexo principal de histocompatibilidade 1),

IRF7

(interferon fator de regulação 7),

IFI44

(proteína induzida por interferon 44), e

CXCL10

(quimiocinas, CXC motivo, ligando 10), 1.9- foram sobre-expresso de 17,4 vezes após o tratamento (Fig. 1E). Testamos a hipótese de a células endoteliais activadas aumentar o crescimento de tumores humanos através da incubação de células tumorais em cultura com meio de cultura condicionado de ambos os TNF-α /IFN-tratados ou tratados com o controlo de células HUVEC. Meio condicionado de HUVEC tratadas com IFN TNF-α /aumentaram significativamente o crescimento de xenoenxertos de tumor do cólon humano em ratinhos atímicos de 2,3 vezes, em comparação com meio condicionado de HUVEC tratadas com o controlo (p = 0,0009; Fig. 1F). Em tumores da mama humanos, observou-se um aumento de 3,0 vezes semelhante no crescimento tumoral (p = 0,02) (dados não mostrados). Estes resultados demonstraram que a expressão do gene do endotélio em resposta a sinais pró-inflamatórias está associada com um aumento de crescimento de tumor humano.

A expressão de genes tumorais inflamatórias de origem endotelial em doenças humanas associadas com inflamação crónica

endotelial inflamação está envolvida na patogénese de muitas doenças humanas [16] – [18]. Para determinar se genes inflamatórios derivados experimentalmente foram relevantes para doenças humanas, foi medida a expressão de 554 ortólogos humanos distintos dos genes derivados do endotélio de tumor em conjuntos de dados de doenças humanas associadas com a inflamação crónica. Estes genes significativamente distinguido espécimes de tecidos patológicos de cirrose (153 genes), doença inflamatória do intestino (140 genes), e artrite reumatóide (106 genes) a partir dos controlos de tecido normal (Figura 2A-C;. Tabela S4). Em particular, as sensibilidades e especificidades para estes conjuntos de genes variou 88-100% e 90-100%, respectivamente (Tabela S5). Um subconjunto quarenta e nove-gene foi mutuamente desregulado nos conjuntos de dados testados e concordantes na expressão com o modelo experimental (Fig. 2D). Como esperado, estes genes foram significativamente enriquecida por vias envolvidas na “resposta inflamatória” (valor p: 1,4 × 10

-12-1.7 × 10

-2), incluindo a apresentação do antigénio, a sinalização do interferão, e um TNFR 2 de sinalização, e a sinalização de NF-kB (Fig. 2E). Estes resultados demonstraram que um perfil de expressão de gene sobre-expresso inflamatória em WT TAECs é expresso diferencialmente em várias doenças inflamatórias humanas.

Expressional agrupamento de ortólogos humanos dos genes de tumor derivado do endotélio em amostras de tecido do paciente de (A) cirrose ( 153 genes), (b) doença inflamatória do intestino (IBD) (140 genes), e (C) artrite reumatóide (AR) (106 genes) em comparação com controlos de tecido normal. Dentro do diagrama de cluster, cada coluna representa uma amostra do paciente e cada linha representa um gene expresso diferencialmente. amostras de doentes são denotados por escotilhas preto. A expressão é representado como valores médios normalizados, transformou-log2. (D) Quarenta e nove genes foram mutuamente desregulado nos conjuntos de dados testados e concordantes na expressão com o modelo experimental. (E) Análise de Caminho do conjunto de 49 genes demonstrando significativa sobre-representação das várias vias relacionadas à inflamação. Os valores de p foram calculados utilizando o teste exato de Fisher. linha vermelha indica p = 0,05.

Desenvolvimento de um classificador molecular prognóstico

A seguir, a hipótese de que a expressão inflamatória gene derivado do endotélio é preditivo do resultado tumor em pacientes com câncer. Usamos Cox de regressão de riscos proporcionais de todo o conjunto de quarenta e nove-gene para identificar seis genes associados com a sobrevida global reduzida em cada um dos quatro conjuntos de dados de treinamento que representam o cancro do pulmão (n = 257), cancro da mama (n = 197), cancro do cólon (n = 154), e glioma (n = 77). Nós designado esta seis gene definido como a assinatura Gene Inflamação Relacionada com endotelial derivado (IREG), que inclui os genes

IFI44

,

TAP1

,

SPP1

(secretado fosfoproteína 1; também conhecida como a osteopontina),

ANXA3

(anexina A3),

RGS2

(regulador da proteína G de sinalização 2), e

PDK1

(desidrogenase de piruvato-quinase, isoenzima 1). Construímos um seis-gene pontuação IREG que combinou a expressão do gene com risco de morte nos conjuntos de dados de treinamento (Fig. S1). pacientes IREG + foram definidos como aqueles que têm uma contagem de seis gene maior do que ou igual à pontuação média do grupo. Em coortes de doentes independentes, foi testada a capacidade de o marcador de seis genes para classificar pacientes de prognóstico em grupos com base na expressão do gene. Kaplan-Meier análise de sobrevida comparando grupos de pacientes demonstraram uma sobrevida global significativamente reduzida para pacientes IREG + em coortes independentes de câncer de mama (n = 98; p = 0,0008), cancro do cólon (n = 78; p = 0,0013), glioma (n = 50 ; p = 0,017), e cancro do pulmão (n = 184;. p = 0,026) (Fig 3A-D). Esta associação entre o estado IREG e sobrevivência foi confirmada por análise de Cox de risco proporcional univariada de sobrevida global. pacientes IREG + tiveram um risco aumentado de morte de 2,72 vezes no cancro do cólon (p = 0,0027), 3,21 vezes no cancro da mama (p = 0,0015), 1,66 vezes no cancro do pulmão (p = 0,052), e 2,12 vezes em glioma (p = 0,034) (Tabela 1). Notavelmente, em todos os tipos de câncer de status IREG + foi significativamente associada com tumores primários maiores de alto grau histológico (Tabela 2). Além disso, em cada conjunto de dados tumor testados, encontramos uma correlação positiva entre a

VCAM1

expressão gênica e pontuação IREG (Fig. 3E-H). Estes resultados indicaram coletivamente que a assinatura IREG é preditiva de sobrevida global em vários cancros humanos. Além disso,

VCAM1

, um marcador de endotélio activado por citocinas, é co-expressa com a assinatura IREG.

expressão IREG está associada com mau prognóstico em (A) o cancro da mama (n = 98 ), cancro do pulmão (B) do cancro do cólon (n = 78), (C) de glioma (n = 50), e (D) (n = 184). As curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier para os grupos de pacientes identificados pela pontuação IREG. Os valores P indicam diferenças significativas na sobrevida global, conforme medido por testes de log-rank. Vermelho = IREG +, azul = IREG-. (E-H) A expressão do marcador de seis IREG gene foi positivamente correlacionada com a expressão do gene VCAM-1 em cada tipo de tumor. É mostrado o coeficiente de correlação de Pearson.

Análise

multivariada com padrão fatores clínicos e patológicos prognósticos

Em análises multivariadas utilizando co-variáveis ​​disponíveis para cada conjunto de dados, IREG + estatuto permaneceu covariável significativa no câncer de mama, câncer de pulmão e câncer de cólon em relação aos fatores clínicos e patológicos padrão associados a um mau prognóstico (Tabelas S6, S7, S8 e S9). Nestes tipos de câncer, não houve interações significativas entre multivariados IREG + status e as outras variáveis. Estes resultados indicaram que o efeito prognóstico da pontuação IREG não era dependente de valores específicos dos respectivos co-variáveis. No cancro da mama com mau prognóstico (idade 40 ou o tamanho do tumor ≥T2), expandimos esta análise, os pacientes ainda mais a estratificação usando a pontuação IREG (Fig S2.). Nós determinamos que para cada fator respectivo associado com mau prognóstico, os pacientes IREG + teve um 2.4- para 2,8 vezes risco significativamente elevado para a morte quando comparado com IREG- pacientes. Uma análise similar de pacientes com câncer de pulmão com mau prognóstico (idade ≥65 ou linfonodal) demonstraram uma significativa 1,4 a 2,0 vezes maior risco de morte em pacientes + IREG (Fig. S3). Para pacientes com cancro de fase 3 ou 4 do cólon, os pacientes tinham uma IREG + 1,9 vezes maior risco de morte quando comparada com IREG- pacientes (Fig. S4). Por último, para os pacientes em maior risco de glioma (idade 55), os pacientes IREG + tiveram um risco significativamente maior de morte de 2,4 vezes, respectivamente (Fig S5, S10 Tabela.). Tomados em conjunto com os dados anteriores, estes resultados confirmam que o estado IREG + melhora a identificação de pacientes com câncer em maior risco de morte.

Discussão

Estas descobertas sugerem que a inflamação endotelial é um mediador do crescimento do tumor e progressão. Em apoio a esta hipótese, nós demonstramos que a ruptura da sinalização de TNF-estromal α suprime a expressão do gene inflamatória nas células endoteliais associadas ao tumor e prejudica significativamente o crescimento do tumor. Mostramos ainda que o meio de cultura condicionado de células endoteliais humanas activadas por citoquinas pró-inflamatórias acelera o crescimento de tumores humanos em ratinhos imunodeficientes. Finalmente, derivar uma assinatura molecular reflexiva da expressão do gene inflamatória do endotélio tumoral que é altamente preditivo de prognóstico clínico em quatro tipos de cancro humano. Concordante com o nosso modelo experimental, os pacientes com tumores que expressam estes genes inflamatórios tinham tumores primários significativamente maiores de alto grau histológico.

assinaturas moleculares descobertos através de perfis de expressão gênica foram mostrados para adicionar valor prognóstico para os achados clínicos e patológicos em vários cancros humanos. Identificar as variáveis ​​de prognóstico que trabalham cooperativamente com fatores conhecidos podem melhorar a identificação de pacientes com maior risco de recaída e morte. Recentemente, vários estudos têm identificado assinaturas estromais de acolhimento, quer em células do estroma purificadas ou a partir de amostras de tumores inteiros, como fatores prognósticos significativos em vários tipos de câncer humano, incluindo câncer de mama, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer de próstata e linfomas [19] – [26]. Finak et al [19] microdissecção de captura de laser usado (LCM) de tumores da mama primários para a construção de uma assinatura prognóstico derivado do estroma que previu mau resultado em conjuntos de dados de expressão inteiras derivadas de tumores. Os autores descobriram que o mau resultado foi fortemente ligada à expressão de numerosos genes endoteliais derivadas de amostras de pacientes e que no interior do grupo mau resultado teve um significativamente maior teor endotelial do que aqueles no grupo de bom resultado. Além disso, Lenz et al [25] a expressão do gene perfilado em amostras de biópsia a partir de pacientes com linfoma difuso de células B grandes e identificada uma assinatura do estroma altamente prognóstico em doentes com resultado adverso que foi em grande parte, composto por marcadores endoteliais bem conhecidas. Assim, Saadi et al [21] demonstraram que a progressão de doenças pré-malignas de adenocarcinoma esofágico foi associada com uma expressão marcada de mediadores inflamatórios em células estromais LCM comprometidas, em parte, por células endoteliais. Estes estudos destacam o papel das células do estroma-se infiltram no tumor não-malignas no prognóstico dos cancros humanos. A este respeito, a maioria das biópsias tumorais contêm uma fracção significativa de células do estroma (até 50% [10]). Por isso, as assinaturas derivados a partir de amostras tumorais todo, reflectem ambos os padrões de expressão tumorais e do estroma. No entanto, alguns estudos até à data têm identificado assinaturas moleculares de prognóstico relevante para vários cancros humanos, e nenhum dos quais foram derivados a partir de células endoteliais associadas ao tumor.

As células endoteliais desempenham um papel activo em vários funções inflamatórias que conduzem para o aumento do fluxo de sangue, derrame vascular de proteínas do plasma, e o recrutamento de leucócitos. Muitas terapias bem-sucedidas de segmentação inflamação crônica alterar diretamente a expressão do gene endotelial [4]. Exemplos específicos incluem inibidores de TNF-α na artrite reumatóide e doença inflamatória do intestino e estatinas em doenças cardiovasculares [4]. Há um crescente corpo de evidências de que muitas doenças malignas estão ligados a doenças de inflamação crónica. Um mecanismo pelo qual isto ocorre é através da indução e a acumulação de danos ao DNA em células em proliferação por infiltração de células inflamatórias em locais de inflamação persistente. Essas mudanças levam a alterações genômicas permanentes que, finalmente, promover a transformação maligna [2]. A ligação mais forte entre a inflamação crônica e doença maligna está na carcinogênese do cólon provenientes de indivíduos com doenças inflamatórias intestinais. Embora seja conhecido que vias inflamatórias em outras células do estroma também contribuir para o crescimento do tumor [2], os nossos resultados sugerem que a inflamação associada a tumor endotelial é um determinante importante na progressão do tumor. Em apoio das nossas descobertas, a evidência emergente demonstra que os sinais derivados de células endoteliais, incluindo mediadores inflamatórios, regulam diretamente a progressão do tumor através de mecanismos “angiocrine” independentes da angiogênese [27]. No entanto, mais estudos são necessários para caracterizar os mecanismos pelos quais as células endoteliais de tumor inflamado promovem o crescimento do tumor.

Nossos resultados diferem de muitas assinaturas de genes derivados empiricamente em que identificamos um preditor molecular de sobrevida em pacientes com diversos cancros humanos com base em um modelo experimental de inflamação endoteliais do tumor, o que pode ser útil clinicamente e biologicamente. Além disso avaliação prospectiva da assinatura de seis genes utilizando RT-PCR pode resultar em uma ferramenta de previsão precisa e reprodutível, que pode ajudar na tomada de decisão clínica em numerosos cancros humanos. A partir de uma perspectiva terapêutica, a inibição selectiva de factores inflamatórios de origem endotelial, sem perturbar a integridade dos vasos sanguíneos, ainda pode bloquear o crescimento do tumor e, assim, evitar potenciais efeitos secundários tóxicos para a vasculatura normal, [6], [7]. Ainda mais, sabe-se que a actividade angiogénica não se correlacionam necessariamente com o prognóstico de tumores [7].