Abstract
BTN3A2 /BT3.2 butyrophilin expressão de mRNA de células tumorais foi previamente identificado como um fator prognóstico em uma pequena coorte de câncer de alto grau serosa epitelial de ovário (HG-EOC). Aqui, nós avaliamos o valor prognóstico da BT3.2 no nível de proteína na amostra de 199 pacientes HG-EOC. Como a única função conhecida de proteínas butyrophilin é na regulação imune, foi avaliada a associação entre a expressão BT3.2 e infiltração intratumoral de células imunes por imuno-histoquímica com anticorpos específicos contra BT3.2, CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 e CD206. expressão epitelial BT3.2 foi significativamente associada com maior sobrevida global e menor risco de progressão da doença (HR = 0,651, p = 0,006 e HR = 0,642, p = 0,002, respectivamente) e significativamente associada com uma maior densidade de se infiltrar em células T, particularmente As células CD4 + (0,272, p 0,001). Observou-se também uma forte associação entre a densidade relativa de células CD206 +, avaliada pela relação da intratumoral CD206 + /CD68 + expressão, e o risco de progressão da doença (HR = 1,355 p = 0,044, respectivamente). Em conclusão, a proteína BT3.2 é um biomarcador potencial de prognóstico para a identificação de pacientes com HG-EOC melhor resultado. Em contraste, alta CD206 + /CD68 + expressão está associada a um risco elevado de progressão da doença. Enquanto o papel de BT3.2 ainda é desconhecido, o nosso resultado sugere que a expressão por células epiteliais BT3.2 pode modula a infiltração de células imunitárias intratumoral
citação:. Le Page C, Marineau A, Bonza PK, Rahimi K, L Cyr, Labouba I, et al. (2012) Expressão BTN3A2 em epitelial do cancro do ovário é associado com Tumor Cells Superior Infiltrando T e um prognóstico melhor. PLoS ONE 7 (6): e38541. doi: 10.1371 /journal.pone.0038541
editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 06 de fevereiro de 2012; Aceito: 07 de maio de 2012; Publicação: 07 de junho de 2012
Direitos de autor: © 2012 Le Page et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Sociedade de Pesquisa do Câncer e Fondation Carole Epstein. Dr. Cailhier detém uma bolsa clinicien-chercheur do Fonds de Recherche en Santé du Québec. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução câncer de ovário
epitelial (EOC) é uma das principais causas de morte entre as doenças malignas ginecológicas [1]. Devido à sua falta de sintomas, a doença é muitas vezes diagnosticada em um estágio avançado (estágio III ou IV) quando o câncer já se espalhou para sites secundários. O tratamento padrão para esses pacientes é a cirurgia e quimioterapia à base de platina, embora a doença progride frequentemente mesmo após cirurgia e torna-se resistente à quimioterapia padrão [2]. Consequentemente, a taxa de sobrevivência de pacientes com EOC em estágio avançado é extremamente baixa ( 40%). As variáveis clínicas, tais como o estágio da doença e doença residual, são prognósticos [3], [4], mas em grande parte não informativo para aqueles com doença em estágio avançado.
Em um estudo anterior [5], foi realizado um mRNA perfil de expressão tecidos tumorais EOC seroso de alto grau para identificar marcadores moleculares de prognóstico, utilizando uma plataforma de expressão gênica microarray baseado em Affymetrix. Entre os marcadores de prognóstico identificados, encontramos BTN3A2, também conhecido como BT3.2 e BTF4, um gene que pertence à família butyrophilin BT3, também uma subfamília B7. BTN3A2 ARNm foi o biomarcador mais robusta entre 8 outros testados. Não só têm um significado prognóstico nas análises uni e multivariada, mas também mostrou a taxa de risco mais elevado em comparação com as outras variáveis de prognóstico moleculares e clínicos. a alta expressão de mRNA de BT3.2 foi fortemente associada com um bom prognóstico em relação à sobrevida livre de doença e sobrevida global. Como um marcador de prognóstico EOC que atingiu 87% de especificidade e 77% de sensibilidade para predizer recidiva precoce ( 18 meses). Em uma coorte de 52 pacientes [5]
O butyrophilin (BTN) da família contém BTN1A1, BTN2A1 , os membros BTN2A2, BTN2A3, BTN3A1, BTN3A2, BTN3A3 e BTN-like. Curiosamente, estes novos membros da família BTN partilham homologia considerável com os membros da família B7, que têm um domínio exoplasmic IgV semelhante seguido por um outro domínio de IgC como exoplasmic. O domínio citoplasmático contém um domínio de ligação SPRY /ALAVANCA B30.2 proteína [6], [7], [8]. Ao contrário de outros membros BTN, BT3.2 não tem um domínio B30.2 na região intracelular [7], [9]. moléculas BT3 (BTN3A1 /BT3.1, BTN3A2 /BT3.2 e BTN3A3 /BT3.3) são conhecidos a ser expresso em células endoteliais [10], na camada de membrana que envolve leite gota secretoras de gordura a partir de células epiteliais mamárias [11] , em células do sistema imunológico, e em algumas linhas celulares de tumor [5], [12].
As moléculas B7 podem ser reguladores negativos ou positivos de activação de células T. B7-H1 /PD-L1, B7-H3, H4-B7, B7DC /PD-L2, B7S3, B7S1, BTNL2, BTN1A1, BTN2A2 pode inibir a proliferação de células T proporcionando um sinal inibidor. Por outro lado, B7-H3 tem sido considerada como uma molécula reguladora positiva e negativa capaz de estimular ou inibir as células T CD4 + e CD8 +, dependendo do contexto celular [13], [14], [15], [16]. Da mesma forma, alguns membros da família BTN surgiram recentemente como novas entidades reguladoras do sistema imune. Estes incluem BTNL2 [17] – [18] BT1.1, BT2.2 [19], BTNL1 [20], [21] e as moléculas BT3. Por exemplo, Yamashiro
et ai.
[22] PMBC tratados com um anticorpo contra BT3.3 e observou-se uma inibição da proliferação de células CD4 + e de células CD8 +, bem como a diminuição da secreção de citocinas por ambos os tipos de células T. Em outro relatório, Cubillos-Ruiz
et al
. mostraram que a expressão BT3 sobre as células apresentadoras de antigénio (APC) inibiu
In vitro
proliferação de células T e a secreção de citocinas Th1 [23]. Enquanto estes estudos examinaram a função de membros da família B7 quando expressas no componente imunológico, não é claro como estas moléculas pode afectar a resposta imunitária quando expressa por outros tipos de células. De facto, dados publicados suporta a expressão de BT3 em células primárias EOC em tecidos e tecidos metastáticos [23]. Além disso, Messal N.
et al
. relataram recentemente que BT3 actua como uma molécula co-estimulatória nas células T CD4 + e células NK [24]. Curiosamente, eles observaram um papel diferencial imuno-reguladora das diferentes isoformas BT3. No total, isto sugere que os mecanismos complexos que podem regular a função das moléculas BT3. Outras observações são necessários para entender o papel exato dessas moléculas de uma forma específica de contexto.
Para melhor compreender o papel da BT3.2 no câncer de ovário e mais particularmente para confirmar a nossa associação observada de expressão de mRNA BT3.2 com um bom prognóstico do paciente [5], foi realizada uma análise imuno-histoquímica da expressão da proteína BT3.2 em uma grande coorte de 199 pacientes EOC seroso de alto grau e confirmou a associação de BT3.2 e prognóstico de pacientes EOC. Em paralelo, foi analisada a densidade de células do sistema imunológico intratumorais e encontrou uma correlação positiva entre a expressão BT3.2 por células EOC e infiltração intratumoral de células T, enquanto que uma alta taxa de CD206 + /CD68 + expressão foi associada à sobrevida livre de doença mais curto. Estes resultados sugerem um papel de BT3.2 na infiltração tumoral de células imunes.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
aprovação
Ética foi obtido pelo conselho de ética institucional local (comité d’éthique de la recherche du Centre hospitalier de l’Université de Montréal). amostras de tumor foram recolhidos e depositados seguinte consentimento por escrito adequado de pacientes submetidos à cirurgia dentro do Departamento de Oncologia do Centro Hospitalar de l’Université de Montréal, de 1993 a 2010.
Pacientes e Tissue espécimes
Tumor amostras foram coletadas e depositado após o consentimento apropriado de pacientes submetidos a cirurgia dentro da Divisão de Oncologia ginecológica no Centre Hospitalier de l’Université de Montréal, de 1993 a 2010. um patologista independente marcou o grau do tumor eo estágio e de um oncologista ginecológica marcou doença residual tumor de acordo os critérios da Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia [25]. Menos de 10% de amostra foram excluídos na qualidade, e isto não foi correlacionada com a idade da amostra. dados clínicos sobre intervalo livre de progressão foram definidas de acordo com a imagem de digitalização e nível de CA125 sangue [26]. A sobrevivência global foi definida como o tempo desde a cirurgia à morte de cancro do ovário. Os doentes que se sabe serem ainda vivo no momento da análise foram censurados no momento do seu último follow-up. sobrevivência livre de doença do paciente (DFS) foi calculado a partir do momento da cirurgia até o primeiro progressão. critérios de elegibilidade para inclusão no estudo foram os seguintes: nenhum tratamento quimioterápico pré-operatória para câncer de ovário, tratamento pós-operatório quimioterapia à base de platina, tumores de alto grau, subtipo histopatholgy serosa e consentimento informado concluída. Todos os pacientes receberam a quimioterapia à base de platina como uma terapia inicial após a cirurgia com o exeption dos pacientes que morreram pouco depois ( 3 meses) após a cirurgia. Pacientes que morreram de outra doença foram censurados no momento do último follow-up. A oncologista ginecológica revisão dos dados clínicos de todos os pacientes. Para o estudo progressão livre de doença, apenas os pacientes com seguimento clínico de pelo menos 18 meses ou até a recorrência da doença foram incluídos. As características dos tumores e o resultado do paciente para os conjuntos de amostras estão resumidos na Tabela 1.
culturas de células e os sedimentos celulares em Histogel
Para verificar a especificidade dos anticorpos BT3.2 , células TOV-112D e linhas celulares derivadas foram cultivadas em meio OSE (50:50 mistura de 199 e 105 meios Sigma) suplementado com 0,5 ug /mL de anfotericina B, 50 ug /mL de gentamicina e 10% de FBS (bovino fetal sérum). meios células derivadas também foram suplementadas com 0,5 ug /mL de puromicina. As células foram mantidas numa incubadora humidificada a 37 ° C com uma atmosfera contendo 5% de CO2, essencialmente como descrito [27]. Células pelete embutidos em parafina foram preparadas como previamente descrito [28].
Os plasmídeos
O BT3.1, sequências BT3.2 e BT3.3 foram subclonados nos vectores pef6v5 e foram uma generosa dom de Dr. Rhodes (Cambridge, UK) [7]. Todos os plasmídeos foram verificados por sequenciação. As sequências de isoformas BT3 foram amplificados por PCR e subclonado no pENTR ™ /D-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA) e depois recombinados no plenti-CMV /AO-puoDest (ABgene) [29]. produção de partículas de lentivírus e infecção celular foi feito conforme relatado anteriormente [30].
foram selecionados Tissue Microarray
Áreas de tumor com base na revisão de um slide hematoxilina-manchado-eosina. blocos tumorais FFPE foram então biopsiado utilizando um 0,6 milímetros de diâmetro e o tecido arrayer núcleos resultantes foram dispostas numa grelha num bloco de parafina receptor. A matriz de tecido foi composta de 260 amostras de cancro do ovário e 11 amostras de áreas de trompas normais de pacientes com câncer. Após a revisão de dados clínicos 61 pacientes foram excluídos da análise final, pois não cumpria os critérios de inclusão. Esta matriz de tecido foi então seccionado, corado com hematoxilina-eosina e recebeu outra revisão de patologia para confirmar o conteúdo do tumor.
imuno-histoquímica (IHQ)
formalina parafina fixado tumores embutidos foram seccionados em 4 mm eo lâminas foram coradas manualy no banco ou usando o corante BenchMark XT automatizado (Ventana Medical System Inc.). Para o método manual, as secções de tecido foram brevemente aquecida a 50 ° C durante 15 minutos, desparafinados em tolueno e re-hidratadas em um gradiente de etanol. As lâminas foram imersas em tampão de Tris-EDTA (base Tris 10 mM, EDTA 1 mM ajustado a pH 9,0) e a pressão cozido durante 15 min para desmascarar antigénios. A 0,6 ou 3% H
2O
2 tratamento foi utilizado para eliminar a actividade da peroxidase endógena. As secções foram bloqueadas com um reagente livre de soro de bloqueio de proteína (DakoCytomation Inc., ON, Canadá) e incubadas com anticorpos diferentes durante 60 ou 120 min à temperatura ambiente. A concentração óptima para cada anticorpo primário foi determinada por diluições em série. Os anticorpos e as condições de IHC estão listados na Tabela S1. Os tecidos foram incubados com um anticorpo conjugado com HRP anti-ratinho de cabra (1:150) (sc-2005, Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA). Para BT3.2, os tecidos foram incubados com um anticorpo biotinilado secundário (DakoCytomation Inc., ON, Canada) durante 30 min, seguido por incubação com um complexo de estreptavidina-peroxidase (DakoCytomation Inc., ON, Canada) durante 30 min à temperatura ambiente. Os produtos da reacção foram reveladas utilizando diaminobenzidina contendo 0,3% H
2O
2 como substrato de peroxidase. Os núcleos foram contrastadas com hematoxilina. Com o stainer automatizado, recuperação antigênica para CD206 e CD4 foi realizado com celular Condicionado 2 (VMSI; # 950-123). anticorpo pré-diluído foi automaticamente dispensada, e as lâminas foram incubadas a 37 ° C durante 30 min. kit UltraView DAB detecção (VMSI; # 760-091). As lâminas foram contrastadas com hematoxilina (VMSI; # 760-2021). Todas as secções foram observadas por microscopia de luz a 400 x de ampliação. Substituição do anticorpo primário com fosfato salino tamponado serviu como um controlo negativo.
Immunofluxorescence (SE)
formalina parafina e fixado tumores embutidos foram coradas manualy após a recuperação de antigénios em Tris-EDTA (Tris 10 mM de base, 1 mM de EDA ajustado a pH 9,0) durante 15 min em panela de pressur. As secções foram bloqueadas com reagente de bloqueio de uma proteína livre de soro (DakoCytomation Inc., ON, Canadá) e incubaram-se com anticorpos anti-CD68 durante 90 minutos à temperatura ambiente. Os tecidos foram então incubadas com um anticorpo de cabra anti-ratinho Cy5 (1/200) durante 45 min. Os anticorpos IgG de ratinho foram então bloqueadas durante a noite com o reagente M.O.M. ™ (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Os anticorpos anti-CD206 foram incubadas durante 90 min à temperatura ambiente. Os tecidos foram depois incubados com anticorpo de cabra anti-rato Alexa Fluor A488 (1/250) durante 45 minutos antes da lavagem e tratamento com 0,1% de preto do Sudão B durante 10 min para reduzir a autofluorescência. As lâminas foram contrastadas com ProLong® ouro antifade meios de montagem fluorescente com DAPI (Molecular Probes). A leitura foi realizada por análise de microscópio de alta potência e, em seguida, coloração immunoflourescent dupla foi avaliada para validação.
Coloração Quantificação
secções de tumor foram digitalizados e digitalmente visualizado. Para BT3.2, zonas epiteliais foram pontuados de acordo com a intensidade de coloração da membrana epitelial (valor de 0 para a ausência, de um fraco, moderado para 2, 3 em alta intensidade), tal como ilustrado na Figura 1. Na núcleos em que a coloração foi de intensidade variável da intensidade média foi relatada. A quantificação dos linfócitos infiltrados foi realizada por contagem do número de células nucleadas com coloração positiva em ilhotas intraepiteliais. Os resultados foram então classificados como 0 (ausência de células), 1 (0 n 10), 2 (10 n 90) e 3 (n 90) de acordo com o número de células contadas. A quantificação dos macrófagos foi realizada avaliando a percentagem de células coradas na área intra-epitelial. A densidade relativa de células CD206 + foi calculado pela relação CD206 + /CD68 + células coradas. Cada matriz foi analisada de forma independente em um estudo cego por dois observadores independentes. correlação inter-classificação foi 75%. Quando fortes diferenças de pontuação entre os dois observadores (mais de 1 unidade por núcleo) ocorreu o núcleo foi reavaliado para chegar a uma pontuação concordantes entre os dois observadores. A média de todos os núcleos com cancro a partir do mesmo paciente foi utilizado para a análise.
. análise de Western-blot de extratos de proteína total de linha de células TOV112D infectado com Plenti (controle vetorial), BT3.1, BT3.2 ou BT3.3 construções virais. Os extractos foram carregados em triplicado em 10% de gel SDS /PAGE e as membranas foram hibridadas com anticorpos anti-CD277 (eBioscience), anti-BT3.3 (Atlas anticorpos) e anti-BT3.2 (SDIX Inc.), como indicado na parte inferior a figura. B. A análise imuno-histoquímica de pelotas de células embebidos em parafina de linha de células TOV112D infectadas com Plenti (controle vetorial), BT3.1, BT3.2 ou BT3.3 construções virais. Apenas as células transfectadas com o constructo BT3.2 coradas positivamente com o anticorpo anti-BT3.2 (SDIX Inc.). C. A imuno-histoquímica de tumores de xenoenxerto de TOV112D transfectadas com vector vazio ou constructo BT3.2. Somente as células infectadas com a construção BT3.2 coradas positivamente com o anti-BT3.2 (SDIX Inc.). D. Representante coloração para imuno-histoquímica de BT3.2 em um alto grau de serosa EOC TMA. Da esquerda para a direita:. Negativa, baixa, moderada e alta intensidade
Western Blot Analysis
As células foram lisadas com tampão de lise frio (mM Tris-HCl 10, pH 7,4, 150 mM de NaCl, EDTA 1 mM, DTT 1 mM /NaF 1 mM /0,5% de NP-40 /e inibidores de proteína) e centrifugado durante 10 min a 13000 rpm. Limpar lisados foram então fervidos em tampão de carga, separados por 10% SDS-PAGE e transferidas em uma membrana de nitrocelulose. As membranas foram saturados com 5% de leite /PBS /0,1% de Tween 20. A imunodetecção foi realizada como descrito no protocolo do kit ECL (Amersham Pharmacia): ou seja incubadas 2 h a temperatura ambiente ou O /N a 4 ° C com o específico anticorpo, lavou-se com PBS /Tween 0,01% e incubou-se durante mais 30 min à temperatura ambiente com anticorpos conjugado com peroxidase (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). análise de Western-blot foi realizada com o beta-actina AC-15 (ab6276 de Abcam Inc. MA, EUA), anti-CD277 /BT3.1 (# 14-2779 de eBioscience, San Diego, CA, EUA), anti-BT3 0,2 (SDIX, Newark DE, EUA), anti-BT3.3 (HPA007904, Atlas Antibodies, Estocolmo, Suécia). As experiências foram realizadas em triplicado.
Análise Estatística
O teste de correlação de Pearson (bicaudal) foi utilizado para estimar a correlação com variáveis e marcadores clínico-patológicos como variáveis contínuas. As curvas de sobrevida foram plotados usando a análise da curva de Kaplan-Meier eo teste de log-rank foi usado para testar diferenças significativas. characteristic (ROC) Receptor operatórias foram utilizados para determinar o valor limite para cada marcador correspondente para a melhor sensibilidade e especificidade para a progressão do paciente antes dos 18 meses (a progressão da doença precoce) ou ao fim de 20 meses (a progressão da doença final) a partir do diagnóstico inicial (p 0,05 e área de 0,60) como já foi relatado [5]. modelos de risco proporcional uni e multivariada de Cox foram utilizados para estimar a taxa de risco para cada marcador como variáveis contínuas. A análise multivariada foi feita usando um modelo de risco passo a passo para a frente na análise univariada exigida para entrar no modelo. Apenas quatro variáveis foram inclusive no modelo de regressão multivariada de Cox para evitar o excesso de ajuste. A análise multivariada foi realizada utilizando um modelo de risco entrar. O tamanho da amostra (n 100, onde n = 10K /p) e distribuição normal de expressão BT3.2 foram consideradas antes de aplicar o modelo de Cox. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando Statistical Package for o software de Ciências Sociais, versão 11.0 (SPSS, Inc.), ea significância estatística foi fixado em
P
. 0,05
Resultados
a expressão de BTN3A2 /BT3.2 em EOC tecidos
Para investigar a associação entre de expressão BT3.2 em células EOC e sobrevida do paciente, foi realizada uma análise imuno-histoquímica em uma coorte de ovário seroso 199 de alto grau pacientes com câncer. Primeiro, avaliou-se a especificidade dos anticorpos disponíveis contra isoformas BT3. Encontrámos 3 diferentes anticorpos comercialmente disponíveis: anti-CD277 (eBioscience Inc.), anti-BT3.3 (Atlas) e anti-BT3.2 (de SDIX Inc.). Os anticorpos foram testados por western-blotting em extractos celulares a partir da linha celular de cancro do ovário TOV112D infectadas com a BT3.1, ou BT3.2 ou retrovirais BT3.3 partículas. Como visto na Figura 1A, o anti-CD277 reconhecido BT3.1 e BT3.2 isoformas. Como esperado, o anticorpo anti-BT3.3 reconheceu exclusivamente a isoforma BT3.3 e anti-BT3.2 especificamente reconhecida a isoforma BT3.2. Para confirmar a especificidade do anticorpo anti-BT3.2 em tecidos embebidos em parafina, também analisamos a coloração de sedimentos de células embebidas em parafina e tecidos de xenoenxerto de células 112D TOV transfectadas com um vector vazio ou construções de isoformas BT3. Como se vê na Figura 1B e 1C, o anticorpo anti-BT3.2 foi capaz de corar apenas o sedimento celular BT3.2 e tumor de xenoenxerto BT3.2.
membrana e expressão citoplasmática de BT3.2 em cancro do ovário tecidos foi observado e pontuado de acordo com a intensidade de coloração como ausente, baixo, moderado ou forte (0, 1, 2, 3, respectivamente) (Figura 1D). Presença de proteína BT3.2 foi observada nas células epiteliais e, em alguns núcleos dos tecidos, também pode ser encontrada no estroma. Quase todos os núcleos de EOC (n = 193, 97,5%) mostraram expressão de BT3.2. Em células epiteliais, tanto coloração citoplasmática e da membrana foram observados (Figura 1D) e variado de ausente a forte (Figura 1D, Tabela 1). Os níveis de expressão epitelial BT3.2 não significativamente correlacionada com a idade do paciente no momento do diagnóstico ou o grau do tumor. Em contraste, os pacientes com maior nível de BT3.2 epiteliais tendem a ter menor nível de doença residual e doença em estágio inferior (p = 0,058 e p = 0,043, respectivamente, Tabela 2).
BT3. 2 Protein Expression está associada a sobrevida global e progressão
livre de doença
Temos anteriormente investigou a relação entre a expressão de mRNA BT3.2 e câncer de ovário prognóstico do paciente. Cox modelo de riscos proporcionais de Kaplan-Meier e foram utilizados para estimar a associação entre mRNA BT3.2 e prognóstico, conforme definido pela sobrevida global ou sobrevida livre de doença (DFS) no prazo de 18 meses após a cirurgia [5]. No presente estudo, investigamos se a proteína BT3.2 também poderia ser de valor prognóstico. Para este efeito, a expressão da proteína de BT3.2 foi analisado em 199 pacientes serosas de alto grau e as análises estatísticas foram realizadas no que diz respeito à sobrevivência global e DFS. As características de coorte estão descritos na Tabela 1.
curvas de Kaplan-Meier mostrou que houve uma forte associação entre alta expressão da proteína BT3.2 e aumento da sobrevida global do paciente (p = 0,014; log rank = 6,03) ( A Figura 2A). Intervalo médio de sobrevivência foi de 85 meses para os pacientes com maior nível de BT3.2 comparação com 59 meses para pacientes com baixo nível de BT3.2. Da mesma forma, os pacientes com maior expressão de BT3.2 teve um intervalo de progressão média de 86 meses em comparação com 55 meses para pacientes com baixa expressão de BT3.2 (p = 0,002, log rank = 9,65) (Figura 2B).
curvas de Kaplan-Meier de sobrevida global (a) e sobrevida livre de doença (B) em 194 e 171 pacientes, respectivamente. Significância (p) é indicado por log rank.
Na análise de regressão Cox univariada, o nível contínuo de proteína BT3.2 foi avaliada para refletir a relação entre o aumento do nível de expressão BT3.2 e melhora do prognóstico . Nesta análise, o aumento da expressão de BT3.2 foi associada a um risco relativamente elevado de perigo (RH) para a sobrevivência (HR = 0,651, IC de 95% 0,479-0,884, p = 0,006, Tabela 3). Da mesma forma, o aumento da expressão BT3.2 foi significativamente associada com a progressão da doença mais tarde (HR = 0,642, IC95% 0,483-0,853, p = 0,002) (Tabela 3).
A análise de regressão multivariada de Cox, quando as variáveis de prognóstico padrão foram realizadas (idade, estágio e de doença residual), BT3.2 permaneceu uma variável independente prevendo um alto risco de sobrevida (HR = 0,597, IC95% 0,415-0,859, p = 0,005) eo risco de progressão tarde neste modelo multivariada (HR = 0,675, IC95% 0,487-0,935, p = 0,018) (Tabela 3).
relação entre a expressão BT3.2 e Imune infiltrado
Nossa hipótese é que a relação entre epitelial BT3. 2 expressão e um bom prognóstico foi devido à influência no tumor infiltrado de células imunitárias, uma vez que é sabido que as moléculas da família B7 têm funções co-reguladoras nas células T. Além disso, o nível da infiltração de células imunitárias intratumoral foi relacionado ao prognóstico de pacientes com cancro do ovário [31]. Para investigar esta hipótese, foi avaliada por imuno-histoquímica da presença de células T por células CD3 +, CD4 + e CD8 + na mesma coloração TMA utilizado para análise BT3.2. Nós também avaliou a importância da célula intratumoral B (CD20 +) e macrófagos (CD68 +) infiltração. Duas classes de macrófagos têm sido descritos, anti-tumoral (M1) e pró-tumoral (M2). Uma vez que na maioria dos tumores, macrófagos associados a tumores (TAM) têm um M2-fenótipo [32], [33], determinou-se a densidade do infiltrado de células CD206 + como um marcador substituto de macrófagos M2 alternativos pró-tumorais, uma vez que tendem a expressar maior nível de marcador CD206 de macrófagos M1. Para confirmar a especificidade da expressão de CD206 por macrófagos em tumores EOC, foi realizado um controlo duplo coloração imunofluorescente num número limitado de tecidos (Figura S1). CD206 expressão quase sempre co-localizado com CD68, sugerindo a expressão dos macrófagos.
Como se pode ver na Figura 3 e Figura 4A-B, infiltração imune das células T, células B e TAM foi observada em tecidos EOC em várias densidades em as áreas intraepiteliais. A infiltração intra-epitelial de células T CD3 +, CD4 + ou CD8 +, era altamente correlacionada com a presença de células B CD20 + (p 0,001) e CD68 + macrófagos (P 0,001), incluindo as células CD206 + (Tabela 4). A infiltração intra-epitelial de células B, também estava associada com a presença de CD68 + e células CD206 + (r = 0,364 e r = 0,171, p 0,001 e p = 0,022, respectivamente). Curiosamente, a proporção de células CD206 + relativa à densidade total de macrófagos CD68 +, a razão de CD206 + /CD68 + de expressão, foi inversamente correlacionado com a presença de células T CD3 + e tendem a correlacionar-se com a presença de células B (R = -0,216, p = 0,005 e r = -0,141, p = 0,063, respectivamente) (Tabela 4).
Significativamente, a expressão de BT3.2 por células EOC foi correlacionada com a infiltração intra-epitelial de células CD3 + (r = 0,174 , p = 0,018), incluindo as células CD8 + (r = 0,176, p = 0,018) e CD4 + (r = 0,272, p 0,001). Nenhuma correlação significativa entre a expressão BT3.2 e a presença de células CD20 + ou macrófagos foi visto (p = 0,137, Tabela 4).
alta e baixa densidade de células CD3 + (células T), CD4 + (células T), CD8 + (células T) e CD20 + (células B) mostrados nos painéis da esquerda e do meio. A ampliação na área de alta infiltração é mostrado no painel da direita para cada coloração.
Associação de intratumoral linfócitos, macrófagos e EOC Paciente Prognosis
Conforme relatado por outros [ ,,,0],31], a presença de células T CD4 + também foi inversamente correlacionada com a progressão da doença inicial (r = -0,187, p = 0,021, Tabela 5). Kaplan-Meier análise da curva e log rank confirmou que alta densidade intra-epitelial de células CD4 + foi associada a um melhor prognóstico (Tabela S2). O intervalo de progressão média dos pacientes com células de alta intra-epiteliais CD4 + foi de 69 meses, em comparação com 59 meses para pacientes com baixo CD4 + intraepitelial densidade (p = 0,011, log rank = 6,5). No entanto, não foi observada qualquer associação significativa entre a densidade intra-epitelial de CD3 + ou CD8 + e prognóstico do paciente (Tabela 5 e Tabela S2). Encontramos uma associação significativa entre CD20 + infiltração celular e sobrevivência global (log rank p = 0,039), enquanto que apenas se obteve uma tendência para uma melhor sobrevida livre de doença (log rank p = 0,0677). No entanto, a associação com a sobrevida global não foi visto quando CD20 + foi considerada como uma variável contínua no modelo de regressão Cox univariada (p = 0,21).
células Embora não observamos uma correlação entre a densidade de CD68 + ou CD206 + e prognóstico do paciente (Tabela 5), o aumento da relação de CD206 + relativamente a células CD68 + foi positivamente correlacionada com a progressão da doença (r = 0,157, p = 0,049, Tabela 5). Esta relação foi confirmada por análise da curva de Kaplan-Meier (p = 0,005, rank = 7,83 log, Figura 4D, Tabela S2) e análise univariada de regressão de Cox (HR = 1,355, IC 95% 1,223-5,332, p = 0,044). Além disso, o CD206 + densidade relativa tende a associar-se com a sobrevida global pobres (log rank = 3,53, p = 0,06) (Figura 4C, Tabela S2) com uma razão de risco de 2,077 (IC% 95, 0,947-4,558, p = 0,068).
alta e baixa densidade de CD68 + (macrófagos associados a tumores, TAM) (A) e CD206 + (M2 subtipo de TAM) células (B). Ampliação na área de alta infiltração é mostrado no painel da direita para cada coloração (em cima). Análise C e D. Kaplan-Meier da proporção de células infiltrantes + /CD68 + CD206 intra-epiteliais que representam a densidade relativa de CD206 + M2 TAM através da densidade total de CD68 + intraepitelial macrófagos infiltrantes. Kaplan-Meier curvas de sobrevida global (C) e sobrevida livre de doença (D) em 180 e 174 pacientes, respectivamente. Significância (p) é indicado por log rank.
Discussão
Neste estudo, imuno-histoquímica revelou marcação BTN3A2 /BT3.2 em tumores seroso de alto grau EOC de 199 pacientes. A expressão foi detectada em elevada frequência (97,5%) de acordo com dados anteriores da análise da expressão de ARNm em tecidos serosas EOC [5]. O aspecto importante deste estudo é a confirmação da BT3.2 como um potencial marcador de prognóstico para EOC seroso de alto grau no nível de proteína. O estudo inicial identificar mRNA BT3.2 como um marcador de prognóstico foi limitado a um conjunto relativamente pequeno de 52 casos. Aqui, não só foi confirmada a relação entre BT3.2 e um melhor resultado em um grande grupo, mas também a nível de proteína por imuno-histoquímica. Trata-se de uma técnica mais facilmente transponível em um departamento de patologia clínica do que a detecção de ARNm tais como Q-PCR. Pacientes com alta coloração epitelial do BT3.2 teve 1,53 vezes menos risco de morrer da doença do que pacientes com baixo nível de expressão BT3.2. A associação de BT3.2 para a sobrevivência e a progressão da doença era um parâmetro independente dentro de uma análise de regressão de Cox-multivariada (Tabela 3). Combinação com outros marcadores moleculares independentes poderiam melhorar o seu desempenho clínico quanto à data nenhum marcador indivíduo demonstrou sensibilidade e especificidade suficiente.
Uma limitação do nosso estudo é o baixo número de pacientes sem doença residual (n = 23) , o que não nos permite analisá-los como um grupo independente. pacientes otimamente debulked, em geral têm melhor prognóstico do que pacientes com doença residual [34] para o qual um biomarcador de prognóstico pode ser menos informativo.