Sumário

O receptor acoplado a proteína G (GPCR), cisteína (C) -X-C Receptor 4 (CXCR4), desempenha um papel importante na metástase do cancro da próstata. CXCR4 é geralmente considerado como um receptor de membrana do plasma onde ele transmite sinais que suportam transformação, progressão e metástase eventual. Devido ao papel central do CXCR4 na tumorigénese, abordagens terapêuticas, tais como antagonistas e anticorpos monoclonais têm-se centrado sobre os receptores existentes na membrana plasmática. Um conceito emergente para receptores acoplados à proteína G é que eles podem localizar a e associado com o núcleo, onde eles mantêm a função e medeiam a sinalização nuclear. Aqui, demonstramos que o CXCR4 associado com o núcleo de tecidos de cancro da próstata malignas. Do mesmo modo, a expressão de CXCR4 foi detectada nas fracções nucleares entre várias linhas celulares de cancro da próstata, em comparação com as células epiteliais da próstata normais. Nossos estudos identificaram um conjunto nuclear de CXCR4 e se definiu uma via de transporte nuclear para CXCR4. Nós revelamos uma sequência putativa nuclear localização (NLS), ‘RPRK’, dentro de CXCR4 que contribuiu para a localização nuclear. Além disso, o CXCR4 nuclear interagiu com Transportinβ1 e Transportinβ1-se ligar a CXCR4 promoveu a sua translocação nuclear. Importante, G estudos

imunoprecipitação αi e mobilização de cálcio indicou que CXCR4 nuclear era funcional e participou na sinalização da proteína G, revelando que a piscina nuclear de CXCR4 mantiveram a função. Dada a sugestão de que o funcional CXCR4, nuclear pode ser um mecanismo subjacente a recorrência de cancro da próstata, o aumento da capacidade metastática e pior prognóstico depois de tumores foram tratados com uma terapêutica que se destina a membrana plasmática CXCR4, estes estudos trata de um novo mecanismo de sinalização nuclear para o CXCR4, um romance mecanismo de segmentação clínica, e demonstrar uma piscina nuclear ativo que fornece novas informações importantes para iluminar o que tem sido relatórios principalmente clínicos de CXCR4 nuclear

Citation:. Don-Salu-Hewage AS, Chan SY, McAndrews KM, Chetram MA, Dawson MR, Bethea DA, et al. (2013) cisteína (C) -X-C Receptor 4 Passa por Transportin 1 Dependente de localização nuclear e permanece funcional no Núcleo de células metastáticas do cancro da próstata. PLoS ONE 8 (2): e57194. doi: 10.1371 /journal.pone.0057194

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 20 de novembro de 2012; Aceito: 18 de janeiro de 2013; Publicação: 28 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Don-Salu-Hewage et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado, em parte, por Institutos Nacionais de Saúde concede 2R25GM060414, P201MD002285 (CVH), F31CA153908 (MAC), 2G12RR003062-22 (CVH) e das Mulheres AAAS Collaboration Research International (WIRC) para a minoria Servindo Instituições (MSI), a National Science subsídio da Fundação (CVH). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é a segunda principal causa do aumento da incidência de câncer e mortes relacionadas ao câncer entre os homens nos Estados Unidos [1], [2]. Apesar do tratamento, as altas taxas de mortalidade em CaP são atribuídos a metástase, que é o principal obstáculo no tratamento CaP [3]. Várias moléculas e mecanismos contribuem para metástases de células de cancro. Por exemplo, citocinas quimiotáticas (quimiocinas) aumenta o potencial metastático de CaP por ligação e activação de uma família de receptores acoplados à proteína G (GPCRs) [4], [5], [6], [7] que iniciam os sinais para aprimorar célula a adesão, invasão e movimento, e, subsequentemente, a sobrevivência do tumor, no novo local de metástases. GPCRs constituem a maior família de membrana de plasma transmembranar (PM) receptores [8]. Na sinalização de GPCR convencional, os receptores estão localizados à PM e influenciar a actividade das enzimas PM-localizadas, canais de iões, e /ou segundos mensageiros. A sua activação por um ligando apropriado desencadeia a sinalização através alfa da proteína G (L

α) e /ou beta-gama (L

βγ) subunidades [9], de forma positiva conduz a resultados dependentes do contexto, o que pode e /ou regular negativamente a actividade das moléculas efectoras em cascatas de sinalização dentro da célula [10], [11]. Além disso, os GPCR activados também desencadear uma série de interacções moleculares que permitem a regulação do feedback do acoplamento à proteína G e a endocitose do receptor para atenuar os sinais do receptor [12], [13], [14], [15], [16], [17 ], [18]. Müller

et al

. descrito inicialmente o envolvimento de receptores de quimiocina GPCR na metástase do cancro [19] e Akashi

et ai.

relatado que a quimiocina GPCR, CXCR4, foi altamente expressa em CaP maligno humano da próstata em comparação com o normal [20]. Numerosos estudos têm documentado o envolvimento de CXCR4 em passos-chave de CaP metástase: (i) de sinalização; [21], [22]; (Ii) migração e invasão [23]; e (iii) o estabelecimento de uma rede vascular [24]. Assim, vários agentes terapêuticos para a metástase de células de cancro foram concebidos para antagonizar a sinalização mediada pelo CXCR4 [25], [26]. Na sinalização de CXCR4 convencional, estromal derivada de células fator 1 alpha (SDF1α) é o ligando exclusiva para CXCR4 [27], o que leva a activação de vias torna este receptor favorável para a tumorigénese: (i) G-receptor acoplado a proteína (GPCR) de sinalização ; (Ii) de PI3K /AKT; (Iii) de MAPK; (Iv) de JAK /STAT; (V) de Src quinase e (vi) HER2 [28], [29], [30].

Curiosamente, os GPCRs foram detectados em organelos subcelulares distintas a partir da sua localização PM clássica [31]. Estes organelos incluem o aparelho de Golgi [32], retículo endoplasmático [33], citoesqueleto [34] e a membrana núcleo /nuclear [35]. Hanyaloglu e von Zastrow postulou que a reciclagem padrão de GPCRs por endossomas pode contribuir para melhorar a re-entrega de GPCRs à PM, ou organelas alternados dentro da célula, sem destruir a sua capacidade de sinalização [36]. No entanto, estes receptores GPCR alternadamente-localizadas revelar um novo nível de complexidade que pode ser importante na modulação da sua função. Um número crescente de GPCRs foram observadas durante o núcleo ou membrana nuclear, tais como os receptores lisofosfatídico ácidos, os receptores de glutamato metabotrópicos, receptores do factor de activação de plaquetas, os receptores da angiotensina 2 do tipo I, receptores da prostaglandina, receptores de endotelina, de libertação de gonadotropina tipo hormona eu receptor [ ,,,0],37] e

β

receptores adrenérgicos [38], [39], [40], [41], [42], [43], [44]. GPCRs nucleares têm sido sugeridos para regular um número de processos fisiológicos, incluindo a proliferação celular, sobrevivência, respostas inflamatórias, tumorigênese, a síntese de ADN e a transcrição [43], [45], [46], [47], [48], [49 ], [50]. GPCRs nucleares pode ser constitutivamente activa ou activada por ligantes internos, recém-sintetizadas que são vinculados para a secreção [51]. Subsequentemente, as vias de sinalização de segundo mensageiro clássicos, tais como a proteína induzida por adenilil ciclase quinase A activação (PKA) [38], a libertação induzida de fosfolipase-de cálcio intranucleares, proteína induzida por diacyglycerol Quinase C (PKC) [39], [52], ERK1 /2, as quinases p38 MAP e Proteína Quinase B (PKB) [49], [50] foram mostrados para ser activado por GPCRs nucleares.

a localização nuclear de proteínas é ditada por importação e exportação nuclear através nuclear complexos de poros [53]. pequenas proteínas ( 30-50 kDa) pode passar através do poro nuclear por difusão livre; No entanto, a maioria das proteínas necessitam de carga transporte activo para entrar no núcleo [54]. proteínas maiores usar mecanismos de transporte ativo, que necessitam de assistência por proteínas de transporte [55], [56], [57]. Muitas proteínas encaminhada para o núcleo conter um sinal de localização nuclear clássica (NLS), que é reconhecido por um receptor heterodimérico compreendido por importação importina alfa e beta importina. Muitos destes receptores reconhecem diretamente proteínas carga e orientá-las diretamente para o poro nuclear [58]. No caso desta grande família, os sinais de segmentação dentro das proteínas de carga são frequentemente não bem definido [59]. Cada proteína que se localiza no núcleo deve possuir um NLS funcional ou é necessário para se ligar a proteínas que possuem uma carga de NLS (s). alfa importina reconhece o NLS na proteína de carga, enquanto beta importin tem como alvo o complexo de importação para o poro nuclear [58], [60]. Importina beta faz parte de uma família maior de receptores de transporte, muitas vezes denominados importinas /exportinas [59].

Enquanto um NLS putativa foi identificada em CXCR4 [61], a função deste sinal de direccionamento nuclear no contexto de CXCR4 não foi examinado. Uma via de transporte dependente de importina distintos tem sido implicado no transporte de C-C quimiocina do receptor de tipo 2 (CCR2) [62]. Favre

et al

. descobriram que um engenharia, CCR2 marcada com HA associado com um membro da família de receptores importina transporte nuclear, Transportinβ1 (TRN1), numa linha celular de CCR2-nulo [62]. foi necessária uma interacção de CCR2 com TRN1 para detectar CCR2 em fracções nucleares, sugerindo que o CCR2 transportado para o núcleo através TRN1 [62]. TRN1 tem sido implicada na internalização de GPCR e dessensibilização [63]. Além disso, TRN1 serve como um receptor para proteínas NLS-nulos em NLS-substratos contendo carga [64], tornando-se uma proteína essencial para a importação através do complexo do poro nuclear [65]. Tomados em conjunto, estes estudos sugerem que tanto a maquinaria de importação nuclear clássica e TRN1 são candidatos que desempenham um papel importante na translocação nuclear CXCR4 [66].

a expressão da proteína CXCR4 nuclear tem sido observada em hepatocelular maligna, colo-rectal, das células renais e carcinoma de nasofaringe [67], [68], [69], [70]. Estes estudos, no entanto, foram reportados como observações clínicas, e falhou em investigar os mecanismos de localização CXCR4 ou qualquer função biológica associada com o receptor nuclear. Estes dados são consistentes com relatórios que demonstraram GPCRs funcionais associados com o núcleo, e contribuir para câncer de intervenções terapêuticas em curso contra CXCR4. Importante, uma CXCR4 nuclear funcional pode contribuir para CaP recaída apesar antagonistas actuais e anticorpos monoclonais contra CXCR4 PM-ligado e não podem ser concebidos para atravessar a PM, o que seria necessário para antagonizar CXCR4 activo no núcleo. Além disso, a identificação de vias de transporte necessário para a localização nuclear de CXCR4 pode revelar alvos adicionais para o desenvolvimento terapêutico para impedir a metástase do câncer de próstata e melhorar a sobrevida do paciente.

Materiais e Métodos

cultura de células, anticorpos e Reagente condições

PC3, DU145, 22RV1 linhas celulares de cancro da próstata humanas (APC), a linha de células de próstata humana RWPE1 e a linha celular de rim embrionário humano 293T foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC). PC3, células DU145, 22RV1 e 293T foram mantidas em meio RPMI completo: RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS), aminoácidos não essenciais a 1% e 1% de antibiótico-antimicótico a 37 ° C em 5% de CO

2. células RWPE1 foram mantidas em meio isento de soro de queratinócitos (KSFM) contendo 50 mg /ml de gentamicina, 0,05 mg /ml de extracto de pituitária de bovino (BPE), e 5 ng /ml de factor de crescimento epidérmico (Invitrogen) a 37 ° C em 5% de CO

2. Todas as células foram mantidas a 60% a 80% de confluência. células PC3 foram originalmente isolados a partir de uma metástase vertebral da próstata, enquanto que as células DU145 foram obtidos a partir de metástases cerebrais próstata. 22RV1 células foram a partir de uma linha celular epitelial de carcinoma da próstata humano derivado de um xenoenxerto, que foi propagada em série em ratos, e as células RWPE1 foram isolados a partir de epitélio da próstata humana normal. fontes de cultura de células e sulfato de canamicina (61-176-RG) eram de MediaTech; SDF1α (300-28A) foi de PeproTech. Os seguintes reagentes e anticorpos humanos foram de Cell Signaling: 10 × tampão de lise celular (9803), IgG de ratinho anti-coelho (5127), anti-CD44 (156-3C11), anti-GFP (2956S) e anti-L

αi (5290). Anti-CXCR4 (MAB172) foi de R D Systems. Anti-Topoisomerase1 (SC-271285), anti-lamina A /C (SC-20681), Fusina (H-118) -CXCR4 (SC-9046), Fusina (4G10) -CXCR4 (SC-53534), anti-fibronectina IgG2b (SC-271098), anti-GFP (sc-9996), /G-Plus Agarose esferas de Proteína A (SC-2003), anti-Karyopherinβ2 (SC-166127), Karyopherinβ2 siRNA (h) (SC-35737) e DAPI (SC-3598) eram de Santa Cruz Biotech. NE-PER nuclear e citoplasmática Extraction Kit (78.833), Kit Cocktail Protease Inhibitor (78410) e Halt TM Fosfato Inhibitor Cocktail (78.420) eram da Thermo Scientific. Anti-αTubulin (T5168), anti-βActin (A5441) de Triton X-100 (T8532) e iodeto de propídio (P4170) foram da Sigma-Aldrich. doença da próstata de arranjo de tecido espectro (PR8011) foi adquirido a partir de Biomax. JetPRIME® Polypus reagente de transfecção (114-07) era de VWR International. Nonidet P-40 Suplente (M158) era de BioExpress e FluoForte Kit Calcium Assay (ENZ-51016) era de Enzo Life Sciences

Caracterização de CXCR4 IgG2b (R D systems). Anticorpo

especificidade do anticorpo monoclonal de ratinho anti-CXCR4 humana (R D Systems) a proteína CXCR4 foi determinada através de imunoprecipitação e análise western blot utilizando o CXCR4 PC3-positiva e 293T CXCR4-nulo lisados ​​de célula inteira. Resumidamente, as células PC3 e 293T (5 × 10

6) foram cultivadas em placas de 100 mm em meio completo durante a noite, seguido por incubação em meio RPMI única (soro-inanição) durante 24 horas. As células foram lavadas com 1 × solução salina tamponada com fosfato (PBS) e colhidas em 1 × tampão de lise de sinalização celular. concentrações iguais de proteínas foram estimadas pelo ensaio de Bradford (BioRad) e quantidades iguais foram avaliadas por análise de Western blot com anticorpo monoclonal de ratinho CXCR4-IgG2b ou 1 mg de sobrenadante foi imunoprecipitada (IP) com anticorpo monoclonal de ratinho CXCR4-IgG2b ou Fibronectina-IgG2b monoclonal de ratinho anticorpo durante a noite a 4 ° C (Santa Cruz; 1 ug por 250 ug de proteína), seguido por incubação com /G-Plus Agarose esferas de proteína a durante 2 hrs a 4 ° C. esferas de agarose ligadas a proteínas foram separadas a partir de lisados ​​por uma série de 3 lavagens com 1 x PBS e (temperatura máxima velocidade /2 min /quarto [RT]) centrifugação. Grânulos em tampão Lammelli foram separados por 10% SDS-PAGE, transferidos para membranas de polivinilideno (PVDF) e sondadas para CXCR4-IgG2b (1:1000). Para confirmar que as células PC3 expressas Fibronectina, 25 ug de lisado celular total foi colhido para análise de Western blot. Beta-actina foi utilizado como um controlo de carga.

A imuno-histoquímica (IHC)

análise

O IHC foi realizada numa matriz de tecido espectro de doenças da próstata (Biomax) variando de normal a tecidos metastáticos alto grau. A matriz consistia em 80 Total de núcleos de tecido, incluindo adenocarcinoma, metastático, hiperplasia, inflamação crónica, tecido adjacente normal e tecido normal. Cada núcleo indivíduo tinha um diâmetro de 1,5 mm e uma espessura de 0,5 um. Resumidamente,, espécimes embebidos em parafina e fixados em formalina foram recuperados em lavagens de xileno, etanol e solução de recuperação de antigénio, pH 6,0, (Biocare Médico) a 125 ° C durante 30 seg. As amostras foram neutralizadas em peróxido de hidrogénio a 0,3% durante 15 min à temperatura ambiente (TA), lavada com 1 x PBS, numa câmara humidif içada e bloqueadas com solução de bloqueio (5% de soro de cabra normal /solução salina tamponada com Tris /Tween-20; TBST) durante 30 min. CXCR4 foi detectado com um anticorpo monoclonal de ratinho anti-humano CXCR4 (R D Systems; 1:1000) em solução de bloqueio durante a noite a 4 ° C, seguido por uma afinidade biotinilada de cabra purificado anti-IgG de ratinho (H + L) anticorpo secundário ( Vector Laboratories; 1:1000), em solução de bloqueio durante 30 minutos à TA. As amostras foram lavadas completamente entre as incubações, desenvolvido em diaminobenzidina (Vector Laboratories) durante 3 min a RT, e contrastadas com hematoxilina de Meyer, utilizando técnicas convencionais. Uma amostra de tecido de controlo negativo foi preparada por incubação de afinidade biotinilada de cabra purificado de rato anti-IgG (H + L) de anticorpo, somente, como descrito acima. As amostras foram analisadas e fotografadas pelo Dr. Dezhi Wang [71] no Centro de doença metabólica óssea Núcleo de Laboratório, Escola UAB da Medicina, Birmingham, Alabama. A distribuição de células positivas para o receptor CXCR4 foi gravado para representar a natureza difusa ou focal das células positivas como esporádicos (células positivas para 5%); (células positivas 11%, mas inferior a 50%) focais; ou difusa (células positivas 50%). de acordo com a densidade média de células positivas para CXCR4 (DAB manchado), para ver a diferença óbvia na força de expressão CXCR4

Histomophometry medição da intensidade da coloração para CXCR4 em prostate Cancer tecidos

A densidade média de células positivas (DAB manchado) foi medida usando Software BIOQUANT® Análise de imagem (RtmBometrics) e uma Olympus BX51 microscópio com uma câmera Q-Imaging. O software de análise de um grupo de pixels média e devolvido um valor de dados com base no valor de cor dos pixels de amostras coradas. Três campos aleatórios de tecidos da próstata foram seleccionados com uma ampliação de (400X) para cada secção de acordo com o tamanho do tecido. Em cada região aleatória, as células (um grupo de pixels) que foram coradas positivamente (Brown) com o anticorpo CXCR4 foram seleccionados pela ferramenta de limiar do software. A fonte de luz espécime é conhecido por afetar a medição de densidade; portanto, todas as seções foram medidos utilizando a mesma correcção de fundo fornecido pela Bioquant.

subcelular Fracionamento

APC e células normais epiteliais da próstata (1 × 10

6) foram privadas de soro durante 3 hrs (22RV1 e RWPE1) ou 24 horas (PC3 e DU145), antes do tratamento com SDF1α (100 ng /mL) durante 30 min. fraccionamentos subcelulares foram realizados segundo as instruções do fabricante (Thermo Scientific). Resumidamente, as células foram lisadas em uma série de tampões e passos de centrifugação para obter uma fracção não nuclear e um pelete nuclear intacta, seguido por lise adicional para isolar proteínas nucleares. Quarenta a cem microgramas de fracções nucleares e não nucleares foram separadas por electroforese em SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF. A expressão de CXCR4 ou proteína de fusão GFP-CXCR4 foi detectado com um anticorpo monoclonal de ratinho GFP (Santa Cruz; 1:500) ou CXCR4 anticorpo anti-humano (R D Systems; 1:1000). Anti-topoisomerase I (Santa Cruz; 1:1000) e anti-CD44 (Cell Signaling; 1:1000) anticorpos foram utilizados para garantir a integridade das fracções e como controlos de carga. filmes de raios-X foram digitalizados e Quantidade Um programa de software foi utilizado para a análise de densitometria.

Imunocitoqu�ica indireta (ICC) para CXCR4

As células (3 × 10

5) foram semeadas em vidro (lamelas Fisher), privadas de soro tal como descrito, antes dos tratamentos com SDF1α (100 ng /ul). As células foram fixadas com gelada metanol a 100% durante 5 min a -20 ° C e lavadas com 1 x PBS. As proteínas não específicas foram bloqueadas em solução de bloqueio (3% de burro normal de soro /1% de BSA /0,1% de Triton X-100 em 1 × PBS) durante 30 min à temperatura ambiente, antes da incubação com o CXCR4 (R D Systems, 1: 100), lamina a /C (Santa Cruz, 1:100), ou anticorpo monoclonal de ratinho GFP (Santa Cruz, 1:100) em solução a 4 ° C durante a noite bloqueando. detecção secundário foi com Cy3 de burro conjugado com IgG anti-rato ou de IgG conjugado com FITC anti-coelho (Jackson Immuno Research, 1:1000) em solução de bloqueio à temperatura ambiente durante 1 h, seguido por três lavagens em 1 x PBS. Em alguns casos, os núcleos foram detectados com iodeto de propídio (1 ug /uL) ou DAPI (1:250) em 1 × PBS antes da montagem no Aqua-Polymount (Polyscience, Inc.). As imagens foram tiradas no Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA com um 63x Plan-Apochromat 63x /1,40 objetivo Oil DIC em uma Zeiss LSM-510 UV Confocal Microscópio de excitação 488 nm para FITC e 543 nm para Cy3 ou pelo Clark Atlanta University, Atlanta, GA com o software Axiovision 4.8.2 em um microscópio de fluorescência Zeiss Axio Imager.z1 a 40 × ampliação na excitação 470 nm para FITC, 358 nm para DAPI e 551 nm para Cy3.

Mutagênese

R146A R148A e mutações pontuais dentro do NLS, e eliminação do NLS, dentro de proteína de fusão GFP-CXCR4 foram gerados utilizando o Quik Mudança XL site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene); pEGFPN1-CXCR4 serviu como o modelo [72]. Os iniciadores directos e reversos de R146A, R148A e NLS foram excluídos (as tecnologias de ADN integrada): (i) R146A: FWD5′-CACGCCACCAACAGTCAGGCACCAAGGAAGCTGTTGGCTG-3 ‘, 5′-REV CAGCCAACAGCTTCCTTGGTGCCTGACTGTTGGTGGCGTG-3′; (Ii) R148A: FWD5`-CCAACAGTCAGAGGCCAGCGAAGCTGTTGGCTGAAA-3`, 5` REV-TTTCAGCCAACAGCTTCGCTGGCCTCTGACTGTTGG 3`; e (iii) eliminação NLS: FWD5’-CGCCACCAACAGTCAGCTGTTGGCTGAAAAGG-3 ‘e REV5′-CCTTTTCAGCCAACAGCTGACTGTTGGTGGCG-3’. Os plasmídeos resultantes foram pEGFPN1-CXCR4R146A, pEGFPN1-CXCR4R148A e pEGFPN1-CXCR4ΔNLS. CXCR4 positiva clones mutantes foram seleccionados com canamicina e ainda purificado por Maxi-prep (Bio-Tek Omega). Precisão das mutações foi confirmada por sequenciamento de DNA em um ABI 3130 xl Gene Analyzer Sequencer no Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA.

Transient Transfec�es

As transfecções transientes foram realizadas com 2 mg de concentrado ADN e jetPRIME® Polypus transfecção, conforme instruções dos fabricantes. Resumidamente, as células PC3 foram incubadas com os complexos de ADN-jetPRIME® em 15% de FBS /RPMI, durante 4 horas e o meio foi substituído com 15% de FBS em meio RPMI durante mais 18 horas, antes de soro-inanição (24 horas). As células foram então colhidas para as respectivas experiências.

A expressão de Transportinβ1 (TRN1)

células privadas de soro (5 × 10

6) foram tratados com SDF1α por 30 min antes da colheita 60 ? g de lisados ​​de células inteiras para análise de western blot. Expressão de TRN1 foi detectado com um anticorpo monoclonal de murganho (Santa Cruz; 1:1000); α-tubulina ou β-actina foi utilizado como um controlo de carga

A imunoprecipitação

Um miligrama de inteiros PC3 lisados ​​celulares foram imunoprecipitados de CXCR4. (Santa Cruz; 1 ug por 250 ug de proteína) durante a noite a 4 ° C, seguido por incubação com esferas de Proteína a /G-Plus Agarose (Santa Cruz) durante 2 horas a 4 ° C. esferas de agarose-CXCR4 ligados foram separados a partir de lisados ​​por uma série de 3 lavagens com PBS e centrifugação à velocidade máxima durante 1 min a 4 ° C. As esferas foram processadas para análise de Western blot para TRN1 (Santa Cruz; 1:1000) e, subsequentemente, para o CXCR4 sondado com anticorpo anti-CXCR4 de coelho (Santa Cruz, 1:500) seguido de incubação com IgG anti-rato de coelho (Cell Signaling) secundário anticorpo. Trinta microgramas do sobrenadante obtido após a incubação com esferas de agarose também foram separados por 10% SDS-PAGE, e processados ​​para análise de Western blot para CXCR4 como descrito na caracterização de anticorpo CXCR4.

ARN de interferência Transfecção

transfecção transiente de TRN1 siRNA específico (Santa Cruz) foi realizada em células PC3 plaqueadas em lamelas de vidro usando JetPRIME®. Resumidamente, as células (2 x 10

5) foram plaqueadas em 35 milímetros, 6 pratos cavidades e foram transfectadas com 50 nM TRN1-siARN (Santa Cruz) em 15% de FBS /meio RPMI a 37 ° C em 5% de CO

2 durante 24 horas. Posteriormente, as células transfectadas foram durante 24 horas privadas de soro, antes da análise imunocitoquímica.

Imunoprecipitação de G

αi

células privadas de soro (5 × 10

6) foram tratadas com SDF1α por 30 min antes da colheita para imunoprecipitação. Resumidamente, as células foram lavadas em 1 x PBS e raspadas suavemente em NP-40 tampão de lise (1 × PBS pH 7,4, 0,1% de Triton × 100, NP40 a 0,1% e um cocktail de inibidor ×). Após 30 min de incubação em gelo, o ligado foi centrifugado a 600 rcf /5 min /4 ° C). O sobrenadante foi suavemente decantado, e o sedimento nuclear foi ressuspenso em tampão de lise, 10 vezes o volume do sedimento de núcleos, e sonicada em gelo durante 3 seg. O lisado foi centrifugado a 600 rcf /5 min /4 ° C, e 1 mg de sobrenadante foi imunoprecipitada por CXCR4 (monoclonal de ratinho, Santa Cruz) durante a noite a 4 ° C, seguido por incubação com /G-Plus Agarose esferas de Proteína A ( Santa Cruz) durante 2 horas a 4 ° C. esferas de agarose ligadas a CXCR4 foram separadas a partir de lisado por uma série de 3 lavagens com tampão de lise NP40 e centrifugação (5000 pm /2 min /temperatura ambiente). A lavagem final foi com 1 × PBS. As esferas foram processadas para análise western blot e as membranas foram sondadas para G

αi (Cell Signaling; 1:1000). Subsequentemente, as transferências foram sondado para CXCR4 com anticorpo de coelho anti-CXCR4 (Santa Cruz, 1:500) seguido de incubação com IgG anti-rato de coelho (Cell Signaling) anticorpo secundário. Topoisomerase1 (Santa Cruz) e anti-CD44 (Cell Signaling) foram utilizados para avaliar a pureza de lisados ​​núcleos.

Intranuclear Cálcio (Ca

2 +) Mobilização

PC3

privadas de soro células (2,5 x 10

5) foram recolhidas para se obter núcleos intactos em NP-40 tampão de lise como acima descrito, antes de se efectuar ensaio de acordo com as instruções do fabricante (Enzo Life Sciences). Resumidamente, não tratados núcleos isolados foram novamente suspensos em 100 ul de solução FluoForte corante de carregamento (Enzo Life Sciences) durante 45 min a 37 ° C e 15 min à temperatura ambiente, em seguida, centrifugada a 600 rcf /5 min /temperatura ambiente. Soluções de AMD3100 (100 ng /ul) e toxina da tosse convulsa (PTX) (200 ng /ml) foram preparadas em cálcio livre, o fenol livre de RPMI. amostras de núcleos foram ressuspensos em 100 ul de AMD3100 e PTX, divididas em alíquotas em placas, de fundo transparente com paredes pretas-96well, e incubou-se durante 1 h. Em seguida, o SDF1α foi adicionado às amostras em placas, (diluição final de 100 ng /ul) e incubou-se durante 30 min à temperatura ambiente. mobilização de cálcio Intranuclear foi determinada pela intensidade (aumento) de fluorescente (FluoForte) -bound Ca

2 + na mídia. Os resultados foram medidos em um leitor de microplacas a 490 nm de excitação e emissão de 525 nm. Cada amostra foi preparada em triplicado por experiência, e realizou pelo menos três vezes.

Análise Estatística

Se for caso disso, os dados foram analisados ​​por um teste t de Student ou ANOVA utilizando GraphPad Prism (GraphPad ) Programas. Os valores de P inferiores a 0,05 foram considerados significativos.

Resultados

CXCR4 é expresso no Núcleo de tecidos da próstata

análise do domínio anterior de CXCR4 sugeriu que CXCR4 contém um sinal de direccionamento nuclear entre os aminoácidos 90-170 [73]. Uma análise bioinformática utilizando o software de previsão PSORT II NLS (https://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/) revelou uma sequência de localização nuclear putativa, ‘RPRK’ [72], [74], [75], [76] entre os aminoácidos 146-149 no prazo de CXCR4 (Tabela 1). Além disso, uma busca de base de dados NCBI para a NLS dentro CXCR4 HomoloGene /revelou que ‘RPRK’ é sido conservado entre as espécies, incluindo galinha, rato, chimpanzé e outros (Tabela 2). Além disso, o CXCR4 foi detectado no núcleo de vários tecidos de cancro [68], [70]. Com base nestes dados, testou-se a proteína CXCR4 poderia ser detectado no interior do núcleo de tecidos da próstata. Usando um microarray tecido da próstata variando de normal a lesões metastáticas de alta qualidade, detectamos imunorreatividade positiva para CXCR4 em amostras de próstata. imunorreactividade positiva foi detectada como (células CXCR4 positivos 5%) esporádicos, (células positivas CXCR4 11%, mas menos do que 50%) focais ou difusos (células positivas CXCR4 50%), em comparação com a média total densidade de células positivas para o CXCR4 (DAB manchado). As amostras com contagens de imuno-histoquímica de coloração negativa, fraca ou moderada, com esporádica para distribuições focais, foram considerados como tendo a expressão “baixo”, ao passo que as distribuições difusas de coloração foram considerados como tendo a expressão “alto” para CXCR4. Intensidade de coloração era focal em esporádica para o núcleo de tecidos da próstata de baixo grau (Fig. 1a), enquanto os tecidos malignos de alto grau (Fig. 1A), apresentado um aumento da intensidade de coloração e a expressão de CXCR4 difusa por todo o tecido em comparação com baixo grau. Em ambos os tumores de baixo e alto grau, uma fracção de CXCR4 claramente co-localizada com o núcleo. Intensidade de coloração para CXCR4 foi fraco, ou mesmo nula, em tecidos normais (Fig. 1A).

A

, Uma matriz de tecido da próstata humana, variando de normal a câncer de próstata de alto grau, foi avaliada por IHC para a expressão de CXCR4 utilizando métodos padrão. As amostras foram avaliadas em aumento de 40 vezes, usando uma câmera de imagem-Q da Olympus BX51 microscópio com software de análise de BIOQUANT® Imagem (RtmBometrics). tecidos da próstata normais demonstraram coloração ligeiramente fraco ou indetectável marrom para CXCR4 (células positivas 5%) e nenhuma expressão CXCR4 no núcleo. tecido representativo de baixo grau da próstata (grau 2, fase II, T

2N

0M

0, o adenocarcinoma) demonstraram coloração aleatória /focal positivo para CXCR4 no núcleo (células positivas 11%, mas menos de 50%), indicando baixa expressão de CXCR4. tecido representativo alto grau metastático da próstata (grau 4, estádio IV, T

4N

1M

1, adenocarcinoma) demonstrou difuso /coloração intensa (células positivas 50%), indicando uma expressão elevada para CXCR4 na núcleo. A barra de escala representa 50 um.

B

, anticorpo monoclonal de ratinho IgG2b CXCR4 foi avaliada para especificidade a proteína CXCR4 por análise de Western blot em PC3 (CXCR4 positivo) ou 293T (null CXCR4) linhas celulares.

C

, o anticorpo CXCR4 foi avaliada para a especificidade à proteína CXCR4 por imunoprecipitação para CXCR4 e análise western blot para CXCR4.

D

, o anticorpo CXCR4 IgG2b foi avaliada para a especificidade à proteína CXCR4 por imunoprecipitação com anticorpo Fibronectina IgG2b de rato monoclonal (controlo de isotipo não relacionada) e análise western blot para CXCR4; a expressão da proteína fibronectina foi confirmada por análise Western Blot. Beta-actina foi utilizado como um controlo de carga.

relataram que as células PC3 foram positivas e células 293T foram nulo, respectivamente, para a proteína CXCR4 [21]. Para assegurar a especificidade do anticorpo monoclonal CXCR4 (MAB172IgG2b) usada para detectar a sua proteína correspondente no núcleo de tecidos da próstata, que re-analisados ​​PC3 e 293T para CXCR4 com anticorpo CXCR4 (MAB172IgG2b) por análise de Western blot (Fig. 1B). Semelhante aos nossos estudos anteriores, CXCR4 foi detectada em PC3 mas não em células 293T lisados ​​de células inteiras (Fig. 1B). Análise subsequente dos lisados ​​celulares por imunoprecipitação com MAB172 IgG2b seguidos por análise de Western blot com MAB172 IgG2b detectada CXCR4 apenas em lisados ​​PC3 (Fig. 1C). Para confirmar ainda mais a especificidade de MAB172IgG2b ao CXCR4, lisados ​​celulares PC3 foram sujeitos a imunoprecipitação com IgG2b de fibronectina, um controlo de isotipo, seguido por análise Western blot com MAB172 IgG2b (Fig. 1D). Fibronectina não foi detectado pelo IP com CXCR4, mas foi detectada por Western blot com um anticorpo de fibronectina (Fig. 1D).

CXCR4 está presente em frações nucleares de células cancerosas da próstata

Nós utilizados bioquímica fraccionamento para confirmar a localização nuclear de CXCR4 detectado no nosso coloração de tecidos. Os núcleos foram coradas com DAPI (azul). Sun

et al

. Wang

et al

.