Abstract
diabetes tipo 2 tem sido associado com diminuição do risco de câncer de próstata em estudos observacionais, e este associação inversa foi recentemente confirmada em vários estudos de coorte de grande porte. No entanto, os mecanismos envolvidos neste efeito de protecção permanecem por ser elucidados. O objetivo do presente estudo foi investigar se características diferentes de diabetes tipo 2 (hiperinsulinemia, hiperglicemia e fator de necrose tumoral alfa [TNF-α]) proteger contra o desenvolvimento de câncer de próstata. Para este efeito, foram utilizadas células LNCaP para
in vitro
experiências e ratos sem pêlo em que PAC120 (câncer de próstata humano hormono-dependente) xenotransplantes tinham sido implantados foram utilizados para
In vivo
exames. Nós fornecemos evidências de que aumentar as concentrações de glicose regular negativamente receptor de andrógeno (AR) mRNA e os níveis de proteína através da activação de NF-kB em células LNCaP. Além disso, houve um efeito sinérgico de glicose e TNFa em downregulating da AR em células LNCaP. Por outro lado, a insulina não teve efeito na regulação de AR.
In vivo
experiências mostraram que a diabetes induzida por estreptozotocina (STZ-MS) produz o atraso de crescimento do tumor e uma redução significativa na expressão de AR em ratinhos de cancro da próstata PAC120. Em conclusão, os nossos resultados sugerem que a hiperglicemia e TNF-a desempenhar um papel importante na proteção contra o câncer de próstata, reduzindo os níveis de receptores de andrógenos via NF-kB
Citation:. Barbosa-Desongles A, Hernández C, De Torres I , Munell F, MF Poupon Simo R, et al. (2013) Diabetes Protege contra cancro da próstata por downregulating receptor andrógeno: New Insights a partir de células LNCaP e PAC120 Modelo rato. PLoS ONE 8 (9): e74179. doi: 10.1371 /journal.pone.0074179
editor: Ming Tat Ling, Universidade de Tecnologia de Queensland, Austrália |
Recebido: 16 de abril de 2013; Aceito: 29 de julho de 2013; Publicação: 10 de setembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Barbosa-Desongles et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Instituto de Salud Carlos III (DMS) e Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades metabólicas Asociadas (CIBERDEM), uma iniciativa do Instituto de Salud Carlos III (RF, ABD, CH e DMS) . DMS é o destinatário de um contrato Miguel Servet. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
diabetes tipo 2 (DM2) e câncer de próstata (PCA) são dois grandes, crescentes problemas de saúde que afetam milhões de homens em todo o mundo. PCA é uma neoplasia andrógeno-dependentes, que constitui o câncer de órgão sólido mais comum em homens em os EUA, Canadá e Austrália, e o segundo tipo de câncer mais comum em homens em todo o mundo [1].
T2D tem sido reconhecido como um factor fundamental para o desenvolvimento de neoplasias de órgãos sólidos, incluindo fígado, pâncreas, colo-rectal, da mama, do endométrio, do útero, bexiga e [2], [3] no entanto, vários estudos de coorte grandes mostraram uma significativa diminuição do risco de CaP em DT2 [4 ] – [7]. Além disso, tem sido observado que a magnitude desta associação inversa é superior com o aumento da duração da diabetes [4], [8]. Embora a diabetes de longa data protege contra o desenvolvimento de CaP, há evidências de que os homens diabéticos podem ter um resultado pior, porque eles têm hystologically mais agressivo CaP em comparação com pacientes não diabéticos [9] – [11]. Uma das razões para esse recurso poderia ser os menores níveis séricos de antígeno prostático específico (PSA) que pacientes diabéticos tipo 2 apresentam, em comparação com indivíduos não diabéticos [5], [12], [13]. Uma vez que o PSA é o método de rastreio de corrente para APC, menores níveis de PSA que existem nos doentes diabéticos podem levar ao atraso do diagnóstico, aumentando assim a incidência de alto grau /CaP avançado. No entanto, deve notar-se que o efeito protector de diabetes em CaP não é apenas uma consequência de viés de detecção de diagnóstico tardio devido a níveis mais baixos de PSA [5], [14], [15].
O precisos mecanismos envolvidos no efeito protector da DT2 em desenvolvimento CaP permanecem por ser elucidados. Tem sido relatado que os indivíduos com um aumento da susceptibilidade genética a diabetes tipo 2 têm um risco diminuído de CaP [16] – [18]. A este respeito, foi mostrado que a mesma variação na HNF1B (também conhecido como TCF2) gene, que está associada com um risco aumentado de APC, confere uma protecção contra a DT2 [19]. Outras explicações propostas têm incluído o desenvolvimento progressivo de esgotamento das células beta com depleção de insulina e a associação de diabetes com níveis mais baixos de fator de testosterona e crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) [15]. Além disso, deve notar-se que a inflamação de baixo grau é uma componente significativa de DT2 e que os níveis de soro elevados de factor de necrose tumoral alfa (TNF-α) em comparação com controlos não diabéticos foram relatados [20]. Recentemente, forneceram evidências de que TNFa pode desempenhar um papel essencial na regulação negativa de SHBG e níveis séricos de testosterona [21], [22]. Portanto, um cross-talk entre os níveis de inflamação e andrógeno poderia ser um mecanismo subjacente representando o baixo risco de CaP observado em diabetes tipo 2. Além disso, foi recentemente demonstrado que vários genes relacionados com a inflamação está associada com níveis séricos de andrógenos nos homens [23].
Desde PCA é andrógeno-dependentes, o primeiro objetivo do presente estudo foi examinar se a insulina ou níveis de glucose no teve qualquer efeito sobre o receptor de androgénio (AR) em células LNCaP CaP (uma linha celular de cancro imortalizada CaP sensível ao androgénio) [24]. Além disso, dado que o TNF-α é regulada na diabetes tipo 2 e uma regulação negativa da expressão do AR por TNF-α tem sido relatado anteriormente [25], nós quisemos explorar se TNF-α teve qualquer efeito sobre a regulação AR no nosso
sistema in vitro
. Além disso, uma vez que a hiperglicemia é capaz de activar o NF-kB em células endoteliais, pericitos e células do músculo liso vascular [26] – [30], e a activação de NF-kB pode estar envolvido na regulação baixa de AR [25], [31], examinámos se hiperglicemia poderia reduzir os níveis de AR através da activação de NF-kB em células LNCaP. Finalmente, foi utilizado um modelo PAC120 próstata do rato câncer [32] tratados com estreptozotocina (STZ) para avaliar
in vivo
os efeitos da hiperglicemia sobre a regulamentação AR e crescimento do tumor.
Materiais e Métodos
Cultura celular
as linhas celulares de cancro da próstata humano LNCaP foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA) e foram semeadas em 75 cm2 frascos e cultivadas em RPMI 1640 (PAA Laboratories , Pasching, Austria) contendo 10% de FBS, 1% de penicilina /estreptomicina, 1% de HEPES e concentrações diferentes de insulina (20, 100 ou 200 uUI /ml) ou a concentração de glucose (5, 10 ou 30 mM de D-glicose e 5 ou 30 mM de L-glicose) durante 4 dias. células LNCaP também foram tratadas com quantidades crescentes de D-glucose (5 mM, 10 mM e 30 mM) na presença ou ausência de TNFa (50 ng /ml) ou QNZ (Enzo Life Sciences International, Inc., PA, EUA). As células foram mantidas numa incubadora humidificada com 5% de CO
2 a 37 ° C. Todas
in vitro
experimentos foram realizados, pelo menos, em dois experimentos independentes por triplicado.
Modelo Animal
Para
in vivo
estuda um modelo de rato CaP PAC120 foi usado. De Pinieux
et al
[33] criou esse modelo de CaP humana usando tecido obtido através de ressecção transuretral de um APC localmente recorrente. Este tecido CaP foi estabelecido como o xenotransplante transplantáveis em ratos pelados, onde cresceu localmente e exibidos ao mesmo imunofenotipagem como o tumor original.
camundongos swiss atímicos Cinco semanas de idade (Charles River Laboratories, Inc) foram alojados na zona livre de patógenos única dos Laboratórios Biotério do Instituto de Recerca de Vall d’Hebron e eles foram fornecidos com comida e água
ad libitum
. tumores de próstata foram cortados em pedaços de 5 × 5 mm e enxertados subcutaneamente como previamente descrito [33]. As intervenções cirúrgicas foram realizadas sob isofluorano anestesia e analgesia meloxicam, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. O protocolo foi aprovado pela CEEA (Comité ETIC Experimentació Animal) do Instituto de Pesquisa Hospital Vall d’Hebron (número de autorização 14/05 CEEA). Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as normas institucionais, que preencheram os requisitos estabelecidos pelo Governo espanhol e da Comunidade Europeia (Real Decreto 223/1988 e BOE 256, 10/25/90). O crescimento do tumor foi avaliada por medição de dois diâmetros perpendiculares com um calibre. O volume (V) de cada tumor foi medido uma vez por semana e foi calculado como previamente descrito [33]. A mediana dos volumes de tumor foi calculada para cada grupo de ratinhos
Tratamento animal
Ratos foram divididos em quatro grupos: a.) Ratos injectados com 6 mg de estreptozotocina (STZ) (Sigma-Aldrich , Madrid, Espanha) por via intraperitoneal (IP), uma semana antes do tumor foi enxertado; b) ratos tratados com STZ de IP, após a implantação do tumor; c) ratinhos tratados com o PI e d veículo (citrato de pH 4,5 a 50 mM)) ratos não tratados. As amostras de sangue foram tiradas duas vezes por semana por medições da veia safena para a glicemia de como controlar a manutenção do estado diabético. No final das experiências, os animais de controlo tratados e foram sedados por CO
2, e imediatamente sacrificados por deslocamento cervical. Tecido foram recolhidas e congeladas a -80 ° ou em formalina
Histologia
amostras de tumor foram fixados com formalina e embebidos em parafina.; em seguida, cinco secções amostra de tumor um de espessura foram hidratados com xileno (3 x 10 min) e etanol a concentrações decrescentes (100%, 90%, 70%, 30%, 2 × 5 minutos cada) e coradas com hematoxilina (30 segundos) (Surgipath Medical Industries, Inc., IL, EUA) e eosina (20 segundos) (Sigma-Aldrich). Finalmente, as amostras foram desidratadas com soluções de etanol graduadas (como descrito acima) e liberado em xileno antes de serem montadas com DPX (Panreac SA, Barcelona, Espanha).
Imunohistoquímica
Depois do de-encerado e processos de hidratação, as lâminas foram pré-tratadas utilizando um método de recuperação de antigénio de microondas (Dako Diagnostics SA, Barcelona, Espanha). A peroxidase endógena foi extinta antes da incubação durante a noite a 4 ° C com receptor de androgénio anti (coelho policlonal ar c-19, Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg, Alemanha) utilizado em 1:50 e com citoqueratina monoclonal de ratinho anti-humano, (clones AE1 /AE3; Dako, Dinamarca). Após várias lavagens, as secções foram incubadas 30 minutos à temperatura ambiente com anticorpos secundários conjugados com HRP (Dako Diagnostics SA), e as reacções foram desenvolvidas durante 1 min com diaminobenzidina e
sistema do H
2O 2. controlos negativos apropriados foram realizados incubando secções, sem o anticorpo primário.
Análise de ARN
O ARN total foi extraído a partir de células LNCaP de D-glucose e L-glucose tratadas utilizando RNeasy Mini Kit (QIAGEN SL, Madrid, Espanha) de transcrição reversa (RT) foi realizada a 42 ° C, durante 50 minutos, utilizando 2 ug de ARN total e 200 U de Superscript II em conjunto com um iniciador oligo-dT e reagentes fornecidos por Invitrogen. Uma aliquota do produto de RT foi amplificado numa reacção de 25-ul usando SYBRGreen (Invitrogen SA, Barcelona, Espanha) com pares de iniciadores de oligonucleótidos adequados correspondentes ao receptor de androgénio humano (iniciador directo 5′-TGAAAGCCATGCTACTCTTCAG-3 ‘e o iniciador inverso 5’- GCTCA CCATGTGTGACTTGAT-3 ‘), 18S humanos (iniciador directo 5′-TAACGAACG AGACTCTGGCAT-3′ e o iniciador inverso 5’-CGGACATCTAAGGGCATCACAG-3 ‘). Os resultados foram analisados usando o programa de 7000 SDS e quantificada pelo comparativa C
método T (2
-ΔΔC
T método).
Western Blot Analysis
Depois de tratamentos , as células LNCaP foram lavadas duas vezes com PBS frio, raspadas do balão e homogeneizados em tampão RIPA suplementado com Complete ™ cocktail inibidor da protease (Roche Diagnostics, Barcelona, Espanha). Os extractos de proteína foram usadas para transferência de Western com anticorpos contra o anticorpo policlonal de coelho AR AR N-20 (Santa Cruz Biotechnology Inc), fosfo-NF-kB humana (SC-33039; Santa Cruz Biotechnology Inc.) e anticorpo policlonal de coelho PPIA (SA- 296;. Int BIOMOL, Madrid, Espanha), a 4 ° C. Após várias lavagens, as bandas imunorreactivas foram visualizadas por anticorpos de peroxidase de rábano-secundário conjugado (Dako Diagnostics SA), seguido por reagente quimioluminescente dependente da peroxidase (Pierce Biotechnology Inc., Barcelona, Espanha) por exposição a filme de raios-x. A análise densitométrica foi realizada utilizando o ImageJ programa.
Análise estatística
Os resultados são expressos como média ± DP. Os dados foram submetidos ao teste e significado ANOVA (p 0,05; p 0,01) foi atingido
Resultados
O tratamento de insulina não tem efeito no receptor de andrógeno (AR) Níveis em células LNCaP
Desde PCA é andrógeno dependente, primeiro queria examinar se a insulina tiveram qualquer efeito sobre os níveis de AR. Nós células LNCaP tratadas com diferentes concentrações de insulina (20, 100 ou 200 μUI /ml) durante quatro dias. Os resultados mostraram que os tratamentos de insulina não alterou os níveis de ARNm de AR, quando comparado com células não tratadas LNCaP (Figura 1A). Além disso, os níveis de proteína AR também não foram alteradas pelo tratamento com insulina quando comparados com os controles (Figura 1B). A eficácia do tratamento de insulina foi determinada através da medição da fosforilação de proteínas do IRS-1 e PS6. Os resultados mostraram que o tratamento com insulina aumentou a fosforilação de ambas as proteínas, quando em comparação com as células de controlo de LNCaP (Figura 1C).
(A) Níveis relativos de ARNm de AR, na presença de diferentes concentrações de insulina são mostrados. Humano 18 S ARNm foi amplificada como um controlo. Os pontos de dados são apresentados como média ± desvio padrão de triplicados. (B) A análise dos níveis de proteína AR, na presença de diferentes concentrações de insulina em células LNCaP por western blot. PPIA tem sido utilizada como uma proteína de referência arrumação. (C) os níveis de fosforilação do IRS-1 e PS6 em células LNCaP tratadas durante 4 dias com diferentes concentrações de insulina medidos por transferência Western. PPIA tem sido usada como uma proteína de referência de limpeza.
O aumento da glicose concentrações regular negativamente AR em células LNCaP
A seguir, queriam estudar os efeitos da hiperglicemia sobre os níveis de AR usando células LNCaP. As células LNCaP foram cultivadas com concentrações crescentes de glucose (5 mM, 10 mM e 30 mM) ao longo de quatro dias. O meio foi mudado todos os dias para manter as concentrações de glicose constantes. Os níveis de ARNm de AR foram reduzidos significativamente em células de LNCaP em cultura em glicose a 10 ou 30 mM quando comparado com as células LNCaP cultivadas em glucose a 5 mM (Figura 2A). Além disso, os níveis de proteína AR foram também significativamente reduzidos em células de LNCaP em cultura em glicose a 10 ou 30 mM quando comparado com as células LNCaP cultivadas em glucose a 5 mM (Figura 2B). Para excluir qualquer efeito osmótico da glicose, repetimos os experimentos usando L-glicose e nós não encontramos qualquer diminuição nos níveis de proteína AR (dados não mostrados).
relativos níveis (A) de mRNA AR na presença de diferentes concentrações de D-glucose são mostrados. ARNm 18S humano foi amplificada como um controlo. Os pontos de dados são apresentados como média ± desvio padrão de triplicados. (B) A análise dos níveis de proteína AR, na presença de diferentes concentrações de D-glucose em células LNCaP por western blot. PPIA tem sido usada como uma proteína de referência de limpeza.
O Synergic Efeito da glicose elevada concentração e TNFa na regulação baixa de AR em células LNCaP
Os pacientes diabéticos são caracterizados por um certo estado de inflamação de baixa qualidade e apresentam altos níveis circulantes de TNF-α em comparação com indivíduos controle. Por isso, queríamos estudar o efeito da adição de TNF-α no nosso
in vitro
sistema. Para este efeito, repetiu-se a tratamentos de glucose, na presença ou ausência de TNF-α (50 ng /ml). Os resultados demonstraram novamente que o ARNm de AR e os níveis de proteína foram reduzidos significativamente quando as células foram cultivadas em glucose 10 mM ou 30, quando comparado com células LNCaP cultivadas em glucose a 5 mM. Notavelmente, foi obtido um efeito sinérgico potente que conduz a uma redução significativa de ambos os níveis de mRNA e proteína Ar quando TNFa foi adicionado a diferentes concentrações de D-glucose em células LNCaP (Figura 3A e B).
(A) relativos níveis de mRNA AR em LNCaP tratados com uma concentração crescente de D-glucose com ou sem TNF. Humano 18 S ARNm foi amplificada como um controlo. Os pontos de dados são apresentados como média ± desvio padrão de triplicados. * P 0,05 e ** P 0,01 comparado com 5 mM de D-glucose. (B) Análise dos níveis de proteína AR nas células LNCaP tratados como em A medidos por Western blot que utiliza PPIA como uma proteína de referência de limpeza.
A hiperglicemia regula negativamente AR através de NF-kB Ativação em células LNCaP
para examinar se a hiperglicemia foi capaz de regular negativamente AR através da activação de NF-kB no nosso
in vitro
sistema que realizou os seguintes experimentos.
em primeiro lugar, tratados células LNCaP com 5 mM e 30 glicose mM e os níveis de ARNm de AR foram analisados na linha de base e após 4 dias de cultura. Os resultados mostraram que a glucose 30 mM foi capaz de reduzir os níveis de ARNm de AR, quando comparado com células LNCaP crescidas em glucose a 5 mM (Figura 4A). Os níveis de proteína AR também foram reduzidos nas células LNCaP crescidas em glucose 30 mM quando comparado com 5 mM de glucose. Mais importante ainda, um aumento da fosforilação da p65, uma sub-unidade de NF-kB, foi também detectada em células cultivadas em glucose 30 mM quando comparado com células crescidas em glucose a 5 mM (Figura 4B).
(A) AR Relativa Os níveis de ARNm em células LNCaP tratadas com 5 mM ou 30 mM de glucose. Humano 18 S ARNm foi amplificada como um controlo. Os pontos de dados são apresentados como média ± desvio padrão de triplicados. * P 0,05 e ** P 0,01 comparado com 5 mM de glucose. (B) Análise de AR e fosfo-P-65 os níveis de proteína em células LNCaP tratados como em A medida pela transferência de Western utilizando PPIA como uma proteína de referência arrumação. (C) em relação níveis de ARNm de AR em LNCaP tratadas com 5 mM ou 30 mM de glucose na ausência ou na presença de QNZ (25 nM). Humano 18 S ARNm foi amplificada como um controlo. Os pontos de dados são apresentados como média ± desvio padrão de triplicados. * P 0,05 e ** P 0,01 comparado com 5 mM de glucose. (D) Análise dos níveis de proteína AR nas células LNCaP tratados como em C medida por transferência de Western utilizando PPIA como uma proteína de referência de limpeza.
A seguir, decidiu tratar células LNCaP com 5 mm ou glucose 30 mM na presença ou ausência de QNZ (25 nM), um inibidor de NF-kB. Os resultados mostraram que a co-tratamento QNZ foi capaz de bloquear a regulação negativa induzida por hiperglicemia de ARNm de AR e os níveis de proteína (Figura 4C e D).
A diabetes induzida por estreptozotocina (STZ-MS) Produz do cancro da próstata (CaP ) Retardo do Crescimento em uma PAC120 Modelo rato
a seguir, queria estudar se a hiperglicemia por si só poderia proteger contra o desenvolvimento de câncer de próstata
in vivo
. A fim de fazer isso, foi utilizado um modelo de rato CaP PAC120 com STZ-DM. Para este efeito, a injecção intraperitoneal de STZ foi administrado a ratinhos nus suíços antes (n = 7) e depois (n = 7) a implantação do tumor PAC120 subcutaneamente. Não-tratados (n = 5) e o citrato de tratados (n = 5) ratinhos foram usados como controlos. Não-tratados e os ratos tratados citrato mostrou um crescimento de tumor semelhante (Figura 5AI), enquanto os ratos STZ-DM mostraram uma redução do crescimento do tumor (Figura 5Aii) ou nenhum crescimento do tumor (Figura 5Aiii).
(A) Imagens de tumores desenvolvida em ratos tratados com veículo (N = 5) (i), a STZ tratados antes ou depois da implantação do tumor (n = 7 para ambos) com reduzida (II) ou não o crescimento do tumor (III). (B) Comparação do volume do tumor para o (n = 5) ratinhos não tratados e de citrato tratado (n = 5). (C) O volume do tumor de animais tratados com STZ após a implantação do tumor em comparação com o volume do tumor de ratos tratados citrato. (D) O volume do tumor de animais tratados com STZ, antes da implantação do tumor em comparação com o volume do tumor de ratos tratados citrato. Os dados são média ± DP. * P 0,05 e ** P . 0,01 em comparação com o controlo
O crescimento do tumor foi seguido medindo os volumes dos tumores uma vez por semana. Não-tratados e ratinhos tratados citrato mostraram crescimento semelhante durante a experiência de 40 dias (Figura 5B). Ambos os grupos de ratos diabéticos mostrou crescimento do tumor reduzido quando comparado com os murganhos de controlo (Figura 5C e D). Os ratinhos que eram diabéticos antes do implante do tumor (Figura 5D) mostrou uma redução maior no crescimento do tumor, quando comparado com os ratos que eram diabéticos após a implantação do tumor (Figura 5C).
A diabetes induzida por estreptozotocina (STZ-MS) Reduz AR expressão em tumores e endógena Prostates de PAC120 Modelo rato
o exame histológico de hematoxilina /eosina (HE) secções coradas de ambos os grupos de ratos diabéticos (Figura 6G e J) não apresentaram quaisquer alterações morfológicas no tumor em relação para os controlos de ratinhos tratados ou citrato (Figura 6A e D). Eles mostraram a diferenciação glandular raro, alto índice mitótico e foram classificadas como Gleason 9 (4 + 5) pelo patologista.
(A) coloração HE de xenoenxertos de tumor da próstata de ratos de controle, os ratos tratados citrato (d), (L) STZ-tratadas antes da implantação do tumor e (J) STZ tratados após a implantação do tumor. (B) coloração AR de xenoenxertos de tumor da próstata a partir de ratinhos não tratados, ratinhos tratados citrato (E), (H) STZ tratados ratinhos antes da implantação do tumor e ratinhos tratados com STZ (K) após a implantação do tumor. (C) Cytokeratine coloração de xenoenxertos de tumor da próstata a partir de ratinhos de controlo, (F) de citrato de ratinhos tratados, (I) em ratos tratados com STZ, antes da implantação do tumor e (G) ratinhos tratados com STZ após a implantação do tumor.
Uma vez que os nossos
in vitro
experimentos mostraram que a hiperglicemia reduziu os níveis de AR decidimos explorar a possibilidade de que STZ-DM estava afetando os níveis de AR
in vivo
. Foi realizada imuno-histoquímica contra o receptor de androgénio, em que os tumores de controlo e ratinhos diabéticos. Os animais de controlo mostraram uma coloração nuclear positiva e forte para o receptor de androgénio em todas as células epiteliais (Figura 6B e E). ratinhos diabéticos mostrou células epiteliais sem coloração ou algumas células com coloração citoplasmática ou nuclear AR, mas a maioria das células eram AR negativa (Figura 6H e K). Nós confirmamos que as células AR negativos eram epiteliais através da realização de uma imuno-histoquímica contra pan-citoqueratina nos tumores de ratos controle, citrato e STZ-DM (Figura 6C, F, I e L).
A seguir, medido mRNA AR níveis em xenoenxertos de controle e ratos STZ-DM e descobrimos que a hiperglicemia reduz os níveis de mRNA AR em tumores de ratos STZ-DM quando comparados com os ratos de controle (Figura 7A). Além disso, como ocorre nas células LNCaP uma regulação negativa dos níveis de AR foi acompanhada por um aumento da fosforilação de p65, uma sub-unidade de NF-kB, em xenoenxertos de ratinhos STZ-DM (Figure7B).
(A) AR Relativa Os níveis de ARNm de citratos e ratos tratados com STZ. Humano 18 S ARNm foi amplificada como um controlo. Os pontos de dados são apresentados como média ± desvio padrão de triplicados. (B) Análise de AR (painel da esquerda) e os níveis de proteína de citrato e ratos tratados com STZ medidos por transferência Western usando PPIA como uma proteína de referência arrumação fosfo-P-65 (painel da direita).
finalmente, as próstatas coradas endógenos de controlo e dois grupos de ratos diabéticos para explorar se hiperglicemia também regula negativamente os níveis endógenos de AR. Com efeito, a coloração de AR foi reduzida em próstatas de ratos STZ-DM quando comparado com os murganhos de controlo (Figura 8).
AR coloração é mostrado em tumores de xenoenxerto de próstata (I) e em próstatas endógenos (II) a partir ratinhos de controlo. coloração AR é mostrado em tumores de xenoenxerto de próstata (iii) e próstatas endógenos (iv) a partir de STZ- ratinhos tratados.
Discussão
PCA é o câncer de órgão sólido mais comum em homens em EUA, Canadá e Austrália, e o segundo tipo de câncer mais comum em homens em todo o mundo. homens norte-americanos têm um risco de vida estimado atual de um em cada seis e PCA representa, depois do câncer de pulmão, a segunda principal causa de mortalidade relacionada com o cancro [1]. fatores de risco estabelecidos de CaP são a idade avançada, raça Africano-americano e um histórico da doença em um parente de primeiro grau. T2D tem sido associada a um baixo risco de desenvolver CaP e este foi recentemente confirmada em uma meta-análise que incluiu 29 coorte e 16 estudos de caso-controle, envolvendo 8,1 milhões de participantes e 132,331 casos CaP [34]. Nossas descobertas dar o primeiro suporte experimental para este conceito.
A via AR desempenha um papel fundamental na integridade estrutural e funcional da próstata, bem como para o crescimento e a progressão CaP [15]. A este respeito, tem sido relatado que o knockdown de AR conduz à inibição do crescimento e apoptose de ambas as células APC e independente de androgénios dependentes de androgénio [35] – [37]. No entanto, o efeito sobre o crescimento de diabetes AR e tumor nunca tinha sido explorada. No presente estudo, nós fornecemos primeira evidência de que a hiperglicemia regula negativamente AR através da activação de NF-kB, e que este efeito inibitório está ainda aumentada por TNFa. Além disso, descobrimos que esta regulação baixa de AR induzida por diabetes está associada com retardo de crescimento significativa do tumor em um
in vivo
da ACP. Gostaríamos de salientar que nos
in vitro
experimentos sempre obtivemos resultados consistentes em termos de redução induzida por glucose de níveis de AR. No entanto, foi detectado uma variabilidade significativa na extensão da redução dos níveis de AR causadas pelo tratamento glicose.
susceptibilidade genética e baixos níveis de insulina, IGF-1 e testosterona estão entre os factores que conferem protecção propostos para CaP na diabetes tipo 2. Por outro lado, o possível papel de dois eventos essenciais que ocorrem na diabetes tipo 2: hiperglicemia e aumento de citocinas pró-inflamatórias (. Ie TNF) não foram examinados previamente
CaP tem uma das relações mais fortes entre a idade para qualquer. câncer humano e fatores genéticos são estimados para representam 42% do risco [15]. É possível que a presença de factores genéticos, tais como variantes TCF2, que estão associadas com a DT2 ambos e ao baixo risco de CaP participar do baixo risco de CaP observado DT2 [20]. No entanto, a relação temporal entre o diagnóstico de DM e risco CaP (como o tempo desde DM-diagnóstico aumenta, o risco de CaP diminui) argumenta fortemente contra este conceito [4]. Em apoio a esta encontramos um menor crescimento de CaP xenofraft no grupo de ratinhos com maior duração do DM.
A insulina é um factor de crescimento para o epitélio da próstata e que também estimula o crescimento de uma linha celular de rato in vitro CaP [38]. Mais recentemente, um estudo experimental relatou intracelular
de novo
steroidogenesis promovido pela insulina em CaP [39], mas o efeito sobre a AR não foi analisado. Estes resultados sugerem que a insulina pode promover directamente a proliferação de células cancerosas da próstata. No entanto, estas observações são baseadas em um modelo experimental para o cancro da próstata resistente à castração, e o efeito da insulina na tumorigénese da próstata na fase precoce ou no cancro hormono-ingénuo (tais como LNCaP) continua por ser elucidado. Além disso, as doses de insulina foram utilizados estudos suprafisiológicas e outros, utilizando doses de insulina na gama picomolar (tal como foi utilizado no presente estudo) são necessários. No cenário clínico, enquanto alguns estudos prospectivos demonstram que pode haver uma associação entre hiperinsulinemia e risco APC, há também vários estudos que não suportam um papel da insulina em risco CaP e, portanto, continua a ser uma área de investigação [4 ], [15]. No entanto, o esgotamento de insulina que ocorre com o aumento da duração do diabetes pode limitar a ação da insulina e, portanto, proteger contra CaP. A este respeito, os homens com baixos níveis de insulina devido a diabetes parecem ter um risco diminuído de desenvolvimento CaP [40], [41]. Na verdade, os baixos níveis de insulina pode ser um factor que contribui envolvido no crescimento do tumor inferior observada nos ratinhos tratados com CaP PAC120 STZ utilizado no presente estudo.
Uma hipótese de como proposto hipoinsulinemia pode diminuir a carcinogénese da próstata é ao limitar a biodisponibilidade do factor de crescimento semelhante a insulina I (IGF-I) [15]. No entanto, estudos recentes sugerem que os níveis de IGF-1 não são significativamente diferentes entre os diabéticos e controlos [41], [42]. Além disso, um estudo prospectivo recente grande concluiu a ausência de correlação entre o nível de plasma de IGF-1 e a resistência à insulina [42]. Portanto, a associação de IGF-1-PCA em tipo 2 população diabética permanece especulativo.
Desde PCA é dependente de androgénio é possível que os níveis mais baixos de testosterona relatados na diabetes a longo prazo (especialmente os homens obesos) pode atingir níveis inferiores a um limiar para um menor risco de CaP [4], [15]. No entanto, é bem reconhecido que relacionar um nível de testosterona no soro para um fenótipo clínico é uma simplificação excessiva, dado que os níveis circulantes de testosterona, se livre ou total, é improvável que refletem com precisão ação dos androgênios ao nível dos tecidos. No entanto, algumas evidências sugerem que baixos níveis de testosterona circulante pode ser um fator de risco para CaP agressividade [43], [44] e isso pode ser uma razão pela qual, quando CaP aparece na diabetes tipo 2 tem um pior prognóstico [15], [44]. A este respeito, é possível que os baixos níveis de AR devido à hiperglicemia, os níveis elevados de TNFa e níveis baixos de testosterona, para além de conferir protecção contra o desenvolvimento CaP também pode agir como um mecanismo para accionamento das células da próstata em direcção um certo grau de independência de androgénio. Na verdade, a activação de NF-kB foi envolvido no crescimento andrógeno-independente do CaP [45]. Uma vez que um APC desenvolve em pacientes diabéticos tipo 2 o que explicaria o seu resultado agressividade e pobres [9] – [11]. Até certo ponto, isso também poderia acontecer em pacientes obesos, uma vez que a obesidade pode reduzir o risco de CaP não-agressivo, enquanto ao mesmo tempo, promover o risco de CaP agressiva [46], [47].
Os mecanismos subjacentes hiperglicemia na regulação de AR não tenham sido anteriormente relatadas. No presente estudo verificou-se que a hiperglicemia regula negativamente AR através da activação de NF-kB, e que este efeito inibidor é ainda maior por TNFa. Além disso, a regulação negativa de AR induzida por diabetes foi associada com uma redução de crescimento do tumor ou mesmo nenhum crescimento tumoral no modelo de ratinho PAC120 CaP tratados com STZ. Além disso, foi detectada uma redução significativa na expressão de AR nas próstatas endógenos deste
In vivo
modelo. Em geral, os nossos resultados sugerem que os dois componentes essenciais do DT2: hiperglicemia e da citocina pró-inflamatória TNF participa na redução do risco de CaP em DM2.