Abstract

Enquanto Mesd foi descoberto como um retículo endoplasmático molecular especializado chaperona para o Wnt co-receptores Lrp5 e LRP6, Mesd proteína recombinante é capaz de se ligar a amadurecer e Lrp5 LRP6 na superfície celular e actua como um antagonista universal de LRP5 /6 moduladores. No nosso estudo anterior, verificou-se que a região C-terminal da Mesd, que está ausente em sequências de invertebrados, é necessária e suficiente para a ligação a amadurecer LRP6 na superfície da célula. Nos presentes estudos, caracterizada ainda mais a interacção entre o péptido Mesd região C-terminal e Lrp5 /6. Descobrimos que os peptídeos derivados de região Mesd C-terminais bloquear Mesd ligação a Lrp5 na superfície da célula também. Nós também mostraram que existem dois locais LRP5 /6 de ligação dentro Mesd região C-terminal que contêm vários resíduos carregados positivamente. Além disso, demonstrou-se que o péptido de região Mesd C-terminal, como a proteína de comprimento completo Mesd, bloqueada e Wnt-3a- induzida Rspodin1 a sinalização de Wnt /β-catenina em LRP5- e LRP6- células que expressam, suprimiu de Wnt /β-catenina sinalização em células humanas da mama Hs578T e células PC-3 de cancro da próstata, e proliferação de células cancerosas inibida, embora a proteína de comprimento completo Mesd é mais potente do que o seu péptido. Finalmente, verificou-se que a citotoxicidade do tratamento da proteína Mesd de comprimento completo e o seu péptido de região do terminal C significativamente aumentada agente de quimioterapia Adriamicina-induzida em Hs578T e células PC-3. Em conjunto, os nossos resultados sugerem que a região Mesd C-terminal constitui o domínio /6 de ligação Lrp5 grande, e que a proteína Mesd e o seu péptido de região C-terminal tem um valor terapêutico potencial no cancro

citação:. Lin C , Lu W, Zhang W, Londoño-Joshi aI, Buchsbaum DJ, Bu G, et al. (2013) O C-Terminal Região Mesd Peptide Mimics Full-Length Mesd e actua como um inibidor de Wnt /β-catenina de sinalização em células cancerosas. PLoS ONE 8 (2): e58102. doi: 10.1371 /journal.pone.0058102

editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de maio de 2012; Aceito: 03 de fevereiro de 2013; Publicação: 28 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da National Institutes of Health RO1CA124531 (para YL) e do Instituto Nacional do Câncer conceder CA 13148 (ao Cancer Center UAB Comprehensive). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Yonghe Li e Guojun Bu são listados como inventores em uma patente para o uso de Mesd na doença óssea e câncer, e Guojun Bu serve como consultor para Raptor Pharmaceutical, que licenciou esta patente da Universidade de Washington em St. Louis. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A lipoproteína de baixa densidade do receptor-proteína relacionada-5 (Lrp5) e LRP6 são dois membros da família em expansão do receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDLR). Os receptores Frizzled (FZD) pode responder às proteínas Wnt apenas na presença do co-receptor Lrp5 Wnt ou LRP6 para activar a via β-catenina canónica. Na ausência de Wnts, β-catenina é sequestrado em um complexo que consiste na supressão tumoral adenomatous polyposis coli (APC), Axin, glicogénio sintase quinase-3β (GSK3β), e de caseína-quinase 1 (CK1). Esta formação do complexo induz a fosforilação de β-catenina por CK1 e GSK3β, o que resulta na ubiquitinação e subsequente degradação de β-catenina pelo proteassoma 26S. A acção deste complexo é inibida por ligação de Wnt aos seus receptores de superfície celular FZD e LRP. Os resultados na estabilização de citosólica β-catenina, que, em seguida, entra no núcleo para formar um complexo com os factores de transcrição do factor do factor de células T /reforço linfóide ligação LRP-Wnt-FZD (TCF /LEF) a família para activar a transcrição de alvo Wnt genes que regulam o ciclo celular, o crescimento e a progressão [1] -. [3]

Lrp5 LRP6 e são submetidos a modulação por várias proteínas secretadas que se ligam aos módulos extracelular β-hélice /EGF repetidas de Lrp5 /6 [3]. proteínas Wnt e Rspondin (RSPO) são dois grupos de Wnt /sinalização β-catenina agonistas. Semelhante a ligandos Wnt, a acção de proteínas RSPO na sinalização de Wnt /β-catenina requer o Wnt receptores FZD e Lrp5 /6, embora a ligação directa entre RSPO e Lrp5 /6 é controverso [4] – [8]. Além disso, as proteínas são capazes de RSPO sinergia com ligandos para activar Wnt Wnt /β-catenina sinalização [5], [8], [9].

Enquanto Mesd foi descoberto como um retículo endoplasmático molecular especializado (ER) chaperona para a co-receptores Wnt Lrp5 e LRP6 [10], [11], proteína Mesd recombinante é capaz de se ligar a amadurecer Lrp5 e LRP6 na superfície da célula, actua como um inibidor universal de diferentes LRP5 /6 moduladores, e suprime Wnt /sinalização β-catenina em células de cancro dependentes de Wnt-[8], [12] – [14]. No nosso estudo anterior, verificou-se que a região C-terminal da Mesd, que está ausente em sequências de invertebrados, é necessária e suficiente para a ligação a amadurecer LRP6 na superfície da célula [12]. Nos presentes estudos, que caracterizou a interacção entre o péptido Mesd região C-terminal e Lrp5 /6. Também estudamos o papel da região peptídica Mesd C-terminal no Wnt /β-catenina de sinalização em células cancerosas.

Materiais e Métodos

Materiais

O plasmídeo pcDNA3.1C -Myc-hLRP5 contendo a full-length humana Lrp5 cDNA e plasmídeo PCS-Myc-hLRP6 contendo a full-length cDNA LRP6 humana eram de Dr. Cindy Bartels (Case Western Reserve University, Cleveland) e Dr. Christof Niehrs (Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Alemanha), respectivamente. Plasmídeo pGST-E-caderina foi fornecido pelo Dr. Gail Johnson (Universidade de Rochester, Nova Iorque). Plasmídeo pUSEamp-Wnt1-HA contendo o mouse full-length cDNA Wnt1 foi comprado de Upstate. Plasmídeo BA-Wnt10b contendo full-length do mouse Wnt10b eram de Addgene. O constructo de luciferase TOPFlash era de Upstate Biotechnology, e o constructo de luciferase Super8XTOPFlash foi fornecida pelo Dr. T. Randall lua (Universidade de Washington, Seattle). Um vector que expressa β-galactosidase foi da Promega. Preparação da proteína de pequeno rato recombinante e Mesd péptido região rato Mesd C-terminal, mMesd (50-195), foi descrito anteriormente [12]. Todos os outros peptídeos rato Mesd, Mesd C-terminal hMesd peptídeo região humana (160-197) (KGGGSKEKNKTKQDKGKKKKEGDLKSRSSKEENRAGNK) e o seu péptido de controlo (KEGDRKPRASKEGDRKPRASKEGDRKPRASKEGDRKPR) foram fabricados pela EZBiolab. Rspo1 proteína humana recombinante foi fornecido pelo Dr. Kyung-Ah Kim (Nuvelo Inc., Califórnia). A adriamicina foi adquirido a Sigma. Anti-anticorpo osteoprotegerina (OPG) foi obtido a partir de R D Systems. Monoclonal anti-fosforilado-LRP6 e anti-Axin2 foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology. Monoclonal anti-β-catenina foi da BD Biosciences. policlonal de coelho anti-Ciclina D1 era da Chemicon International. Policlonal anti-Wnt10b e anti-actina foi monoclonal a partir de Sigma. O anticorpo monoclonal anti-HA foi gerado como descrito anteriormente [15]. anticorpo marcado com peroxidase anti-rato e o sistema de ECL foram adquiridos da Amersham Life Science. Os sistemas de ensaio de luciferase e β-galactosidase foram da Promega. meios de cultura de tecidos, soro fetal de bovino (FBS), e plástico-louças foram obtidos a partir de Life Technologies, Inc. cocktail inibidor de proteinase ™ completa foi obtida de Boehringer Mannheim. As proteínas foram iodados utilizando o método de IODO-GEN como descrito anteriormente [8].

cultura celular condicionado e

media

rim embrionário humano HEK 293 células, células HT1080 cancerosas fibrossarcoma humano, humano basal- como células de cancro da mama Hs578T, PC-3 de células de cancro da próstata humanas, células C2C12 de rato mesenquimais não consolidadas, as células secretoras de Wnt3a L e células L de controlo foram obtidas da American Type Culture Collection. LDLR- deficiente linha de células de ovário de hamster chinês (CHO) ldlA7 foi gentilmente cedido pelo Dr. Monty Krieger (Massachusetts Institute of Technology, Cambridge) [16]. LDL-7 células trasfected-LRP5 e as células de controlo foram descritos antes [8], e foram cultivadas em meio F-12 de Ham contendo 10% de FBS e 350 ug /ml de G418. células HT1080 transduzidas-LRP6 e as células de controlo foram descritos antes [17]. HT1080 transduzidas-LRP6 e células secretoras de Wnt3a L foram cultivadas em meio DMEM contendo 10% de FBS e 350 ug /ml de G418. células HEK293, Hs578T e C2C12 foram cultivadas no mesmo meio sem G418 acima. As células de PC-3 foram cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS. meio condicionado-Wnt3a (CM) e CM controlo de células L foram preparados de acordo com as especificações do fabricante.

Ligand ensaio de ligação

ensaio de ligação ligando foi realizada exactamente como descrito anteriormente [8]. As células (2 x 10

5) foram semeadas em pratos de 12 poços um dia antes do ensaio. tampão de ligação do ligando (meio mínimo de Eagle contendo 0,6% de BSA com uma concentração diferente de radioligando, 0,6 ml /poço) foi adicionada a monocamadas de células, na ausência ou na presença de não marcado Mesd ou o seu péptido, seguido de incubação durante 4 h a 4 ° C. Em seguida, recobre tampão contendo o ligando não ligado foi removido e as monocamadas de células foram lavadas e lisadas em tampão de lise de baixa SDS (Tris-HCl 62,5 mM, pH 6,8, 0,2% de SDS, 10% v /glicerol) e contadas. A concentração de proteína de cada ligado de células foi medida em placas paralelas que não continham os ligandos.

Ligando de análise de ligação

O pacote de simulação AMBER9 [18] foi usado em ambos o processamento de dados e de simulação. Os peptídeos foram representadas por meio de todos os átomos campo de força ponto de carga (AMBER FF03) [19]. Um modelo generalizado Born (GB) [20] foi usado para todas as simulações com uma concentração de sal de 0,2 M eficaz (modelada com base na teoria de Debye-Hückel). No método GB, o solvente é tratado como um continuum de alta dielétrica interagindo com os encargos que são incorporados em moléculas de soluto de ambiente dielétrico mais baixa. Nenhum termo área de superfície foi utilizado no modelo de GB. As constantes dieléctricas interiores e solventes foram ajustados para 1,0 e 78,5, respectivamente. A temperatura foi controlada a 300 K utilizando um esquema de acoplamento fraco [21]. AGITAR [22] foi aplicado para restringir todas as ligações que conectam os átomos de hidrogênio e um intervalo de tempo de 2,0

fs

foi usado para resolver numericamente as equações de Newton. As simulações dos dois peptídeos curtos mMesd (160-169) e mMesd (183-191) foram iniciados a partir conformação completamente estendida após a minimização de energia e correr para 100

ns

cada um. A estrutura inicial para peptídeo mMesd (155-191) foi derivada da estrutura Mesd RMN (PDB ID: 2KGL) ea simulação foi executado em 200

ns

. Os instantâneos simulados foram agrupados com base em um método hierárquico [23] em que um snapshot foi incluídas no seu conjunto mais próximo se a distância da cadeia principal root mean square (RMSD) é menor do que 1,5 Å depois sobreposição sequencial. As estruturas representativas foram comparados, e os clusters cujas estruturas representativas foram mais perto do que 1,5 Å foram fundidos juntos.

repórter luciferase ensaio

As células foram colocadas em placas de 24 poços. Após cultura durante a noite, as células foram transitoriamente transfectadas com o constructo de luciferase ou TOPFlash Super8XTOPFlash, vector expressando β-galactosidase, e pcDNA3.1C-Myc-hLRP5, PCS-Myc-hLRP6 ou vector de controlo. Após 24 h de incubação, as células foram tratadas com Mesd, péptido Mesd, Rspo1 e Wnt3a CM. As células foram então lisadas 24 h mais tarde e ambas as actividades de β-galactosidase e luciferase foram determinadas. A actividade de luciferase foi normalizada para a actividade β-galactosidase.

Western blotting

As células em placas de 6 poços foram lisadas em 0,5 ml de tampão de lise (solução salina tamponada com fosfato contendo 1% de Triton X -100 e PMSF 1 mM) a 4 ° C durante 10 min. Quantidades iguais de proteína foram sujeitos a SDS-PAGE sob condições redutoras. Após transferência para Immobilon-P da membrana de transferência, as incubações sucessivas com anti-HA, anti-Wnt10b, anti-β-catenina, anti-OPG, anti-fosforilado-LRP6, anti-LRP6, anti-Axin2, anti-Ciclina D1 ou anti -actina, e anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano foi realizada durante 60-120 minutos à temperatura ambiente. As proteínas imunorreactivas foram, em seguida, detectados utilizando o sistema ECL. Filmes que mostram bandas imuno foram digitalizados pela câmera Kodak Digital Ciência DC120 Zoom Digital.

citosólico análise β-catenina livre com ligação GST-E-caderina ensaio

O ensaio de ligação GST-E-caderina foi realizada exactamente como descrito anteriormente (

9

). Não complexados citosólico livre β-catenina presente em 100 ug de lisado celular total foi sujeito a SDS-PAGE e detectadas utilizando o anticorpo monoclonal contra p-catenina.

proliferação celular ensaio

As células foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 10000 células /poço. RPMI-1640 ou meio DMEM contendo 2% de FBS foi usado como meio de ensaio. Após 16 h de incubação, as células foram tratadas com Mesd ou o seu péptido durante 10 dias. Os meios foram trocadas todos os dias. No final da experiência, as células foram colhidas e contadas utilizando o ensaio de exclusão de azul de tripano.

Bromodeoxiuridina (BrdU) Ensaio de Proliferação de

incorporação de BrdU nas células que proliferam foi analisada por uma proliferação celular ELISA, BrdU kit (colorimétrico, Roche) segundo as instruções do fabricante.

a viabilidade celular ensaio

a viabilidade das células foi medida em placas de 96 poços por o celular Titer Glo Assay (Promega), que é um luminescente ensaio que é um indicador de células vivas em função da atividade metabólica e conteúdo ATP.

Estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste t não pareado de Student. Os dados foram apresentados como média ± SD.

Resultados

péptidos da região Mesd C-terminais bloquear Mesd ligação a LRP6, bem como Lrp5 na superfície celular

Em nosso estudo anterior , que têm demonstrado que o péptido região C-terminal Mesd mMesd (150-195) bloqueia a full-length Mesd ligação para amadurecer LRP6 na superfície da célula [12] da proteína. No entanto, se o péptido região Mesd C-terminal é capaz de bloquear a ligação a amadurecer Mesd Lrp5 na superfície celular de proteínas não é clara. A maior parte da região C-terminal da Mesd está ausente em sequências de invertebrados. Como os primeiros 5 resíduos de aminoácidos na extremidade N-terminal e dos últimos resíduos de 4 aminoácidos no terminal C de mMesd (150-195) são conservados entre espécies diferentes, foi preparado um rato péptido mais curto Mesd região C-terminal, mMesd (155-191), que não tem esses resíduos de 9 aminoácidos (Figura 1A). Nós, então, realizada

ensaio de ligação com LRP6- e células que expressam Lrp5 125I-Mesd. Descobrimos que mMesd (155-191), como mMesd (150-195), bloqueado Mesd proteína de ligação a LRP6 bem como Lrp5 na superfície celular (Figura 1B), o que indica que a região Mesd C-terminal é também importante para Mesd ligação a Lrp5.

(a) representação esquemática de rato Mesd e seus péptidos da região C-terminal e as sequências de aminoácidos de péptidos da região do rato Mesd C-terminais. (B)

125I-Mesd (5 nM) a ligação às células HT1080 transduzidas-LRP6 e as células de controlo correspondentes foi realizada durante 4 h a 4 ° C na ausência ou na presença de 500 nM de rato Mesd ou 500 nM de rato Mesd C-terminal de péptido região. Os valores são a média das determinações triplas com o S.D. indicado por barras de erro. (C)

125I-Mesd (5 nM) a ligação às células HT1080 transduzidas-LRP6 ou LDL-7 células trasfected-LRP5 foi levada a cabo durante 4 h a 4 ° C na ausência ou presença de várias rato Mesd C-terminal péptidos da região nas concentrações indicadas. Os valores são a média das determinações triplas com o S.D. indicado por barras de erro.

** P

. 0,01 em comparação com as células LRP6 ou Lrp5 na ausência de Mesd e seus peptídeos

Há dois Lrp5 /6 sítios de ligação dentro Mesd C-terminal região

para caracterizar ainda mais Mesd ligação a Lrp5 /6, preparamos 6 peptídeos Mesd baseado no mouse Mesd sequência da região C-terminal (Figura 1A), e realizou

ensaio de ligação 125I-Mesd com LRP6- e Lrp5-expressando células na presença ou ausência destes péptidos. Enquanto mMesd (155-164) e mMesd (165-182) foram incapazes de bloquear a ligação da proteína Mesd Lrp5 LRP6 ou na superfície da célula, mMesd (160-169) mostraram um nível semelhante de inibição como mMesd (155-173) ( Figura 1C). Além disso, mMesd (183-191) também exibiu um nível semelhante de inibição como mMesd (174-191) e mMesd (160-169) (Figura 1C). Juntos, estes resultados indicam que existem dois locais LRP5 /6 Mesd ligação dentro da região C-terminal. Além disso, é interessante notar que notar que mMesd (160-169) e mMesd (183-191) demonstraram a sua capacidade de inibição à concentração de 50 uM, o que é 100 vezes do que o necessário para mMesd (155-191), sugerindo que o dois Lrp5 /6 sítios de ligação dentro Mesd C-terminal região cooperam entre si para criar um domínio de ligação ao Lrp5 /6.

alta afinidade peptídeos isolados C-terminal manter as características estruturais do full-length Mesd

os resultados de ensaios de ligação são consistentes com o estudo recente sobre a RMN de comprimento completo Mesd [24], que mostra que o domínio helicoidal flexível do C-terminal (156-195) é estruturalmente distinto do domínio do núcleo (1- 155), e é responsável pela função de escolta de Mesd por ligação a Lrp5 /6. No entanto, os péptidos podem ter alterações estruturais significativas quando isoladas a partir de proteínas. Para explorar ainda mais os insights estruturais, foram realizadas simulações de dinâmica molecular em todos os três peptídeos [mMesd (155-191), mMesd (160-169) e mMesd (183-191)] e comparou-os com a estrutura de RMN do full-length proteína Mesd. análise de agrupamento dos resultados das simulações indicaram que todos os três peptídeos adotada conformação relativamente estável. As conformações mais populosas dos três peptídeos foram ilustrados na Figura 2C-2E. Em vez da forma de laço semelhante prolongado de domínio C-terminal no comprimento total Mesd (Figura 2A), mMesd (155-191) dobra-se em uma estrutura mais compacta, com tanto a sua C- e N-terminais de dobragem em direcção ao centro ( A Figura 2B). Apesar das diferenças estruturais aparentes, ambas as estruturas mantidas uma superfície positiva consistiu de resíduos carregados positivamente com as suas cadeias laterais localizar no mesmo lado e totalmente exposto ao solvente (Figura 2A e 2B). Tal superfície positiva é crucial para a capacidade de ligação do Mesd para amadurecer Lrp5 /6. Curiosamente, esta superfície positiva pode ser espacialmente dividido em duas regiões que consistem essencialmente dos resíduos carregados positivamente de mMesd (160-169) e mMesd (183-190), respectivamente (Figura 2A e 2B). Os resultados das simulações mostram que -45% e ~58% de todos os instantâneos de simulação de mMesd (160-169) e Mesd (182-190), respectivamente, adotada conformações semelhantes, como as suas correspondentes na estrutura Mesd de corpo inteiro (Figura 2D e 2E). As características estruturais semelhantes e a superfície positiva explicar que os dois péptidos mais curtos exibir uma função semelhante em ligação a Lrp5 /6.

(a) a estrutura de RMN do domínio C-terminal de ratinho Mesd (155-191) com base na o estudo de Chen et al. (24). (B) O instantâneo mais representativo do mMesd peptídeo (155-191). Os segmentos de 160-169 e 183-191 foram destacados em cores laranja e verde. Os resíduos que formam a superfície positiva foram mostradas em barras sólidas. As duas regiões de superfície que consistem em resíduos 160-169 segmento ou de 183-191segment foram marcados com azul e vermelho círculos tracejadas. Resíduos que são únicas na superfície positivo de A) ou B) foram marcadas com vermelho-color. (C-E) As conformações mais populosas com base em análise de agrupamento dos instantâneos de simulação de três péptidos do terminal C mMesd (155-191) (C), mMesd (160-169) (D) e mMesd (183-191) ( e).

O Mesd C-terminal blocos de peptídeos região Wnt /β-catenina sinalização induzida por Wnt3a e Rspo1 em LRP5- ou células HEK293 expressando LRP6

Wnt3a é um dos os 19 membros de vertebrados da família Wnt. Há quatro membros na família RSPO. Ambos Wnt3a Rspo1 e são capazes de activar a via Wnt /β-catenina sinalização através Lrp5 LRP6 ou [5], [8], [9]. Portanto, foi realizada de Wnt /β-catenina sinalização ensaio de repórter para testar se a proteína Mesd péptido imita Mesd região C-terminal a actuar como um inibidor da sinalização de Wnt /β-catenina induzida por Wnt3a e Rspo1 em LRP5- ou células que expressam LRP6 . As células HEK293 foram transfectadas transitoriamente com Lrp5 ou LRP6 juntamente com Wnt /β-catenina repórter sinalização TOPFLash, e tratou-se com Wnt3a CM ou proteína Rspo1 na presença ou ausência de proteína Mesd rato ou o seu péptido de região C-terminal mMesd (155-191) . Como esperado, a actividade TOPFlash foi grandemente aumentada após células HEK293 foram transfectadas transitoriamente com Lrp5 ou LRP6 e tratou-se com Wnt3a ou Rspo1 (Figura 3). É importante ressaltar que o aumento da atividade TOPFlash induzida por Lrp5, LRP6, Lrp5 mais Wnt3a, LRP6 mais Wnt3a, Lrp5 mais Rspo1 ou LRP6 mais Rspo1 foi bloqueado, não só pela proteína Mesd, mas também por seu péptido mMesd (155-191) em uma dose dependente modo (Figura 3).

HEK293 células em placas de 24 poços foram transfectadas transitoriamente com o plasmídeo Lrp5 (a), o plasmídeo LRP6 (B) ou o vector de controlo correspondentes, juntamente com o constructo de luciferase e o TOPFlash β-galactosidase expressam vector em cada poço. Após 24 h de incubação, as células foram tratadas com Wnt3a cm (5%), Rspo1 (40 ng /ml), rato Mesd (mMesd) (2 | iM), ou o rato Mesd péptido C-terminal região mMesd (155-191) no concentrações indicadas. A actividade da luciferase foi então medida 24 h mais tarde, com a normalização da actividade da β-galactosidase. Os valores são a média das determinações triplas com o S.D. indicado por barras de erro. * P 0,05, ** P 0,01 em comparação com as células de controlo sem Mesd e seu tratamento péptido

A Mesd C-terminal de blocos de péptidos região fosforilação LRP6 e OPG expressioninduced por Wnt3a e Rspo1 em C2C12. células

C2C12 células são células progenitoras mesenquimais rato não comprometidas que podem ser diferenciadas em osteoblastos após a activação da sinalização de Wnt /β-catenina [9], [25], [26]. Nós empregamos C2C12 células para examinar o efeito do peptídeo Mesd na sinalização de Wnt /β-catenina induzida por Wnt3a. LRP6 fosforilação é crítica para a sinalização de Wnt /β-catenina induzida por proteínas Wnt [3], e OPG é um gene alvo directo da sinalização de Wnt /β-catenina em osteoblastos [27], [28]. Descobrimos que o mouse Mesd C-terminal peptídeo região mMesd (155-191), como a proteína Mesd, foi capaz de suprimir a fosforilação induzida por Wnt3a endógena LRP6 e expressão OPG em células C2C12 (Figura 4A e 4B).

(a) as células C2C12 em placas de 6 poços foram tratadas com Wnt3a cm (5%), na ausência ou presença de rato Mesd (mMesd) (0,5 uM) ou rato Mesd C-terminal de péptido região mMesd (155-191) no concentrações indicadas, durante 6 h. foi analisado o nível de LRP6 fosforilada. (B) As células C2C12 em placas de 6 poços foram incubadas com Wnt3a cm (5%), na presença ou ausência de mMesd (0,5 uM) ou mMesd (155-191) nas concentrações indicadas, durante 48 h. Os níveis de OPG celular total foram analisados ​​por transferência de Western. (C) C2C12 células em placas de 6 poços foram incubadas com Rspo1 (20 ng /ml) e /ou Wnt3a cm (2%) na ausência ou na presença de mMesd (0,5 uM) ou mMesd (155-191) (2 ^ M ) durante 48 h. Os níveis de OPG celular total foram analisados ​​por transferência de Western. Todas as amostras foram também sondadas com o anticorpo anti-actina para verificar a carga igual.

Rspo1 é capaz de sinergiza com Wnt3a na indução da expressão de OPG em células C2C12, embora em si Rspo1 tem efeitos mínimos [9] . Descobrimos que rato Mesd C-terminal de péptido região mMesd (155-191), semelhante à proteína Mesd, reprimida a expressão induzida por OPG Rspo1 mais Wnt3a em células C2C12 (Figura 4C).

A região C-terminal Mesd péptido atenua a sinalização de Wnt /β-catenina no cancro da próstata PC-3 e células de cancro da mama Hs578T

Acumulando evidência indica que Wnt LRP6 co-receptor desempenham um papel crítico na /β-catenina Wnt na activação humano sinalização células da próstata e cancro da mama e é importante para o desenvolvimento e progressão destes dois tipos de cancro [8], [13], [14], [29] – [33]. Para testar se o péptido de região Mesd C-terminal é capaz de suprimir a sinalização de Wnt /β-catenina em células de próstata humana e cancro da mama, foi preparado um hMesd Mesd humana C-terminal de péptido região (160-197), que é correspondente à rato Mesd mMesd péptido região C-terminal (155-191). Nós também preparado um peptídeo de controle negativo com base na sequência de mMesd (155-164). Semelhante a mMesd (155-191), hMesd (160-197) exibido efeitos inibitórios sobre Wnt /β-catenina a sinalização induzida por LRP6, Wnt3a, Rspo1, Wnt1 e Wnt10b (Figura S1 e S2). Descobrimos que hMesd (160-197), mas não o péptido de controlo, imitou proteína Mesd e reprimida significativamente a actividade de luciferase repórter Wnt em células de cancro da próstata PC3 e células do cancro da mama Hs578T (Figura 5A). Por conseguinte, hMesd (160-197) diminuiu grandemente os níveis de citosólico livre β-catenina, fosforilação LRP6 e Wnt /β-catenina sinalização alvos Axin2 e expressão da ciclina D1 em células PC-3 e Hs578T (Figura 5B).

células PC-3 e HT578T (a), em placas de 24 poços foram transfectadas transitoriamente com a construção de luciferase Super8XTOPFlash e β-galactosidase expressam vector em cada poço. Após 24 h de incubação, as células foram tratadas com rato Mesd (mMesd), Mesd humano hMesd péptido (160-197) ou o péptido de controlo, nas concentrações indicadas. A actividade da luciferase foi então medida 24 h mais tarde, com a normalização da actividade da β-galactosidase. Os valores são a média das determinações triplas com o S.D. indicado por barras de erro.

** P

0,01 em comparação com as células de controlo sem tratamento Mesd ou péptido Mesd. (B) As células PC-3 e Hs578T, em placas de 6 poços foram tratadas com mMesd, hMesd (160-197) ou o péptido de controlo, nas concentrações indicadas, durante 24 h. Os níveis de citosólico livre β-catenina, e β-catenina celular total, LRP6, Axin2, ciclina D1 e LRP6 fosforilada foram então analisados ​​por transferência de Western. As amostras também foram sondados com o anticorpo anti-actina para verificar a carga igual.

Wnt1 regula a diferenciação e proliferação celular do epitélio mamário, e Wnt1 sobre-regulação na glândula mamaria tem sido mostrado induzir mamária hiperplasia e adenocarcinoma [34], [35]. A sobre-expressão de Wnt1 foi encontrada na maioria dos espécimes de carcinoma da próstata [36]. Para caracterizar ainda mais o efeito inibidor do péptido região Mesd C-terminal em células da próstata e cancro da mama, que transientemente transfectadas células PC-3 e Hs578T com Wnt1 e Wnt plasmídeos repórter e tratada com a proteína humana ou Mesd Mesd hMesd péptido (160-197 ). Descobrimos de novo que hMesd (160-197), mas não o péptido de controlo, imitou proteína Mesd para reprimir significativamente a actividade repórter de luciferase induzida por Wnt Wnt1 em células PC3 e Hs578T (Figura 6A). Além disso, hMesd (160-197) diminuiu grandemente os níveis de citosólico livre β-catenina, fosforilação LRP6 e Wnt /β-catenina sinalização alvos Axin2 e ciclina D1 em Wnt1 que expressam PC-3 e Hs578T células (Figura 6B).

células PC-3 e HT578T (a), em placas de 24 poços foram transfectadas transitoriamente com o plasmídeo Wnt1 juntamente com o constructo de luciferase Super8XTOPFlash e β-galactosidase expressam vector em cada poço. Após 24 h de incubação, as células foram tratadas com rato Mesd (mMesd), Mesd humano hMesd péptido (160-197) ou o péptido de controlo, nas concentrações indicadas. A actividade da luciferase foi então medida 24 h mais tarde, com a normalização da actividade da β-galactosidase. Os valores são a média das determinações triplas com o S.D. indicado por barras de erro.

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0,01 em comparação com as células de controlo sem tratamento Mesd ou péptido Mesd. (B) As células PC-3 e Hs578T em placas de 6 poços foram transientemente transfectadas com o plasmídeo Wnt1 ou o vector de controlo correspondente. Após ser incubada durante 24 h, as células foram tratadas com mMesd, hMesd (160-197) ou o péptido de controlo, nas concentrações indicadas, durante 24 h. Os níveis de citosólico livre β-catenina, e total de Wnt1 celular, β-catenina, LRP6, Axin2, ciclina D1 e LRP6 fosforilada foram então analisados ​​por transferência de Western. As amostras também foram sondados com o anticorpo anti-actina para verificar a carga igual.

O péptido de região C-terminal Mesd inibe a proliferação de células PC-3 do cancro da mama e cancro da próstata Hs578T

Tendo estabelecido que o péptido de região Mesd C-terminal suprime a sinalização de Wnt /β-catenina em células Hs578T PC-3 e, em seguida, nós examinamos o efeito do péptido região Mesd C-terminal sobre a proliferação de células de cancro. Como pode ser visto na Figura 7, hMesd (160-197), mas não o péptido de controlo, imitou proteína Mesd e exibida efeito inibitório no PC-3 e a proliferação celular de um modo Hs578T (Figura 7A) dependente do tempo. Para confirmar o efeito inibitório do péptido Mesd sobre a proliferação de células de cancro, foi realizado um ensaio de incorporação de BrdU, depois as células foram tratadas com os péptidos. Verificou-se que o péptido de região C-terminal Mesd diminuiu incorporação de BrdU nas células Hs578T (Figura 7B) e PC-3.

(A) células do cancro em placas de 6 poços foram tratadas com rato Mesd (mMesd, 2 uM), Mesd humano hMesd péptido (160-197) (4 uM) ou péptido de controlo (4 uM) em RPMI-1640 contendo FBS a 2% para as células PC-3 ou meio DMEM contendo 2% de FBS durante 10 dias para Hs578T . Os meios foram mudados a cada dois dias, e as células foram colhidas e contadas utilizando o ensaio de exclusão de azul de tripano. Os valores são médias de três determinações com os desvios padrão indicados por barras de erro. **

P

0,01 em comparação com as células tratadas com PBS ou péptido de controlo. células (B) do cancro em frascos T-25 foram tratadas com péptido humano Mesd hMesd (160-197) (2 ^ M) ou péptido de controlo (2 pM) no meio de cultura contendo FBS a 2% durante 7 dias. Os meios foram trocadas todos os dias. As células foram então colhidas e semeadas em placas de 96 poços de cultura de tecidos a uma densidade de 5000 células /poço com hMesd (160-197) (2 ^ M) ou péptido de controlo (2 pM) no meio de cultura contendo FBS a 10% para dois dias. A proliferação celular foi medida por ELISA de BrdU proliferação. Todos os valores são a média de seis determinações com o S.D. indicado por barras de erro.

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comparação com as células tratadas com o péptido de controlo citotoxicidade

Mesd proteína e o seu péptido de região C-terminal potenciar agente de quimioterapia induzida por adriamicina em PC-3 e Hs578T. Chen et al.