Abstract
Over-activação dos transdutores de sinal e activadores de a transcrição 3 (Stat3) via pulmonar em células epiteliais alveolares tipo II (II) induz a inflamação crónica e adenocarcinoma do pulmão de ratinhos bitransgenic
7-CMV-Stat3C ccsp-rtTA /(tetO). Um dos STAT3 produtos genes a jusante, quitinase 3-like 1 (CHI3L1) proteína, mostrou aumento da concentração da fluido de lavagem broncoalveolar (LBA) e do sangue dos doentes tratados com doxiciclina CCSP-rtTA /(tetO)
7-CMV-Stat3C bitransgenic ratos. Quando testado em outros modelos do rato do cancro do pulmão induzida por inflamação, a concentração de proteína CHI3L1 foi também altamente aumentada em BALF e sangue destes modelos com tumores. coloração imuno-histoquímica mostrou forte coloração de proteína CHI3L1 em torno de áreas de tumor nestes modelos do rato. Análise de objetos normais e pacientes com câncer de pulmão revelou uma elevação significativa da concentração de proteína CHI3L1 em amostras de soro humano de todas as categorias de cancros do pulmão. Além disso, a proteína recombinante CHI3L estimulou a proliferação e crescimento das células do cancro do pulmão de Lewis. Portanto, secretora CHI3L1 desempenha um papel importante na formação do cancro do pulmão induzida por inflamação e, potencialmente, servir como um biomarcador para a previsão do cancro do pulmão. Com base na nossa publicação anterior e este trabalho, este é o primeiro estudo com animais que liga a superexpressão de CHI3L1 para vários modelos de ratinho de tumor do pulmão. Estes modelos irão facilitar a identificação de biomarcadores adicionais para prever e verificar o cancro do pulmão sob várias condições patogênicas, que normalmente não pode ser feito em humanos
Citation:. Yan C, Ding X, Wu L, Yu M, Qu P, du H (2013) Stat3 Downstream Gene Produto chitinase 3-Como 1 é um potencial biomarcador de câncer de pulmão induzida por inflamação em vários modelos de tumor de pulmão do rato e humanos. PLoS ONE 8 (4): e61984. doi: 10.1371 /journal.pone.0061984
editor: Jian-Xin Gao, Xangai Jiao Tong University School of Medicine, China
Recebido: 12 de novembro de 2012; Aceito: 16 de março de 2013; Publicação: 22 de abril de 2013
Direitos de autor: © 2013 Yan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O financiamento foi fornecido pelo NIH CA138759, CA152099 (C. Yan) e HL087001 (H. Du). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o cancro do pulmão é a causa mais letal na população câncer humano. A taxa de sobrevivência de cinco anos é de apenas cerca de 15%. Existe uma necessidade urgente para a identificação de biomarcadores que podem ser usados para prever a ocorrência do cancro do pulmão. Recentemente, demonstrou-se que tanto a inflamação Regional iniciou-célula epitelial pulmonar e inflamação sistémica iniciou-célula mielóide pode induzir tumorigénese pulmão espontânea em vários modelos animais de tumores do pulmão [1], [2], [3], [4], [5] , indicando que as moléculas inflamatórias são potencialmente úteis para a previsão do cancro do pulmão. Estes modelos animais de tumor pulmonar induzida por inflamação são sistemas ideais e valiosos para a identificação e verificação dos biomarcadores de câncer de pulmão. Durante o processo patogénico da inflamação crónica e a tumorigénese pulmão nestes modelos animais, uma característica comum é Stat3 sobre-activação no mielóide inflamatória derivados de células supressoras (MDSCs) e pulmão de células epiteliais, sugerindo que o STAT3 desempenha um papel fundamental na tumorigénese do pulmão induzida por inflamação . De fato, quando uma forma activa constitutiva da Stat3C é sobre-expressos em células epiteliais alveolares tipo II, induz genes inflamatórios jusante. Subsequentemente, a sobre-regulação destas moléculas inflamatórias e recruta estimula células inflamatórias (tais MDSCs) para o pulmão para formar um ambiente inflamatório. persistente presença dessas células inflamatórias facilita adenocarcinoma espontâneo no pulmão do CCSP-rtTA /(tetO)
7Stat3C ratos bitransgenic [1], [6].
Com base nestas observações, nós supomos que Stat3 jusante genes servem como potenciais biomarcadores para predição de câncer pulmonar induzida por inflamação. análise de microarray Affymetrix GeneChip revela cerca de 800 STAT3 genes a jusante no pulmão do CCSP-rtTA /(tetO)
7Stat3C ratos bitransgenic como já relatado anteriormente [1]. Quando testada em animais e seres humanos, alguns destes genes podem ser utilizadas como biomarcadores para o cancro do pulmão [1], [7]. Uma vez que a maioria destes genes são proteínas intracelulares, é difícil usá-los para fins de diagnóstico clínico e prognóstico, sem passar por biópsia. Por conseguinte, existe uma necessidade de identificar as proteínas solúveis e secretoras como biomarcadores em amostras de fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) ou soro para a previsão e a verificação do cancro do pulmão. Aqui, nós relatamos que a proteína secretora Chitinase 3-Como a 1 (CHI3L1), um produto gene a jusante Stat3, é um potencial biomarcador para prognóstico do cancro do pulmão em vários modelos de tumores animais e seres humanos.
Métodos
animal Care
Todos os protocolos científicos que envolvam o uso de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de animal Care and Use (IACUC) da Indiana University School of Medicine e seguiu diretrizes estabelecidas pelo Painel sobre a eutanásia da Veterinária americana Medical Association. Protocolos envolvendo o uso de DNA recombinante ou materiais de risco biológico foram aprovados pelo Comitê de Biossegurança da Indiana University School of Medicine e seguiu diretrizes estabelecidas pelo National Institutes of Health. Os animais foram alojados em (IACUC) -aprovado condições em um biotério segura em Indiana University School of Medicine. Todos os ratinhos transgénicos específicos de células foram previamente descritos [1], [2], [3], [4], [5].
ELISA
Para a recolha de soro de murganho, o abdominal cavidades tratadas com doxiciclina ou não tratada CCSP-rtTA /(TetO)
7-CMV-Stat3, CCSP-rtTA /(TetO)
7-CMV-MMP12, CCSP-rtTA /(TetO)
7 -CMV-Api6, c-fms-rtTA /(TetO)
7-CMV-Api6 e c-fms-rtTA /(TetO)
7-CMV-MMP12 ratos bitransgenic foram abertos após anestesiar com sedativos triplo injecção intraperitoneal (IP). As amostras de sangue de rato foram coletadas de veia cava interior (IVC). Os soros foram separados por centrifugação a 1500 rpm durante 10 minutos a 4 ° C. Para a coleta de fluido de lavagem broncoalveolar (LBA), a traqueia foi isolada e canulada com um adaptador luer stub calibre 20. Usando uma seringa de 1 cc, fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) foi recolhido por perfusão do pulmão com alíquota de 1 ml de cloreto de sódio a 0,9% e retirada de volta fluidos. fluidos BAL foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm e 4 ° C para remover os sedimentos celulares. concentrações CHI3L1 no rato e no soro humano (50-100 ul) foram determinadas por rato quitinase 3-like 1 Quantikine kit de ELISA e quitinase 3 humano do tipo 1 Quantikine kits ELISA de acordo com as instruções do fabricante (R D Systems, Minneapolis, MN) . As amostras de soro humano de objetos normais e pacientes com câncer de pulmão foram obtidos a partir da Facilidade bioamostra Repository Núcleo (BRCF) do Fox Chase Cancer Center, na Filadélfia (apoiado pelo NCI). As amostras de soro humano foram diluídas para 1:100 antes do ensaio.
Western Blot
Para a detecção da proteína de fusão Stat3C-Flag, CCSP-rtTA /(TetO)
7-CMV-Stat3 os ratinhos foram anestesiados bitransgenic e os pulmões foram removidos e homogeneizados em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA). Os lisados pulmonares (10 ug) foram fraccionados num Novex® 4-20% de Tris-Glicina Mini-Gel (Invitrogen, Carlsbad, CA). Após transferência para a membrana de difluoreto de polivinilideno (Bio-Rad, Hercules, CA), a membrana foi transferido com 5% de leite em pó desnatado PBS e hibridou-se com anticorpo de coelho anti-Flag (Sigma, St Louis, MO). A seguir à incubação com o anticorpo secundário, as proteínas foram detectadas com substrato quimioluminescente (SuperSignal, Rockford, IL). Para a detecção de proteína CHI3L1, BALFs de tratadas com doxiciclina ou não tratada ccsp-rtTA /(TetO)
7-CMV-STAT3 ratinhos bitransgenic foram recolhidas como descrito acima e diluiu-se com tampão de amostra de Laemmli (Bio-Rad, Hercules, CA) a 01:01, em seguida, aquecida em água a ferver durante 5 min. A electroforese em gel e de hibridização de anticorpo foram realizados seguindo o mesmo procedimento tal como acima, excepto que o anticorpo primário anti-ratinho de rato ChI3L1 (1:1,000, R D, Minneapolis, MN) e anti rato anticorpo secundário IgG de cabra (1:3000, Vector Laboratories, Burlingame, CA) foram usadas. As bandas de proteína foram visualizadas com um kit Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) seguindo um procedimento recomendado pelo fabricante.
A imuno-histoquímica e imunofluorescência Coloração
Para coloração imuno-histoquímica, os pulmões de tratadas com doxiciclina ou não tratada CCSP-rtTA /(TetO)
7-CMV-Stat3, CCSP-rtTA /(TetO)
7-CMV-MMP12, CCSP-rtTA /(TetO)
7-CMV -Api6, c-fms-rtTA /(TetO)
7-CMV-Api6 e c-fms-rtTA /(TetO)
7-CMV-MMP12 ratos bitransgenic foram inflados com uma solução fixadora (paraformaldeído 4% , 1 x PBS), dissecados e armazenados em fixador a 4 ° C durante 24 horas como descrito anteriormente [8]. Após a fixação e inclusão em parafina, os tecidos foram seccionados a 5 mm de espessura. . Várias secções de cada pulmão foram bloqueados com leite desnatado (4% em 1 x PBS) durante 30 min, em seguida, incubadas com rato anti-ratinho CHI3L1 (1:100; R D Systems, Minneapolis, MN) a 4 ° C durante a noite . As secções de tecido foram lavadas e incubadas com IgG anti-rato de cabra biotinilado anticorpo secundário. Os sinais foram detectadas com um kit Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) seguindo um procedimento recomendado pelo fabricante
Para a coloração de imunof luorescência, as secções foram hibridizadas com rato anticorpo anti-ratinho ChI3L1 (R . D sistema) e anti-rato /80 (Abcam, Cambridge, MA) F4 anticorpo de coelho como anticorpo primário. A IgG de burro anti-rato conjugado com FITC (Santa Cruz, Dallas, Texas), e uma IgG de burro conjugado com Cy3 anti-coelho (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a uma diluição de 1/200 foram utilizados como anticorpos secundários. As secções foram co-coradas com DAPI. As lâminas foram examinadas sob um microscópio fluorescente Nikon.
Purificação de Recombinante CHI3L1 proteína de fusão
O murino full-length
Chi3l1
região codificadora foi amplificado por PCR e subclonado no pEGX 4T-1 vetor (ciências da vida GE, Pittsburgh, PA) nos locais das enzimas de restrição NotI /BamHI. proteína de fusão CHI3L1 foi expressa em BL21 de E. coli em 50 de indução mM IPTG e purificadas utilizando glutationa Sepharose 4 kit Fast Flow (ciências da vida GE), de acordo com as instruções do fabricante.
LLC Ensaio de Proliferação e ensaio de anexina V
células de carcinoma do pulmão de Lewis (LLC) (5 × 10
3 /poço) foram semeadas em placas de 96 poços da placa com meio de cultura (DMEM + FBS 10% + 1 × PSA, Invitrogen). proteína de fusão GST ou GST CHI3L1 (concentração final de 100 ng /ml) foi adicionada ao meio de cultura. Após 72 horas, o número de células de proliferação foram contadas. Para o ensaio de apoptose, as células LLC (2×10
5 /po) foram semeadas em placas de 6 poços da placa com meio de cultura (DMEM + FBS 10% + 1 × PSA, Invitrogen). proteína de fusão GST ou GST CHI3L1 (concentração final de 100 ng /ml) foi adicionada ao meio de cultura. Após 72 horas, a população celular por apoptose foi determinada por marcado com fluoresceína-isotiocianato-Anexina V (FITC-annexinV) (Apoptosis Detection Kit; BD PharMingen, Bedford, MA). células LLC tratados com GST ou a proteína de fusão GST-CHI3L1 foram colhidas e lavadas duas vezes com PBS. Após a ressuspensão das células em tampão de ligação de anexina V contendo Anexina V conjugada com FITC (diluição de 1:20) e incubação à temperatura ambiente durante 15 minutos, as células coradas foram analisadas por citometria de fluxo o mais rapidamente possível (dentro de 1 hora).
estatística
os dados foram valores médios de várias experiências independentes e expressos como a média ± DP. O método de ANOVA e teste de Tukey com base no nível de concentração de log-transformados foram usadas para avaliar a significância das diferenças. O log-transformação estabilizado variância e fez as suposições estatísticas sob o método de análise de variância e Tukey mais plausível. ROC (Receiver Operating Characteristic) análise da curva foi utilizada para avaliar a capacidade de diagnóstico de CHI3L1, que é quantificada pela área sob a curva ROC (AUC). A análise foi realizada utilizando o pacote Proc na linguagem R [9]. nível de significância estatística foi estabelecido em p 0,05. Intervalos de Confiança (IC) também foram construídos para todas as estimativas. Para a análise ROC AUC quando é 1, o IC de 95% tem tanto os limites superiores de uma mais baixa e, por causa da AUC = 1 corresponde a uma separação total de dois grupos por CHI3L1 e a construção CI baseia-se no procedimento de bootstrap.
resultados
Western Blot Análise de Expressão CHI3L1 no BALF de CCSP-rtTA /(TetO)
7-CMV-Stat3C Mice
Como já relatado anteriormente, CCSP-rtTA /( TetO)
7-CMV-Stat3C ratinhos é um modelo animal de tumor de pulmão espontâneas. Neste modelo, a proteína de fusão Stat3C-FLAG foi altamente indutível por tratamento doxiciclina (Figura 1A), que confirmaram a observação anterior por coloração imuno-histoquímica no pulmão [1]. Indução da Stat3C induzida genes a jusante (incluindo CHI3L1), inflamação pulmonar e adenocarcinoma [1], [6]. Para testar se CHI3L1 é uma proteína secretora neste modelo de ratinho, a análise Western blot foi realizada em LBA de ratinhos sub
7-CMV-Stat3C ccsp-rtTA /(TetO). Como mostrado na Figura 1, o nível de expressão da proteína CHI3L1 foi detectável no LBA de ratinhos doxiciclina não tratada (-DOX, pistas 1, 2, e 3) como uma banda a 39 kDa de peso molecular. Em comparação, o nível de expressão da proteína CHI3L1 foi aumentado em um de três ratinhos tratados com doxiciclina sem tumor (+ DOX, pista 5), indicando que a expressão CHI3L1 foi elevada antes da formação do tumor, e em todos tratados com doxiciclina quatro ccsp-rtTA /(TetO)
7-CMV-Stat3C ratos com tumor (câncer de pulmão, pistas 7, 8, 9 e 10).
a) a expressão de Stat3C-Flag em todo o pulmão do CCSP-rtTA /(tetO) 7-CMV-Stat3C ratos double-transgênicos. Actina foi utilizada como controlo. WT: selvagens pulmões tipo de mouse; -Dox: Doxiciclina não tratados bouble pulmões de camundongos transgênicos; + Dox1 + Dox2: doxiciclina tratada pulmões do rato. B) A expressão da proteína CHI3L1 no BALF de
7-CMV-Stat3C ratos double-transgênicos CCSP-rtTA /(TetO). Pista 1-3, ratinhos doxiciclina não tratada (Dox-); Pista 4-6, os ratinhos tratados com doxiciclina sem mostrando tumor do pulmão (Dox +); Pista 7-10, camundongos tratados com doxiciclina mostrando tumor de pulmão (cancro do pulmão). Concentração
Protein CHI3L1 no BALF e soro de CCSP-rtTA /(TetO)
7-CMV-Stat3C Mice
para uma análise mais quantitativa e previsão precisa, ELISA foi utilizado para determinar a concentração CHI3L1 no BALF de tipo selvagem, a doxiciclina não tratado, tratado sem tumor, e tratou-se com tumor ccsp-rtTA /(TetO)
7-CMV-Stat3C ratinhos. A concentração CHI3L1 média foi de 8,3 ± 6,4 ng /ml em ratinhos de tipo selvagem, 8,8 ± 10 ng /ml em ratinhos sub
7-CMV-Stat3C doxiciclina não tratado ccsp-rtTA /(TetO). Em comparação, a concentração CHI3L1 média foi aumentada mais de 11 vezes (100,0 ± 49,0 ng /ml, p 0,001) nos ratos tratados com doxiciclina sem tumor, apoiando ainda mais que a expressão CHI3L1 foi elevada antes da formação do tumor, e foi aumentada mais do que 17 vezes (151,8 ± 67,3 ng /ml, p 0,001) nos ratos tratados com doxiciclina com tumor (Figura 2, painel superior). As AUC das curvas ROC são (IC 95%: 1-1, p 0,001) 1 para discriminar os ratinhos tratados com doxiciclina com tumor vs. ratos doxiciclina-tratada, 1 (95% CI: 1-1, p 0,001) para ratinhos tratados com doxiciclina sem tumor versus ratinhos doxiciclina não tratado, e (IC 95%: 0,56-0,93, p = 0,1) 0,74. para ratinhos tratados com doxiciclina com tumor versus os ratinhos tratados com doxiciclina sem tumor
esquerda: CHI3L1 concentrações de proteínas no BALF e soro de ratos bitransgenic tratados com doxiciclina e não tratados. Direita: ROC (Receiver Operating Characteristic) curva de análises para determinar a área sob a curva (AUC). Dox-: ratinhos doxiciclina não tratado; Dox +: ratinhos tratados com doxiciclina sem mostrando tumor do pulmão; Cancro, os ratinhos tratados com doxiciclina com tumor do pulmão. Média ± SD no LBA (n 13), DOX -: 8,8 ± 10,0, DOX +: 100,0 ± 49,0, Câncer: 151,8 ± 67,3. Média ± SD no soro (n 13), DOX -: 6,2 ± 3,7, DOX +: 33,5 ± 35,6, Câncer: 159,0 ± 90,0. As linhas cinzentas representam os valores médios.
Nós testamos ainda mais a concentração CHI3L1 no sangue. Quando comparado com os ratos de doxiciclina não tratada (6,2 ± 3,7 ng /ml), a concentração CHI3L1 média foi aumentada mais do que 5 vezes (33,5 ± 35,6 ng /ml, p 0,001) nos ratos tratados com doxiciclina sem tumor formação tumoral antes ( ), e foi aumentada mais de 26 vezes (159,0 ± 90,0 ng /ml, p 0,001) nos ratos tratados com doxiciclina com tumor (Figura 2, painel inferior). As AUC das curvas ROC são 0,95 (95% CI: 0,87-1, p 0,001) para discriminar os ratinhos tratados com doxiciclina com tumor vs. doxiciclina-tratada sem ratos tumorais, IC 1 (95%: 1-1, p CI 0,001) para ratinhos tratados com doxiciclina com tumor versus ratinhos doxiciclina não tratado, e 0,89 (95%: 0,77-1, p 0,001) para ratinhos tratados com doxiciclina sem tumor versus ratinhos doxiciclina não tratado. Este resultado demonstra claramente que o aumento da concentração de proteína no BALF CHI3L1 sangue e está associada com a inflamação induzida por Stat3C e tumor do pulmão. Parece que o aumento de proteína CHI3L1 ocorrido antes da formação do tumor de pulmão espontânea no CCSP-rtTA /(TetO)
7-CMV-Stat3C modelo do rato, portanto, potencialmente serve como biomarcadores.
CHI3L1 concentração de proteína no BALF e soro de-inflamação induzida Regional modelos animais de tumores pulmonares
Para testar se a proteína CHI3L1 secretora é regulado para cima em uma aplicação mais ampla, outros modelos de mouse tumor de pulmão espontânea induzida por inflamação foram testados. Metaloproteinase 12 (MMP12) é uma metaloproteinase matriz induzida por fumar. A sobre-expressão de MMP12 em pneumócitos tipo II pulmão células epiteliais induzidos local de inflamação, enfisema pulmonar e tumores [3]. No ccsp-rtTA /(TetO)
7-CMV-MMP12 pulmão espontânea modelo de ratinho de tumor, a concentração CHI3L1 médio em LBA de ratinhos tratados com doxiciclina com tumor foi 3 vezes mais elevada (159,7 ± 22,4 ng /ml) comparativamente com isso em LBA de ratinhos doxiciclina não tratada (49,6 ± 22,8 ng /ml, p 0,001, Figura 3A, painel superior esquerdo). Não houve diferença significativa entre murganhos tratados com doxiciclina sem tumor (49,4 ± 18,1 ng /ml, p = 0,954) e ratos doxiciclina não tratado. Um resultado semelhante foi observado no soro de ratos induzida por MMP12 tumorais (Figura 3A, painel inferior esquerdo). análise ROC indicado capacidade impressionante de concentração CHI3L1 na discriminação do grupo tumor com o grupo de não tumor, e o grupo de doxiciclina não tratado. As AUCs são 1 (IC 95%: 1-1, p 0,001) no grupo tratado com doxiciclina com tumor vs. grupo tratado sem tumor e no grupo tratado com doxiciclina com tumor versus grupo não tratado de doxiciclina, e 0,52 (95% CI: 0,29-0,75, p = 0,46) no grupo tratado com doxiciclina sem tumor versus grupo não tratado dxycycline-(Figura 3A, painel superior direito). Um resultado semelhante foi observada no soro de CCSP-rtTA /(TetO)
7-CMV-MMP12 tumor pulmonar espontânea modelo de rato (Figura 3A, painel inferior direito)
À esquerda:. Concentrações de proteína CHI3L1 em LBA e soro de ratos bitransgenic tratados com doxiciclina e não tratados. Direita: ROC (Receiver Operating Characteristic) curva de análises para determinar a área sob a curva (AUC). Dox-: ratinhos doxiciclina não tratado; Dox +: ratinhos tratados com doxiciclina sem mostrando tumor do pulmão; Cancro, os ratinhos tratados com doxiciclina com tumor do pulmão. A) CCSP-rtTA /(TetO)
camundongos 7-CMV-MMP12. Média ± SD no LBA (n 7), DOX -: 49,6 ± 22,8, DOX +: 49,4 ± 18,1, Câncer: 159,7 ± 22,4. Média ± SD no soro (n 7), DOX -: 18,6 ± 10,9, DOX +: 18,2 ± 4,6, Câncer: 61,4 ± 33,5. As linhas cinzentas representam os valores médios; B) CCSP-rtTA /(TetO)
camundongos 7-CMV-Api6. Média ± SD no LBA (n 3), DOX -: 82,4 ± 37,1, DOX +: 93,8 ± 23,0, Câncer: 409,8 ± 49,2. Média ± SD no soro (n 3), DOX -: 14,0 ± 7,2, DOX +: 30,7 ± 43,1, Câncer: 295,2 ± 194,0. As linhas cinzentas representam os valores médios.
A apoptose inibidor 6 (Api6) é outra molécula pró-inflamatória que induz inflamação e pulmão tumor quando sobre-expresso no tipo alveolar pulmonar II células epiteliais [5]. No modelo
7-CMV-Api6 espontânea de tumores do pulmão de rato, a concentração CHI3L1 médio em LBA de ratinhos tratados com doxiciclina com tumor foi 409,8 ± 49,2 ng /ml, em comparação com o que, no BALF de ccsp-rtTA /(TetO) doxiciclina não tratado ratinhos (82,4 ± 37,1 ng /ml, p 0,001, Figura 3B, painel superior esquerdo). Da mesma forma, não houve diferença significativa entre murganhos tratados com doxiciclina sem tumor (93,8 ± 23,9 ng /ml, p = 0,364) e ratos doxiciclina não tratado. Um resultado semelhante também foi observada no soro de ratinhos tumorais induzidas Api6 (Figura 3B, painel inferior esquerdo). As AUC a partir da análise ROC são 1 (IC 95%: 1-1, p 0,001) no grupo tratado com doxiciclina com tumor vs. grupo tratado com doxiciclina e sem tumor no grupo tratado com doxiciclina com tumor versus grupo não tratado doxiciclina e 0,68 (IC de 95%: 0,45-0,90, p = 0,22) no grupo tratado com doxiciclina sem tumor versus grupo de doxiciclina não tratada (Figura 3B, painel superior direito). Resultado semelhante também foi observada no soro de CCSP-rtTA /(TetO)
7-CMV-Api6 modelo espontânea tumor de pulmão de rato, Figura 3B, painel inferior direito).
Concentração
Protein CHI3L1 no BALF e soro de sistémicos induzida por inflamação modelos animais de tumores pulmonares
em contraste com modelos animais inflamatórias pulmonares regionais, quando MMP12 ou Api6 foi sobre-expressos em células mielóides, inflamação sistêmica é iniciada a partir malformação e mau funcionamento do mielopoiese do medula óssea. formação de tumor de pulmão foi observada em ambos os modelos de rato bitransgenic Api6 MMP12 e [2], [4]. Isto representa um mecanismo celular diferente para a formação de cancro do pulmão. No modelo de rato
7-CMV-MMP12 espontânea de tumores do pulmão, a concentração média CHI3L1 em LBA de ratinhos tratados com doxiciclina com tumor de c-fms-rtTA /(TetO) (70,9 ± 36,5 ng /ml) foi de 4 vezes aumentar em comparação com o que em LBA de ratinhos doxiciclina não tratado (17,7 ± 13,8 ng /ml, p = 0,027, Figura 4A, painel superior esquerdo). ratinhos tratados com doxiciclina sem tumor (42,1 ± 67,9 ng /ml, p = 0,043, Figura 4 A) mostraram também o aumento da concentração CHI3L1 em comparação com ratinhos de doxiciclina não tratado. Um resultado semelhante foi observado no soro de c-fms-rtTA /(tetO) modelo
7-CMV-MMP12 espontânea de tumores do pulmão do rato com tumor (Figura 4, painel inferior esquerdo), em que a concentração CHI3L1 média foi mais de 6 vezes mais elevados em ratinhos do tumor do que a de ratinhos de controlo não tratado doxiciclina. As AUC a partir da análise ROC foram 0,82 (IC de 95%, 0,62-1, p = 0,05) no grupo tratado com doxiciclina com tumor vs. grupo tratado com doxiciclina sem tumor, 0,94 (IC de 95%, 0,82-1, p 0,001 ) no grupo tratado com doxiciclina com tumor versus grupo não tratado de doxiciclina, e 0,45 (95% CI, 0,17-0,73, p = 0,57) no grupo tratado com doxiciclina sem tumor versus grupo de doxiciclina não tratada (Figura 4A, painel superior direito ). Resultados similares foram observados para amostras de soro de c-fms-rtTA /(tetO)
7-CMV-MMP12 espontânea mouse modelo de tumor de pulmão (Figura 4A, painel inferior direito)
À esquerda:. concentrações de proteína CHI3L1 no LBA e no soro dos camundongos bitransgenic tratados com doxiciclina e não tratados. Direita: ROC (Receiver Operating Characteristic) curva de análises para determinar a área sob a curva (AUC). Dox-: ratinhos doxiciclina não tratado; Dox +: ratinhos tratados com doxiciclina sem mostrando tumor do pulmão; Cancro, os ratinhos tratados com doxiciclina com tumor do pulmão. A) c-fms rtTA /(TetO)
camundongos 7-CMV-MMP12. Média ± SD no LBA (n 7), DOX -: 17,7 ± 13,8, DOX +: 42,1 ± 67,9, Câncer: 70,9 ± 36,5. Média ± SD no soro (n 7), DOX -: 39,1 ± 25,6, DOX +: 57,7 ± 55,5, Câncer: 232,3 ± 110,6. As linhas cinzentas representam os valores médios; B) c-fms rtTA /(TetO)
camundongos 7-CMV-Api6. Média ± SD no LBA (n 6), DOX -: 69,6 ± 16,6, DOX +: 73,2 ± 28,1, Câncer: 189,9 ± 47,2. Média ± DP no soro (n 6), DOX -: 25,2 ± 7,3, + DOX: 21,0 ± 11,7, Câncer: 69,5 ± 19,1. As linhas cinzentas representam os valores médios.
No /(TetO)
7-CMV-Api6 pulmonar espontânea modelo c-fms-rtTA rato tumor, a concentração média CHI3L1 no BALF de doxiciclina ratinhos com o tumor tenha sido tratada com (189,6 ± 47,2 ng /ml) foi ~ 3 vezes mais elevada do que no LBA de ratinhos doxiciclina não tratado (69,6 ± 16,6 pg /ml, p = 0,002, Figura 4B, painel superior esquerdo). Da mesma forma, não houve diferença significativa entre murganhos tratados com doxiciclina sem tumor (73,2 ± 28,1 ng /ml, p 0,001) e ratos doxiciclina não tratado. Um resultado semelhante também foi observada no soro de ratinhos tumorais induzidas Api6 (Figura 4B, painel inferior esquerdo), em que a concentração CHI3L1 média foi de 3 vezes mais elevado em tumor do que os ratinhos que de ratinhos de controlo não tratado doxiciclina. As AUC a partir da análise ROC são 1 em grupo tratado com doxiciclina com tumor vs. grupo tratado com doxiciclina sem tumor, 1 em grupo tratado com doxiciclina com tumor versus grupo não tratado de doxiciclina, e o IC de 0,6 (95%, 0,34-0,86, P = 0,35) no grupo tratado com doxiciclina sem tumor versus grupo não tratado (Figura 4B, painel superior direito). Resultados similares foram observados para amostras de soro de c-fms-rtTA /(TetO)
7-CMV-Api6 espontânea mouse modelo de tumor de pulmão (Figura 4B, painel inferior direito).
Lung Imuno
é importante localizar onde CHI3L1 é expresso no pulmão do rato acima modelos de tumor de pulmão espontâneas. secções de tecido pulmonar de ratos doxiciclina não tratado, sem tenha sido tratada com tumor, e tenha sido tratada com ratos com tumor foram imuno-histoquimicamente coradas com anticorpo anti-CHI3L1. Em doxiciclina não tratado ccsp-rtTA /(TetO)
7-CMV-Stat3C ratinhos, CHI3L1 foi expressa, principalmente, em células epiteliais ao longo das vias aéreas de condução (Figura 5 A a), células epiteliais bronquiais distais (Figura 5A b), e II células epiteliais alveolares tipo (Figura 5 A c) (setas vermelhas). CHI3L1 também foi expresso em macrófagos alveolares. Em tratadas com doxiciclina ccsp-rtTA /(TetO) ratinhos
7-CMV-Stat3C quando a inflamação foi induzida, mas sem o aparecimento de tumores, algumas áreas mostrou remodelação do tecido (Figura 5A e) e enfisema (Figura 5A F). Quase todos os macrófagos infiltrados foram coradas positivamente com CHI3L1 (Figura 5A e, seta verde). Na sub
ratinhos 7-CMV-Stat3C com aparência de tumor tratados com doxiciclina ccsp-rtTA /(TetO), CHI3L1 expressão foi detectada em células tumorais e macrófagos circundantes (Figura 5A G, H, I). A co-localização de CHI3L1 em macrófagos alveolares foi ainda confirmada no pulmão de ratinhos tratados com doxiciclina bitransgenic com anti-CHI3L1 e anti-F4 /80 em anticorpos de coloração imunofluorescente. Um resultado representativo do CCSP-rtTA /(TetO)
7-CMV-Stat3C ratos foi apresentado na Figura 6.
A) coloração imuno-histoquímica nos pulmões dos tratados com doxiciclina ou não tratada CCSP-rtTA /( TetO)
7 sub-CMV-Stat3C ratinhos; B) Coloração imuno-histoquímica de regiões de tumores nos pulmões de
7 CMV-MMP12-rato, c-fms-rtTA /(TetO) ratinhos
7-CMV-MMP12 tratados com doxiciclina ccsp-rtTA /(TetO), e c-fms rtTA /(TetO)
camundongos 7-CMV-Api6. -Dox: Ratinhos doxiciclina não tratado; + Dox:. Camundongos tratados com doxiciclina
CCSP-rtTA /(TetO) ratos bitransgenic
7-CMV-Stat3C foram tratados (+ DOX) ou não tratada (-DOX) com doxiciclina. coloração de imunofluorescência de secções de pulmão foi realizada utilizando anti-CHI3L1 e F4 80 anticorpos /. A co-localização de ambas se observou coloração na imagem resultante da fusão. Barra representa 20 um.
Estas observações foram em grande parte repetível noutros MMP12 e mouse modelos de tumor de pulmão espontânea induzidas Api6. Independentemente do tumor do pulmão iniciada a partir de células alveolares tipo II ou células mielóides, CHI3L1 foi sobre-expresso em células tumorais de MMP12 e estes modelos de ratinho de tumor de pulmão espontâneas-induzidas Api6. Os macrófagos circundantes enfisema (Figura 5B C, G, K) e células de tumor (Figura 5B b, E, F, I) também foram intensamente coradas pelo anticorpo anti-CHI3L1 (seta verde). Isto pode explicar porque a concentração CHI3L1 foi maior em ambos LBA e do sangue de camundongos tumorais.
CHI3L1 Estimulação em células de câncer
Para testar se CHI3L1 possui o efeito estimulador sobre as células de câncer de pulmão, CHI3L1 recombinante proteína de fusão GST e GST proteína foram preparados e purificados a partir de bactérias (Figura 7A). proteína da proteína de fusão GST ou CHI3L1-GST recombinante de controlo foi incubada com células LLC. proteína de fusão GST-CHI3L1 estimulou significativamente a proliferação de células de cancro em comparação com a da proteína de controlo de GST (figura 7B). A actividade apoptótica de proteínas tratadas células LLC CHI3L1 de fusão com GST foi reduzida em comparação com a da proteína de controlo de GST (Figura 7C). Isto suporta um conceito que CHI3L1 estimula a proliferação e crescimento do câncer de pulmão
A) Pureza da proteína de fusão CHI3L1-Flag recombinante (seta para cima).; B) proliferação de células LLC tratados com GST ou a proteína de fusão GST-CHI3L1; C) A actividade apoptótica de células LLC tratados com GST ou a proteína de fusão GST-CHI3L1 por ensaio de Anexina V rotulagem. *, P 0,05, **, P . 0,01
concentração de proteína CHI3L1 no soro de cancro do pulmão humano
Uma vez que a concentração de proteína CHI3L1 correlaciona muito bem com a ocorrência de tumores em ambos inflamação regional e modelos de ratinho de tumor de pulmão espontâneas iniciou-inflamação sistémica, é intrigante para determinar se esta observação pode ser repetida em humanos. Cerca de 30 amostras de soro de pacientes humanos de adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão e cancro de pequenas células do pulmão foram testados por ELISA. Em comparação com amostras de soro humano sem qualquer tipo de cancro (normal), a concentração de proteína foi CHI3L1 significativamente elevados em amostras de soro humano a partir de todas as categorias de doentes com cancro do pulmão (Figura 8, painel superior). As AUC são 0,83 (95% de intervalo de confiança, ,69-,92, P = 0,005) para o adenocarcinoma vs. Controle, 0,87 (95% de intervalo de confiança, 0,77-0,97, P 0,001) para o carcinoma espinocelular vs. controle, e 0,81 (95 intervalo% de confiança, 0,72-0,94, P = 0,001) para o carcinoma de pequenas células vs controle (Figura 8, painel inferior)
Top:. concentrações de proteína CHI3L1 no soro humano. Parte inferior: ROC análise da curva (Receiver Operating Characteristic) para determinar a área sob a curva (AUC). Média ± SD no controle (n 30): 17,3 ± 7,8. Média ± SD no adenocarcinoma (n 30): 66,9 ± 64,8. Média DP ± no carcinoma espinocelular (n 30): 69,3 ± 69,0. Média DP ± no câncer de pequenas células (n 30): 56,3 ± 58,8. As linhas cinzentas representam os valores médios. Controle:. Humano normal sem câncer
Discussão
CHI3L1 foi identificado pela primeira vez como um gene a jusante da Stat3 no CCSP-rtTA /(tetO) do mouse tumor
7Stat3C pulmonar espontânea modelo por Affymetrix GeneChip microarray [1].