estatuto

Abstract

Fundo

receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) mutação é o indicador mais valioso na triagem de câncer de pulmão de células não pequenas-(NSCLC) pacientes para inibidor da tirosina quinase (TKI) terapia. métodos precisos, rápidos e econômicos de detectar mutações EGFR se tornaram importantes. A utilização de dois anticorpos específicos para a mutação alvo a mutação delE746-A750 no exão 19 e mutação L858R no exão 21 faz esta tarefa possível, mas a falta de critérios consensualmente aceitáveis ​​para resultados positivos limita a aplicação desta descoberta de mutação baseada em anticorpos.

Métodos

foram coletadas 399 amostras de pacientes com NSCLC (espécimes 145 ressecção, 220 amostras de biópsia e 34 espécimes de citologia) cujo estado de mutação EGFR havia sido detectado pelo ensaio TaqMan PCR. Imuno-histoquímica (IHQ) analisa usando EGFR anticorpos específicos de mutação foram empregados para todas as amostras. Após a coloração e pontuação, a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) foram calculados de acordo com diferentes níveis de graus positivos em comparação com os resultados do ensaio baseado em PCR.

resultados

Em análises baseadas em IHC, 144 casos foram marcados 0, 104 casos foram marcados 1+, 103 casos foram marcados 2+, e 48 casos foram marcados 3+. Com os resultados de base molecular foram definidos como o “padrão de ouro”, a prevalência de mutação foi de 6,94% (10/144), 23,08% (24/104), 67,96% (70/103) e 100% (48/48 ), respectivamente, para as amostras com pontuações 0, 1+, 2+ e 3+. Quando 3+ pontuação foi considerada positiva, a especificidade eo VPP foram de 100%; se marcar apenas 0 foi considerado negativo, obteve-se 93,06% NPV.

Conclusão

Os pacientes com escore 3+ tem uma PPV perfeito (100%), e pode aceitar o tratamento TKI diretamente, sem qualquer molecular ensaios baseados. Pacientes com pontuação 0 teve alta NPV (93.06%), o que poderia atingir 97,22%, quando a detecção de EGFR totais foi aplicado. No entanto, as amostras com escore 1+ ou 2+ não são confiáveis ​​e necessitam de uma verificação posterior de estado da mutação EGFR por ensaios moleculares baseados em

Citation:. Jiang G, Fan C, Zhang X, Dong Q, Wang L, Liu Y, et al. (2013) Verificar um algoritmo de diagnóstico apropriado usando EGFR Anticorpos Mutation-específicas para detectar o estado do EGFR em Non-Small-Cell Lung Cancer. PLoS ONE 8 (3): e59183. doi: 10.1371 /journal.pone.0059183

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japão

Recebido: 18 de dezembro de 2012; Aceito: 12 de fevereiro de 2013; Publicação: 11 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Jiang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (bolsas 81071905 e 81272606 para EHW). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Desde o início da utilização dos inibidores de crescimento epidérmico tirosina-quinase do receptor do factor (EGFR-TKI) gefitinib e erlotinib para o tratamento de cancro do pulmão de células não pequenas avançado (NSCLC) [1], estudos têm demonstrado que pacientes com NSCLC com mutações de activação de EGFR podem beneficiar do tratamento de TKI [2], [3]. O estado de mutações de EGFR tornou-se o melhor preditor da resposta ao TKI [4] – [9]. A sequenciação directa é o método “padrão de ouro” para a detecção de mutações de EGFR. No entanto, sua sensibilidade é relativamente baixo; Se a percentagem de células tumorais é 25%, a probabilidade de um resultado falso-negativo é grandemente aumentada. Devido à falta de um número suficiente de células tumorais disponíveis para a extracção de ADN de alta qualidade, a probabilidade de obter um falso-negativo é aumentada ao testar uma pequena biópsia ou citologia amostra. No entanto, cerca de 70% dos cancros do pulmão são diagnosticados em estágios avançados pelo qual pequenas biópsias e espécimes citológicos são a única fonte de material para o teste diagnóstico e mutação. Recentes avanços em métodos moleculares permitiram um desenvolvimento de métodos mais sensíveis para detectar mutações. Tais métodos incluem em tempo real da reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qRT-PCR) utilizando sondas específicas (ensaio de PCR TaqMan), sistema de mutação refractária amplificado (ARMS) e análise de fusão de alta resolução (HRMA) [10] – [14]. No entanto, elas são caras e exigem invariavelmente boas condições experimentais e instrumentos sofisticados. Assim, eles são raramente aplicados em hospitais não docentes.

imuno-histoquímica (IHQ) analisa também pode ser usado para triagem de mutações EGFR. Yu et al. anticorpos desenvolvidos específica de EGFR-mutação monoclonais de coelho contra EGFR com a supressão E746-A750 no exão 19 ou a mutação pontual L858R que mostrou boa consistência em comparação com ensaios moleculares baseados em [15] – [26]. No entanto, a aplicação prática deste método foi severamente limitada devido à diferença apreciável nos critérios utilizados para resultados positivos entre as diferentes equipas de investigação. Alguns pesquisadores marcou de dados de acordo com a intensidade de coloração, e dividiu as amostras em quatro graus: 0, 1+, 2+ e 3+. No entanto, alguns autores preconizam uma pontuação acima de 1+ para ser considerado positivo, e outros ainda argumentou que uma pontuação acima de 2+ devem apresentar resultados positivos. As especificidades destas duas abordagens foram relativamente perto (96-100%), mas as suas sensibilidades variou muito (47-92%) [15] – [19]. Alguns pesquisadores também obteve uma pontuação para a expressão multiplicando a intensidade de coloração pela percentagem de área de coloração (0-300 ou 400), e, respectivamente, defendeu uma pontuação de 10 ou 20 a ser classificado como positivo, mas uma diferença sensível em sensibilidades (42,2-100%) e as especificidades (77-100%) foi observada [20] – [22]. Recentemente, Kawahara et ai. propôs que imunocoloração deve ser classificado como positivo (escore de 2+), negativa (0 ponto) ou equívoca (pontuação de 1+), indicando expressão questionável, negativo ou fraca, respectivamente, o que pode obter uma sensibilidade de 81,4%, especificidade de 97,5%, valor preditivo positivo (PPV) de 94,6% e valor preditivo negativo (VPN) de 90,6% [23]. Consenso de um critério universalmente aceito para “positiva” está faltando, o que dificulta seriamente o uso clínico do anticorpo específico de mutação EGFR para detectar mutações EGFR.

No presente estudo, foram analisados ​​os resultados de IHQ de 399 amostras de pacientes com NSCLC, que foram marcados por um método de classificação de quatro tendo em conta a intensidade e a área de coloração. Em seguida, compararam os resultados com um ensaio molecular baseados em explorar a possibilidade de rastreio de mutações EGFR em amostras de NSCLC por IHC analisa.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Todos os tecidos e células humanas foram obtidas de acordo com protocolos de pesquisa sujeito humano aprovados pela China University Medical Review Board. tecidos e células tumorais foram obtidas com consentimento informado por escrito de pacientes adultos com NSCLC.

Specimen seleção ea molecular baseados em ensaio

Foram coletadas 399 amostras (145 espécimes de ressecção, 220 amostras de biópsia e 34 espécimes de citologia) de pacientes com NSCLC que tinham solicitado para o ensaio molecular baseados em de mutações EGFR no Departamento de Patologia da China Medical University (Shenyang, China) a partir de agosto de 2008 a agosto de 2012. a faixa etária dos pacientes com câncer de pulmão foi de 26 -89 anos (mediana, 62 anos); havia 214 homens e 185 mulheres. Os tipos histológicos foram 341 adenocarcinomas, 47 carcinomas de células escamosas, e 11 outros tipos (Tabela 1). O estado de mutação do EGFR de cada espécime foi detectada pelo ensaio TaqMan PCR. Ressecção e biópsia tecidos foram fixados em formol a 10% e embebidos em parafina. Os sobrenadantes das amostras de efusão pleural foram removidos por centrifugação, e os componentes celulares remanescentes foram então fixadas em formalina a 10% e embebidos em parafina. Os blocos de parafina foram cortadas com uma espessura de 8 mm para investigação de mutações no gene de EGFR baseadas em PCR. As mutações do gene de EGFR foram examinados nos exões 19 e 21, utilizando o ensaio TaqMan PCR. O ADN genómico a partir de amostras de tecido ou de citologia e embebidas em parafina foi extraída e purificada utilizando um estojo QIAamp DNA Micro (Qiagen, Valencia, CA, EUA). Os primers para sondas de detecção de mutação e TaqMan segmentação E746-A750 e mutações de deleção L747-P753insS no exão 19, e L858R e mutações pontuais L861Q no exon 21 foram adquiridos a partir GP Medical Technologies (Pequim, China). O ensaio TaqMan PCR foi realizada utilizando um sistema de tempo real de PCR 7900HT (Applied Biosystems, Foster, CA, EUA).

analisa IHC

Os blocos de parafina foram cortadas para uma espessura de 4 mm para a imunocoloração. Convencional de-depilação e tratamento de hidratação foram realizados utilizando xileno e uma série graduada de etanol, respectivamente. As amostras foram fervidas em um banho-maria a 100 ° C durante 20 min em 1 mmol /L de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) a pH 9,0 e solução de recuperação de alvo (Dako, Glostrup, Dinamarca) para recuperar antigénios. A actividade da peroxidase intrínseca foi bloqueada por tratamento com reagente de bloqueio de peroxidase (Dako) durante 15 min à temperatura ambiente. Os pontos de ligação não específicos foram bloqueados por incubação com soro de cabra não imune normal, durante 15 min à temperatura ambiente. Após lavagem em solução salina tamponada com Tris (TBS; Dako) durante 15 min, três anticorpos primários (isto é, o anticorpo monoclonal de EGFR (D38B1), delE746-A750 anticorpo monoclonal específico de mutação (6B6) e anticorpo monoclonal específico de mutação L858R (43B2) ; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) foram separadamente diluídos em 1:400 e adicionados às amostras. As amostras foram incubadas a 4 ° C durante a noite, lavadas em TBS durante 15 minutos, e incubada com polímero marcado com peroxidase de rábano-anticorpo secundário (kit ChemMate Envision; DAKO) durante 30 min à temperatura ambiente. Após lavagem em TBS durante 15 minutos, as lâminas foram visualizadas utilizando 3,3′-diaminobenzidina.

IHC pontuação

A pontuação coloração IHC foi baseado na intensidade de coloração e a percentagem de área em coloração a membrana e /ou citoplasma da célula tumoral. Foram utilizados quatro tipos: 0, 1+, 2+, 3+. Zero denotado sem coloração; 1+ denotado coloração amarelo claro sem partículas óbvias ou coloração amarela com partículas óbvias em 10% das células tumorais; 2+ denotado coloração amarela com partículas óbvias em 10% de células tumorais ou de manchas castanhas com partículas óbvias em 10% das células tumorais; e 3+ denotado coloração marrom com partículas óbvias em células tumorais de 10%. avaliação de coloração foi realizada somente se 5 células tumorais estavam presentes em uma biópsia por agulha ou a amostra de citologia. Todas as análises de imuno-histoquímica foram avaliados por três investigadores experientes (YL, JHY e YZ) que desconheciam as condições clínicas dos pacientes ou diagnóstico patológico.

Análise estatística

A sensibilidade, especificidade, VPP e VPN do ensaio à base de IHC foram calculadas utilizando o ensaio de base molecular como referência. O acordo entre as 2 técnicas foi calculada utilizando Cohen κ. Todos os dados foram analisados ​​usando SPSS 13.0 for Windows.

Resultados

-based Molecular estado mutacional EGFR de 399 amostras de NSCLC

Um total de 399 amostras de NSCLC foram detectadas utilizando o TaqMan ensaio de PCR. Uma mutação do EGFR foi detectada em 162 casos (40,6%, 162/399). Isto incluiu um (E746-A750) mutação E19 deleção em 86 casos (21,55%, 86/399), E21 (L858R) mutações pontuais em 70 casos (17,54%, 70/399), ambos E746-A750 e mutações L858R em 4 casos, as mutações E19 (L747-P753insS) deleção em 4 casos (1,03%, 4/399), E21 (L861Q) mutações pontuais em 6 casos (1,5%, 6/399), e nenhuma mutação em 237 casos (59,4%, 237/399). A taxa de mutações em amostras de ressecção foi 40,69% (59/145), em amostras de biópsia foi 36,82% (81/220) e em amostras de citologia foi 35,29% (12/34).

Análises comparativas de IHC-base e de base molecular EGFR estado mutacional

Os padrões de coloração de anticorpo específico de mutação do EGFR são mostrados na Figura 1. Fora de 399 espécimes de NSCLC, 144 foram classificados de 0 (em que 10 casos abrigavam mutações de EGFR e a taxa de mutações nesta categoria foi de 6,94%, 10/144); 104 casos foram marcados 1+ (houve 24 casos de mutações de EGFR e a taxa de mutação foi de 23,08%, 24/104); 103 casos foram marcados 2+ (EGFR mutações estavam presentes em 70 casos ea taxa de mutações foi 67,96%, 70/103); 48 casos foram marcados 3+ (48 casos nutria mutações de EGFR, e a taxa de mutação foi de 100%, 48/48). Os resultados detalhados são apresentados na Tabela 2. As amostras marcou 3+ tem uma PPV perfeito (100%), e aqueles marcou o 0 tem uma boa NPV (93.06%).

imunocoloração Representante de ambas as amostras histológicas e citologia em pacientes com NSCLC (A, D, G e J, espécimes de ressecção, 200 ×; B, e, H e K, as amostras de biópsia, 200 ×; C, F, I e L, as amostras de citologia, 400 ×). Foram utilizados quatro tipos: 0, 1+, 2+ e 3+. 3+ denotado coloração castanha com partículas óbvias em 10% de células tumorais (A, B e C); 2+ denotado coloração amarela com partículas óbvias em 10% de células tumorais ou de manchas castanhas com partículas óbvias em 10% de células tumorais (D, E e F); 1+ denotado coloração amarelo claro sem partículas óbvias ou coloração amarela com partículas óbvias em 10% de células tumorais (G, H e I); Zero denotado sem coloração (J, K e L).

O acordo entre os ensaios baseados em IHC e de base molecular de acordo com diferentes níveis de graus positivos foi calculada utilizando Cohen κ. Quando os grupos com pontuação de 0 ou 1+ foram considerados como negativos, e aqueles com pontuação de 2+ ou 3+ foram considerados positivos, o acordo entre os 2 métodos de detecção diferentes foi mais elevada (κ = 0,644). No entanto, haveria 24 casos falso-negativos (23,08%, 24/104) no grupo de escore 1+ e 33 casos falso-positivos (32,04%, 33/103), em que a pontuação 2+, resultando em uma sensibilidade de 77,63%, especificidade de 86,64%, VPP de 78,14% e VPL de 86,4% para a detecção por imunohistoquímica. Nenhum desses valores era ideal (mostrado na Tabela 3).

Com o teste molecular como padrão, o anticorpo específico de mutação delE746-A750 (6B6) poderia detectar 69 dos 86 casos com um E746 mutação -A750 deleção (40 com pontuação 2+ e 29 com escore 3+) Considerando que foi negativa nos restantes 17 casos (4, com pontuação de 0 a 14 anos com pontuação 1+) (κ = 0,584, sensibilidade: 80,23%, especificidade: 85,3%, PPV: 60%, NPV: 94,01%); o L858R anticorpo específico de mutação (43B2) conseguiu identificar 53 de 70 casos com uma mutação pontual L858R (31 com pontuação 2+ e 22 com 3+), ao passo que era negativa nos restantes 17 casos (7 com pontuação 0 e 10 com pontuação 1+) (κ = 0,639, sensibilidade: 75,71%, especificidade: 91,79%, PPV: 66,25%, NPV:. 94.67%)

Além disso, nós também detectou EGFR total em todos os 399 casos com o anticorpo monoclonal contra o EGFR. Os resultados mostraram 27 casos foram marcados 0, 38 casos foram marcados 1+, 193 casos foram marcados 2+, e 141 casos foram marcados 3+. anticorpo monoclonal EGFR (D38B1) é diferente dos dois anticorpos específicos de mutações. anticorpo específico de mutação DelE746-A750 (6B6) pode reconhecer especificamente as proteínas de EGFR com uma mutação de deleção E746-A750 no exão 19, e o anticorpo específico da mutação L858R (43B2) é capaz de identificar especificamente a proteína EGFR com um ponto de mutação L858R no exon 21; Em contraste, o anticorpo monoclonal de EGFR (D38B1), que não é um anticorpo específico de mutação, identifica a proteína total de EGFR, independentemente do estado de mutação. Embora EGFR total era altamente expressa na maioria dos casos, ainda havia 38 casos com escore 1+ e 27 casos com escore 0, em que 12 casos foram testaram positivo para mutações no gene EGFR pelo método molecular. Isto pode ser explicado pelo fato de que os níveis de EGFR total, em células de tumor são tão baixos, que a coloração dos dois anticorpos específicos de mutação pode ser negativo, em alguns casos, mesmo que eles têm mutações no gene de EGFR detectadas (como mostrado na figura S1). Portanto, a detecção do nível de EGFR total, utilizando o anticorpo EGFR monoclonal (D38B1) pode prevenir o surgimento de resultados falsos-negativos semelhantes acima, enquanto as sensibilidades de delE746-A750 e anticorpos específicos de mutação L858R poderia ser aumentada para 82,56% e 90% respectivamente.

a análise comparativa dos resultados baseados em IHC de espécimes de ressecção, biópsia e citologia

os padrões de coloração de espécimes de ressecção utilizando anticorpos específicos para a mutação EGFR foram mostrado na Figura 2. de acordo com o nosso marcando critérios, dos espécimes de ressecção 145, 52 foram marcados 0, em que 2 casos abrigavam mutações EGFR e a taxa de mutação foi de apenas 3,85% (2/52); 40 casos foram marcados 1+, em que houve 10 casos de mutações de EGFR e a taxa de mutação foi de 25% (10/40); 35 casos foram marcados 2+, em que as mutações de EGFR estavam presentes em 29 casos, e a taxa de mutação foi de 82,56% (29/35); 18 casos foram marcados 3+, em que 18 casos nutria mutações de EGFR, e a taxa de mutação foi de 100% (18/18). Os resultados detalhados são apresentados na tabela 2.

A proteína EGFR total das amostras de ressecção poderiam ser coradas com o EGFR (D38B1) anticorpo (A, D e G, 200 ×). Amostras sem mutações de EGFR não foram coradas com dois anticorpos específicos de mutação (B e C, 200 ×). As amostras com mutação E746-A750 exclusão foram coradas com exclusão E746-A750 (6B6) anticorpo específico (E, 200 ×) e as amostras com mutação L858R foram coradas com L858R mutante (43B2) anticorpo específico (I, 200 ×).

as características de coloração de amostras de biópsia, utilizando anticorpos específicos para a mutação EGFR foram mostrado na Figura 3. de acordo com os nossos critérios de pontuação, dos espécimes de ressecção 220, 77 casos foram marcados 0, em que 6 abrigavam mutações EGFR e do taxa de mutação foi de 7,79% (6/77); 55 casos foram marcados 1+, em que 10 casos abrigavam mutações EGFR e a taxa de mutação foi 18,18% (10/55); 60 casos foram marcados 2+, em que abrigava 37 mutações de EGFR, e a taxa de mutação foi de 61,67% (37/60); 28 casos foram marcados 3+, em que 28 casos nutria mutações de EGFR, e a taxa de mutação foi de 100% (28/28). Os resultados detalhados são apresentados na Tabela 2.

A proteína EGFR total das amostras de biópsia poderia ser marcadas com EGFR (D38B1) anticorpo (A, D e G, 40 × e no canto superior esquerdo 200 ×). Amostras sem mutações de EGFR não foram coradas com dois anticorpos específicos de mutação (B e C, 40 × e o canto superior esquerdo 200 ×). As amostras com mutação de deleção E746-A750 foram coradas com E746-A750 deleção (6B6) anticorpo específico (E, 40 × e o canto superior esquerdo 200 ×) e as amostras com mutação L858R foram coradas com L858R mutante (43B2) anticorpo específico (I, 40 × e no canto superior esquerdo 200 ×).

as características de coloração de espécimes citológicos utilizando anticorpos específicos de mutação do EGFR foram mostrado na Figura 4. de acordo com nossos critérios de pontuação, dos espécimes de citologia 34, 15 casos foram marcados 0, em que 2 casos abrigavam mutações EGFR e a taxa de mutação foi 13,33% (2/15); 9 casos foram marcados 1+, em que 4 casos tinham mutações EGFR e a taxa de mutação foi 44,44% (4/9); 8 casos foram marcados 2+, em que 4 continha mutações de EGFR, e a taxa de mutação foi de 50% (08/04); 2 casos foram marcados 3+, em que 2 casos nutria mutações de EGFR, e a taxa de mutação foi de 100% (02/02). Os resultados detalhados são mostrados na Tabela 2.

A proteína EGFR total das amostras de citologia poderiam ser coradas com o EGFR (D38B1) anticorpo (A, D e G, 400 ×). Amostras sem mutações de EGFR não foram coradas com dois anticorpos específicos de mutação (B e C, 400 ×). Amostra com mutação de deleção E746-A750 foram coradas com exclusão E746-A750 (6B6) anticorpo específico (E, 400 ×) e as amostras com mutação L858R foram coradas com L858R mutante (43B2) anticorpo específico (I, 400 ×).

Quando a pontuação 3+ foi considerado positivo, a especificidade e VPP no ensaio à base de IHC foi de 100% para todos os três tipos de amostras. Quando a pontuação de 0 foi considerado negativo, os espécimes de ressecção resultou no maior VPL (96,15%), seguido de amostras de biópsia (92,21%) e espécimes de citologia teve a menor NPV (88,24%). Quando a pontuação de 0 e 1+ foram considerados negativos e marcar 2+ e 3+ considerado positivo, a especificidade de amostras de ressecção teve o maior NPV (93.02%), seguido de espécimes de biopsia (83,45%), e os espécimes citológicos tinha o menor NPV (81,82%) (Tabela 3).

Havia 12 pacientes com ambas as ressecção e citologia espécimes em nossas amostras, e 6 deles mutações EGFR abrigavam (3 casos de mutação de deleção E746-A750 e 3 casos de mutação pontual L858R) por ensaio de base molecular. Por ensaio à base de IHC sobre as amostras de ressecção, 4 das 6 amostras com mutações de EGFR foram identificados como tendo pontuação de 3+, e os outros 2 foram identificados como tendo uma pontuação de 2+. Em contraste, nos espécimes de citologia, apenas 1 caso teve uma pontuação de 3+ e 1 caso teve uma pontuação de 2+, e os outros 4 casos foram todos pontuação 1+. Nos 6 amostras sem uma mutação EGFR, apenas 1 caso teve uma pontuação de 1+ através de ensaio baseado em IHC sobre os espécimes de ressecção, e as outras cinco amostras tinham uma pontuação de 0. Em contraste, os resultados sobre os espécimes de citologia correspondentes incluídos uma pontuação de 2+ em 1 caso, pontuação 1+ em 1 caso, e marcar 0 nos outros 4 casos (Tabela 4).

Discussão

mutações EGFR pode ser detectado em NSCLC de IHC por métodos que utilizam anticorpos específicos para o EGFR mutante. No entanto, devido às diferenças consideráveis ​​entre os critérios de positividade definidas por diferentes grupos de pesquisa, os leitores ou diagnosticadores pode ser confundida com ou mesmo enganados por no que diz respeito a uma aplicação prática deste método. Portanto, uma pesquisa mais ampla é necessária para chegar a um consenso. Os resultados do presente estudo e outros relatos [15] – [19], [23] sugerem que os critérios de classificação com base na intensidade de coloração da membrana e /ou citoplasma das células tumorais e a percentagem da área de coloração (que foi dividido em quatro graus: 0, 1+, 2+ e 3+) pode ser o melhor de todos os sistemas de pontuação disponíveis. O acordo entre ensaios baseados em molecular IHC-based e foi calculado usando Cohen κ de acordo com diferentes níveis de classificação imunohistoquímica. Embora o acordo entre os métodos de ensaio 2 foi mais elevada (κ = 0,644) quando o escore 2+ e 3+ foram considerados positivos, ainda havia 33 casos falso-positivos (32,04%, 33/103) na pontuação casos 2+ e 24 casos falso-negativos (23,08%, 24/104) na pontuação casos 1+, resultando em uma sensibilidade de 77,63%, especificidade de 86,64%, VPP de 78,14% e VPL de 86,4%, nenhum dos quais era o ideal. Assim, com um ensaio molecular como um padrão, mesmo se uma amostra é classificado como positivo pelo método de IHQ, o ensaio molecular à base pode ainda ser necessária para verificar o estado de mutação do EGFR, e, portanto, o rastreio de mutações de EGFR por IHC não ser parece aplicável. Mesmo que o número de casos falso-positivos tem sido muito poucos em outros estudos [15] – [19], na sequência de detecção molecular não pode ser totalmente abandonada. Neste estudo, observou-se que as amostras com uma pontuação de 3+ teve um VPP perfeito (100%), e marcar 0 amostras tinham uma boa NPV (93.06%). Se uma pontuação de 3+ é considerado como um critério positivo, os pacientes com amostras positivas por ensaio à base de IHC pode receber directamente a terapia de TKI sem necessidade de verificação por um teste molecular. A aplicabilidade da terapia de TKI pode ser avaliada por imuno-histoquímica rapidamente usando anticorpos específicos para a mutação do EGFR em quase 50% de todos os pacientes (marcados como aqueles 0 ou 3+). A probabilidade de mutações em amostras com uma pontuação de 1+ foi de cerca de 23,08%, e uma probabilidade de nenhuma mutação neles era 76,92%, de acordo com nossa análise. A taxa de mutação nas amostras com uma pontuação de 2+ foi de 67,96%, o que sugere fortemente a possibilidade de uma mutação do EGFR neste grupo. Depois disso, se usado corretamente, o rastreio estado da mutação EGFR por imuno-histoquímica pode ter um valor de diagnóstico para a tomada de decisão terapêutica, especialmente em um centro médico que não tem uma capacidade de teste molecular.

Tal como recomendado Wu et al. [22], a expressão do EGFR total foi também testado em todos os casos 399 no nosso estudo. Ao contrário dos dois anticorpos específicos de mutação, anticorpo monoclonal EGFR (D38B1) identifica a proteína total de EGFR, independentemente do estado de mutação. Porque os níveis de EGFR total, em certos casos, são muito baixos, as proteínas mutantes não podem ser detectadas usando dois anticorpos específicos de mutação, embora os casos Harbor mutada do gene de EGFR (como mostrado na Figura S1). No entanto, utilizando o anticorpo monoclonal de EGFR (D38B1) em combinação com anticorpos específicos para a mutação probabilidade reduzida resultados falso-negativos por nossa análise. Com esta abordagem, as sensibilidades de anticorpos específicos de mutação delE746-A750 e L858R poderia ser aumentada para 82,56% e 90%, respectivamente. A sensibilidade de anticorpos específicos para a mutação L858R (43B2) parece maior do que o anticorpo específico delE746-A750-mutação (6B6), o que é consistente com o que foi relatado por Ambrosini-Spaltro A et al [16].

além disso, temos realizado uma análise comparativa dos resultados baseados em IHC em amostras de ressecção, biópsia e citologia. Quando uma contagem de 2+ foi considerado positivo, a taxa de valores falsos-positivos para amostras de ressecção foi apenas 17,14% (6/35), ao passo que os valores das taxas de falsos-positivos para espécimes citológicos e biópsias foram 38,33% (23 /60) e 50% (08/04), respectivamente. Esta constatação sugeriu que, devido à quantidade menor de tecidos e células tumorais do que as amostras de ressecção, a heterogeneidade das células tumorais na biópsia ou citologia amostras podem tornar-se mais proeminente, e, assim, causar um aumento da variabilidade dos resultados de teste. Para além do número limitado de células tumorais no líquido pleural (citologia amostra), a composição de componentes celulares era mais complexo, que muitas vezes inclui muitos glóbulos vermelhos, células inflamatórias e as células mesoteliais, e, assim, dilui as células tumorais. Embora espécimes citológicos pode ser utilizado para ambos os ensaios de base molecular e baseados em IHC, o último ensaio tende a mostrar valores mais falsos-negativos em comparação com amostras de tecido (especialmente quando comparado com as amostras de ressecção). Isto pode explicar uma redução acentuada da sensibilidade de detecção de mutantes em espécimes citológicos (Tabela 3). Além disso, examinaram 12 casos com ambas as amostras de ressecção e citologia recolhidos. Destes, seis mutações de EGFR abrigado por ensaio de base molecular e o outro 6 não fez. Quando a pontuação de 3+ foi usado como um limite, ensaio baseado em IHC conseguiu identificar 4 dos 6 amostras com mutações EGFR em amostras de ressecção, mas detectar apenas 1 caso em amostras de citologia. Se a pontuação ≥2 + foi aplicada, o ensaio poderia identificar todos os 6 casos com mutações EGFR em amostras de ressecção, mas detectar apenas 2 dos 6 casos em espécimes de citologia. Estes resultados sugerem que, no que diz respeito à detecção baseada IHC de mutações EGFR, espécimes de ressecção foram muito melhor do que amostras de biópsia e amostras de biópsia foram significativamente melhores do que os espécimes de citologia.

Em teoria, as proteínas EGFR na membrana celular ou em citoplasma desempenham papéis diferentes em células tumorais e tem interacção diferente com TKI. No entanto, os efeitos do tratamento com inibidores da tirosina quinase em pacientes que apresentam uma distribuição subcelular diferente do EGFR em células tumorais ainda não foram bem ainda investigado. Como relatado anteriormente, observou-se que o EGFR poderia localizar na membrana da célula tumoral, no citoplasma ou ambos na membrana e no citoplasma por análise de imuno-histoquímica. A fim de determinar as características funcionais de diferentes distribuições subcelulares em proteínas EGFR, procurou-se analisar uma potencial correlação entre o estado de mutação do EGFR e distribuição subcelular das proteínas, mas descobriu nenhuma correlação entre eles. Em vez disso, a intensidade de coloração mostra uma forte correlação com o estado de mutação do EGFR. Portanto, a coloração de “da membrana e /ou citoplasma” foi igualmente considerado em conjunto e no nosso sistema de pontuação.

A actividade elevada da proteína EGFR no cancro do pulmão é devido às mutações de activação, mas as amplificações de genes pode também desempenhar um papel significativo. Neste estudo, 334/399 (83,7%) casos de NSCLC foram demonstradas ter expressão elevada de proteína EGFR (≥2 +) usando anticorpo monoclonal, a taxa muito mais elevada do que a detecção padrão ao nível genético (40,6%). Ela continua a ser investigados se esta expressão elevada de EGFR, em alguns casos, sem mutações detectáveis ​​é mediada por ampification do seu gene ou outros mecanismos alternativos. Quer ou não o TKI pode ser empiricamente aplicada a estes doentes deve ser verificada por meio de estudos experimentais adicionais e ensaios clínicos.

Em resumo, de acordo com nossas análises de estado da mutação EGFR por IHC, os pacientes com uma pontuação de 3 + teve um VPP perfeito (100%), e pode aceitar o tratamento TKI directamente, sem necessidade de um ensaio molecular à base de confirmação. Os pacientes com uma pontuação de 0 teve um alto VPN (93.06%). No entanto, as amostras com escore 1+ ou 2+ não são confiáveis ​​e necessitam de uma verificação posterior de estado da mutação EGFR por ensaio molecular baseada. Portanto, usando o nosso algoritmo de diagnóstico, em quase metade de todos os pacientes (pacientes com escores 0 ou 3 +), uma aplicabilidade da terapia de TKI poderia ser determinado por imuno-histoquímica e teste molecular mais complexo, caro ser evitado. As amostras com pontuação 0 em ensaio à base de IHC com os anticorpos específicos para duas mutações de EGFR deve ser ainda testados quanto à expressão do EGFR EGFR total, utilizando o anticorpo monoclonal (D38B1), a fim de reduzir ainda mais a taxa de falsos negativos (Figura 5). Aqui juntos, em comparação com o uso de ensaio à base de IHC por si só, esta abordagem integrada combinando IHC- e ensaios de base molecular demonstra uma sensibilidade mais elevada (97,37%), especificidade (100%) e valor κ (0,979), e é, portanto, mais prático para os pacientes selecionados para uma possível terapia de TKI. Nosso algoritmo de diagnóstico pode potencialmente otimizar opções terapêuticas, reduzir custos e economizar tempo.

“IHC” refere-se a imuno-histoquímica.

Informações de Apoio

Figura S1. Tours A resultados falsos negativos mutação de IHC, devido ao baixo nível de EGFR total. O nível de EGFR total, em células tumorais foi tão baixa (A e D, 200 ×) de que as proteínas mutantes foram indetectáveis ​​com anticorpos específicos para a mutação em certos casos (B, C, E e F, 200 ×), embora as mutações eram identificado por ensaio molecular baseada nos casos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0059183.s001

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Reconhecimentos

o estudo foi realizado de acordo com o regulamentos dos conselhos de revisão institucionais a China Medical University.