Abstract

Fundo

testes altamente sensíveis e específicos à base de urina para detectar qualquer câncer de bexiga primário ou recorrente revelaram-se indefinida a data. O nosso conhecimento cada vez maior das aberrações genómicos no cancro da bexiga deverá permitir o desenvolvimento de tais ensaios baseados em ADN urinária.

Métodos

O DNA foi extraído a partir de sedimentos de células e a urina de PCR utilizados para amplificar as regiões do

TERT

promotor e regiões do

FGFR3

,

PIK3CA

,

TP53

,

HRAS

,

KDM6A codificação Comprar e

RXRA

que são frequentemente mutado no cancro da bexiga. Os produtos de PCR foram código de barras, reunidas e-emparelhado final de 2 x 250 pb de sequenciação efectuados numa Ilumina MiSeq. DNA urinária foi analisado a partir de 20 controles não-cancerosas, 120 doentes com cancro da bexiga primária (41 PTA, 40 PT1, 39 pT2 +) e 91 pacientes com cancro da bexiga pós-TURBT (89 cancer-free).

Resultados

Apesar das pequenas quantidades de DNA extraído de algumas pelotas de células de urina, 96% das amostras produziram significa profundidades Ler 500. Analisando mutações pontuais única previamente relatados,

TERT

mutações foram encontradas em 55% dos pacientes com câncer de bexiga (independentemente do estágio),

FGFR3

mutações em 30% dos pacientes com câncer de bexiga,

PIK3CA

em 14% e

TP53

mutações em 12% dos pacientes com câncer de bexiga. Em geral, essas mutações de câncer de bexiga previamente relatados foram detectados em 86 de 122 doentes com cancro da bexiga (sensibilidade de 70%) e em apenas 3 dos 109 pacientes sem cancro da bexiga detectável (97% de especificidade).

Conclusão

Esta abordagem simples e de baixo custo pode ser utilizado para a vigilância não-invasivo de pacientes com cancros da bexiga, do músculo não-invasivo que albergam estas mutações. O método tem um requisito de baixo de entrada do ADN e pode detectar níveis baixos de ADN mutante num grande excesso de DNA normal. Estes genes representam um painel de biomarcador mínima para o que poderia ser adicionado marcadores extras para desenvolver um teste de diagnóstico altamente sensível para o câncer de bexiga

Citation:. Ward DG, Baxter L, Gordon NS, Ott S, RS Savage, Beggs AD , et ai. (2016) Multiplex PCR e Next Generation Sequencing para a detecção não invasiva de cancro da bexiga. PLoS ONE 11 (2): e0149756. doi: 10.1371 /journal.pone.0149756

editor: Francisco X. real, Centro Nacional de Investigações Oncológicas (CNIO), ESPANHA

Recebido: 21 Setembro, 2015; Aceito: 04 de fevereiro de 2016; Publicação: 22 de fevereiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Ward et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. A percentagem do mutante leituras foram usados ​​como entrada para todos os gráficos, sensibilidades, especificidades, etc., e estes são apresentados para cada lugar em todas as amostras na Tabela S2

Financiamento:. Este projecto foi financiado por uma Wellcome Trust siga concessão de fundos -em administrado pela Universidade de Birmingham. BCPP é financiado pelo Cancer Research UK, da Universidade de Birmingham e de Birmingham e The Black Country e West Midlands do Norte e do Sul Comprehensive local Research Networks, e patrocinado pela Universidade de Birmingham. A coleção biospecimen BCPP é suportado pelo financiamento do Birmingham ECMC. DGW é financiado por uma doação filantrópica para a Universidade de Birmingham em apoio à pesquisa de cancro da bexiga. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

abreviações : NGS, próxima geração seqüenciamento; UBC, cancro da bexiga urothelial; NMIBC, não-muscular câncer de bexiga invasivo; CINM, cancro da bexiga músculo-invasivo

Introdução

cistoscopia flexível, combinado com citologia urinária, é a abordagem padrão-ouro para a detecção de tumores de bexiga. vigilância de longo prazo para a recorrência pós-tratamento é oneroso para os pacientes e caro para os profissionais de saúde. Há muito que se esperava que um teste baseado em moléculas liberadas para a urina pelas células tumorais pode reduzir a dependência de cistoscopia, no entanto, até à data provas suficientemente sensíveis e específicos não foram desenvolvidos e aprovados por médicos [1].

existentes biomarcadores urinários para o cancro da bexiga, tais como NMP22 e BTA falta de sensibilidade para a doença de baixo grau e pode ser falsamente elevados devido às condições não-malignas e hematúria [1]. Grandes esforços têm sido despendidos na descoberta de biomarcadores urinários para a detecção não invasiva de cancro da bexiga com particular sucesso que está sendo alcançado medindo tumor variantes de ácidos nucleicos específicas [2,3,4]. experimentos genômicos e transcriptomic recentes têm mostrado que baixo grau NMIBC e CIS /HG-NMIBC /CINM têm perfis de mutação e de expressão de genes distintos e que, mesmo dentro existe NMIBC considerável heterogeneidade (revisto em [5]). Assim, parece provável que um painel de biomarcadores, que capta a diversidade de UBC será necessário para detectar com fiabilidade a doença.

Testes de urina com base em ADN mostram a promessa considerável para a detecção não invasiva de UBC. Em teoria, se ADN de tumor estiver presente, ele pode ser amplificado por PCR e alterações específicas do cancro detectado. Dois dos genes mais frequentemente mutado no cancro da bexiga com hotspots ponto de mutação são

FGFR3

[6] e

TERT

[7,8,9,10]. Ambos foram avaliados como biomarcadores para a detecção de câncer de bexiga em DNA urinária em estudos separados [7,11,12], mas eles não foram combinados em um ensaio baseado em NGS. O

TERT

promotor está mutado em aproximadamente 65% dos tumores de bexiga, independentemente do estágio e grau [13] e representa o melhor biomarcador único para o câncer de bexiga com um relatório recente da sensibilidade de 62% a 90% de especificidade para a detecção primária tumores de bexiga [7].

Temos agora desenvolvido um ensaio que utiliza high-thoughput deep-sequenciação das regiões de genes associados 6 UBC que contêm hotspots de mutação e analisados ​​DNA urinária de 232 pacientes para avaliar a sua capacidade de não-invasiva detectar UBC. Teoricamente, a sequenciação profunda deve detectar de forma fiável, mesmo níveis muito baixos de ADN do tumor em um grande excesso de DNA não-tumor. Além disso, esta tecnologia está amadurecendo até o ponto onde ele está se tornando uma abordagem de rotina em laboratórios de testes genéticos clínicos.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Todas as amostras foram obtidas após consentimento por escrito e aprovação informado pelos conselhos de ética em pesquisa nacional adequados de revisão do Reino Unido (referências do Serviço nacional de ética em Pesquisa indicado abaixo); formulários de consentimento assinados foram realizadas dentro de arquivos individuais do paciente, com o consentimento documentado nas bases de dados de estudos relevantes.

Os pacientes UBC e não-UBC foram coletados como parte do Programa de prognóstico do câncer de bexiga, BCPP (NRES Comissão Médio Midlands- Derby: 06 /MRE04 /65), que incorporou coleção biospecimen prospectivo para a pesquisa com biomarcadores

Uma segunda coleta de urina (Comitê NRES North West-Haydock:. 15 /NW /0079) foi realizado a partir de pacientes submetidos à vigilância seguinte TURBT para NMIBC

Os pacientes

a urina foi coletada a partir de três grupos de pacientes:. ‘não-UBC’, ‘UBC “e” pós-UBC’. Os pacientes UBC e não-UBC foram coletados como parte do programa de West Midlands ‘do cancro de bexiga Prognosis, 2005-11 (BCPP, descrito em detalhes aqui: [14]). Resumidamente, midstream urina (20-50 ml) foi coletada no momento do diagnóstico de pacientes com achados cistoscópicas indicativos de cancro da bexiga primário; urina foi centrifugada e sedimento e sobrenadante armazenado a -80 ° C. Após a coleta da amostra, cada paciente foi submetido TURBT e diagnóstico definitivo pelo exame histopatológico do tecido ressecado. Desde vesical primário

carcinoma in situ

(CIS) é uma lesão rara na coorte BCPP e em outros lugares [15], os pacientes com CIS primários foram excluídos por não tínhamos número suficiente para ser capaz de tirar conclusões válidas. Alguns pacientes recrutados para BCPP e que deu amostras de urina foram posteriormente diagnosticados com condições urológicas não malignas, e são incluídos no estudo como pacientes “não-UBC ‘.

Separadamente, uma segunda recolha de urina prospectivo foi realizado em West Midlands durante 2012 a partir de um grupo independente de 91 pacientes submetidos à vigilância seguinte TURBT para NMIBC, e utilizando o mesmo protocolo de coleta de urina. Com a exceção de 2 pacientes, todos os pacientes estavam na data da coleta de urina ( “pós-UBC ‘grupo) livre de doença. Os 2 pacientes com doença recorrente foram adicionados ao grupo UBC. dados cistoscopia subsequentes estavam disponíveis para 38 dos pacientes do “pós-UBC ’89, e não mostrou mais recorrências em uma média de 8 meses. O DNA foi extraído a partir de sedimentos de urina utilizando kits de isolamento de ADN de urina para células esfoliadas e bactérias (NorgenBiotek.com) e eluiu-se em 100 ul de água desionizada.

PCR e código de barras de

A amplificação por PCR em multiplex única foi utilizada para amplificar 16 amplicons no

TERT

promotor e regiões de codificação

FGFR3

,

PIK3CA

,

TP53

,

HRAS

,

RXRA

e

KDM6A

(seqüências de primers em S1 Tabela). O método PCR foi adaptado de Allory

et al

[7] como o

TERT e região promotora é difícil para amplificar e tentativas iniciais utilizando várias outras polimerases falhou. As amplificações de PCR consistiram em 9 ul de ADN, 10 uL KAPA2G robusta ADN Polimerase (KapaBiosystems) e 1 ul de iniciadores (0,2 uM final para cada iniciador). O programa de PCR foi: 95 ° C durante 3 minutos, 35 x 95 ° C durante 15s, 60 ° C durante 15s, 72 ° C durante 15 s, seguido por 3 min a 72 ° C (as sequências de iniciadores são fornecidos na informação de base, Tabela S1 ). Os produtos de PCR foram diluídos 1/100 com água deionizada e 10 códigos de barras pb adicionado por um segundo ciclo de 15 PCR usando KAPA2G Robust DNA polimerase e códigos de barras individuais de acesso direção de matriz para sequenciadores Illumina (Fluidigm).

O sequenciamento e análise de dados

Os produtos de PCR com código de barras foram misturados e limpas usando pérolas AMPure. Os amplicons reunidas foram então misturadas 7: 3 com phix (Illumina), desnaturados e agrupados em seis horas em uma célula de fluxo ciclo de 500 Miseq e sequenciado (250 ciclos para a frente, 10 ciclos de código de barras, a 250 ciclos reverso). arquivos de rastreamento em bruto foram processados ​​com cutadapt (versão 1.8.1, Python 2.6.6) no modo final emparelhado para remover sequências de adaptador, e para filtrar os pares com uma sequência 100 NT para excluir artefactos de leitura curtos. alinhamentos locais de lê ao genoma hg19 foram realizadas utilizando bowtie2 (versão 2.2.4) no modo final emparelhados. arquivos de alinhamento SAM foram convertidos para arquivos BAM, classificado e indexado usando samtools (versão 0.1.19). arquivos BAM foram processados ​​com bam-readcount (https://github.com/genome/bam-readcount), limite de qualidade de base mínima definida para 0