Sumário

Hospedar peptídeos imunes, incluindo cathelicidins, têm sido relatados por possuir propriedades anticâncer. Nós relatado anteriormente que LL-37, a única cathelicidin em humanos, suprime o desenvolvimento de câncer de cólon. Neste estudo, o efeito anti-cancro potencial de FK-16, um fragmento de LL-37 correspondente aos resíduos 17 a 32, em células de cancro do cólon em cultura foi avaliada. FK-16 induziu um padrão único de morte celular, caracterizado por activação simultânea de apoptose independente de caspase e autofagia. O primeiro foi mediado pela translocação nuclear de AIF e EndoG enquanto o segundo foi caracterizada pela expressão aumentada de LC3-I /II, Atg5 e Atg7 e aumento da formação de autofagossomas LC3-positiva. Knockdown de Atg5 ou Atg7 atenuou a citotoxicidade de FK-16, indicando autofagia induzida por FK-16 foi pró-morte na natureza. Mecanisticamente, o FK-16 p53 nuclear activado para regular positivamente Bax e Bcl-2 regular negativamente. Knockdown de p53, a ablação genética de Bax, ou a sobre-expressão de Bcl-2 reverteu a apoptose induzida por FK-16 e autofagia. Importante, abolição da AIF /EndoG-dependente apoptose reforçada autofagia FK-16 induzida por enquanto abolição da autofagia aumentada FK-16 induzida por apoptose AIF- /EndoG-dependente. Colectivamente, FK-16 induz a apoptose independente de caspase e autofagia através do comum p53-Bcl-2 /Bax cascata em células de câncer de cólon. Nosso estudo também descobriu regulação recíproca previamente desconhecida entre estas duas vias de morte celular

Citation:. Ren SX, Shen J, Cheng ASL, Lu L, Chan RLY, Li ZJ, et al. (2013) FK-16 Derivado do Anticancer Peptide LL-37 induz Caspase-Independent apoptose e autofágica morte das células do cancro do cólon. PLoS ONE 8 (5): e63641. doi: 10.1371 /journal.pone.0063641

editor: Daotai Nie, Faculdade de Medicina da Universidade de Southern Illinois, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de novembro de 2012; Aceito: 04 de abril de 2013; Publicado em: 20 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ren et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

peptídeos antimicrobianos (AMPs), também conhecido como host. péptidos de defesa, existem em células eucarióticas como um componente conservada do sistema imune inato. PAMs realizar defesa de primeira linha contra a infecção por agindo como antibióticos “naturais” por morte directa de micróbios patogénicos [1], [2]. A selectividade dos PAMs para células bacterianas depende de as suas estruturas catiónicos que são cruciais para a interacção com as membranas bacterianas carregadas negativamente [3], [4]. Emergindo evidência sugere que os AMP podem também ligar-se selectivamente a células de cancro em relação às células não transformadas por causa da exposição de superfície aumentada de fosfatidilserina carregado negativamente no cancro [5]. Aumento dos níveis de mucinas O-glicosilada, potencial de membrana negativo, e o aumento da fluidez da membrana e a área de superfície celular em células cancerosas podem também contribuir para esta selectividade [6]. Numerosos Amps de humano (por exemplo, β-definsin, LL-37) e não-humano (por exemplo, BMAP-28, lactoferricina B, Magainina II, melitina, taquiplesina I) origens têm sido demonstrados para exercer citotoxicidade em células cancerosas através de diversos mecanismos de [6 ]. Por exemplo, lactoferricina B bovina induzida via mitocondrial de apoptose em linhas celulares de carcinoma de leucemia e humanos, mas não células não transformadas através da geração de espécies reactivas de oxigénio [7]. Magainina II também induziu a morte celular em células cancerosas da bexiga, mas não fibroblastos normais por meio de formação de poros na membrana celular e subsequente lise celular [8]. Humana β-definsin-1, que exibiu perda específica do cancro de expressão em carcinoma de células renais claras, induzida apoptose caspase-3 mediada por na linha celular de cancro renal SW156 [9]. De acordo com a base de dados de AMP (https://aps.unmc.edu/AP/main.php), mais de 130 de tais peptídeos são conhecidos por terem propriedades anticancerígenas [10].

Catelicidinas são uma família de evolutivamente conservada amperes. PACS-18 é a única catelicidina em seres humanos. Este preproproteína 18 kDa consiste em uma sequência de sinal N-terminal, um domínio semelhante a catelina, e um domínio C-terminal de AMP. clivagem proteolítica do PACS-18 lançamentos a 37-resíduo, anfipática, peptídeos helicoidal conhecido como LL-37. Este peptídeo é segregado pelas células da medula óssea, leucócitos circulantes, e numerosos tipos de tecidos epiteliais, tais como a pele e da mucosa gastrointestinal. LL-37 não só exibe um espectro de actividades antimicrobianas placa (por exemplo, bactérias, fungos e vírus), mas também tem a capacidade de neutralizar os lipopolissacáridos bacterianos. Importante, LL-37 poderia mediar a imunidade inata através da regulação da quimiotaxia de leucócitos (por exemplo, neutrófilos, monócitos, células T, eosinófilos e mastócitos) e produção de citocinas em locais de infecção e inflamação, bem como promover a re-epitelização durante a cicatrização de feridas [ ,,,0],11], [12], [13], [14]. evidência cumulativa a partir de estudos de biologia do tumor indica que LL-37 desempenha um papel proeminente na carcinogênese [15]. Por exemplo, LL-37 exerce efeitos anticancerígenos em câncer gástrico e T células leucêmicas [16], [17]. O fragmento C-terminal de LL-37 também exibe citotoxicidade para com ambas as células de carcinoma epitelóide orais sensíveis a fármacos e resistentes aos medicamentos [18]. O nosso estudo anterior, também mostrou que a expressão de LL-37 foi regulada negativamente notavelmente em tecidos de cancro do cólon humano, enquanto que LL-37 induziu a morte celular apoptótica exógeno em células de cancro do cólon em cultura. Importante, ratinhos deficientes em catelicidina apresentaram maior susceptibilidade ao azoximetano induzida por carcinogénese do cólon [19]. Estes achados sugerem que LL-37 é um peptídeo-supressora de tumor endógeno.

Dada a sua importância em imunologia e pesquisa do câncer, os esforços têm sido formuladas para estudar as propriedades estruturais e biofísicos de LL-37. Lua

et ai.

Descrita pela primeira vez a utilização do sistema de fusão da glutationa-S-transferase para a expressão e purificação de LL-37 marcada com isótopo em

Escherichia bobina

[20]. A análise estrutural por espectroscopia de RMN demonstrou que LL-37 é caracterizada por um longo anfipático em hélice que abrange os resíduos 2-31 com toda a molécula curvos um trem de cadeias laterais hidrofóbicas [21]. Ramamoorthy

et ai.

Mostrou que LL-37 orienta perto da superfície de bicamadas de fosfolípidos e forma estruturas oligoméricas [22]. Para este fim, LL-37 possui a capacidade de perturbar a membrana celular [23], [24], [25].

O custo relacionado com a síntese química é um dos factores limitadores que impedem o uso de péptidos como agentes terapêuticos. Por conseguinte, é importante identificar a região funcional de LL-37 de modo a que os fragmentos mais curtos que retêm a actividade biológica do péptido de comprimento completo pode ser produzido com um custo mais baixo. Anterior análise de estrutura-função de diferentes fragmentos de LL-37 tem demonstrado que LL7-27, um péptido de 21 resíduos derivado de resíduos 7-27 de LL-37, exibe uma potente actividade contra micróbios (particularmente bactérias gram-positivas) através da ruptura do estrutura de bicamada lipídica [26]. Um outro estudo mostrou que o fragmento N-terminal de LL-12, correspondendo aos resíduos 1-12 de LL-37 é inactivo contra bactérias ou células cancerígenas, enquanto que o FK-16 correspondentes aos resíduos 17-32 retém antibacterianos e antitumorais efeitos [27]. Este fragmento tem mesmo uma melhor actividade contra procariotas e células nucleadas do que o péptido de comprimento total [28], sugerindo que a FK-16 pode ser um candidato promissor para posterior caracterização como um péptido anti-cancro romance. No presente estudo, o

in vitro

efeito anticancerígeno de FK-16 foi investigada.

Resultados

FK-16 versus LL-37 na indução de morte celular em as células do cancro do cólon

os citotoxicidades de FK-16 e do full-length LL-37 foram inicialmente investigados em duas linhas celulares de cancro de cólon humano (LoVo e HCT116) por ensaio MTT. Como mostrado na Fig. 1A, tanto FK-16 e MI-37 reduziu significativamente a viabilidade das células LoVo e HCT116 de uma forma dependente da dose. Visivelmente, FK-16 apresentou uma actividade melhor contra células cancerígenas do cólon do que LL-37. Além disso, o FK-16 teve um efeito mínimo sobre a viabilidade das células da mucosa de cólon normal NCM460 epiteliais humanas. Um péptido de controlo com a sequência mexidos de FK-16 também teve efeitos desprezáveis ​​sobre LoVo e HCT116, indicando FK-16 mediada morte selectiva de células cancerosas. Como HCT116 foi mais sensível do que LoVo a FK-16, HCT116 foi seleccionada para estudo posterior mecanicista e tratados com 20 pM ou 40 pM FK-16, em que ~ 20% e ~ 50% de citotoxicidade ocorreu.

(A) Efeitos de LL-37, FK-16, e mexidos FK-16 (48 h) na viabilidade de células cancerígenas do cólon (HCT116, LoVo) foram determinados pelo ensaio de MTT. O efeito citotóxico do FK-16 também foi testado em células da mucosa de cólon normal NCM460 epiteliais humanas. (B) externalização Phosphotidylserine em células HCT116 tratados com ou sem o FK-16 foi determinada por citometria de fluxo de células marcadas com v /anexina PI. (C) Efeitos de FK-16 sobre a clivagem de PARP e a activação da caspase em células HCT116 foram determinados por Western blot. A cisplatina foi utilizada como um controlo positivo para a activação de caspase. (D) Células Pré-tratamento com a HCT116 pan-caspase inibidor z-VAD-fmk, durante 1 h não evitou a perda de viabilidade celular FK-16-induzido, conforme determinado pelo ensaio de MTT (24 h). (E) expressão nuclear de AIF e EndoG em células HCT116 foram analisados ​​por análise de Western blot de proteínas fraccionadas. GAPDH e Lamin A /C foram usados ​​como controles internos para citosólica (Cy) e as proteínas nucleares (Nu), respectivamente. (F) Efeitos da FK-16 (6 h) na localização subcelular de FIA ​​(verde) e EndoG (vermelho) em HCT116 foram determinados por imunofluorescência confocal (400 ×). (G) Knockdown de FIA ​​e EndoG parcialmente revertida externalização phosphotidylserine induzida por FK-16 (40? M; 24 h) em HCT116. As células foram desafiadas com FK-16 às 48 h pós-transfecção de AIF- e EndoG-siRNAs. Os dados foram apresentados como a média ± DP de três experiências separadas. *,

p Art 0,05; **,

p

. 0,01, significativamente diferente do respectivo grupo controle

indução de apoptose AIF /EndoG dependente de FK-16

têm mostrado previamente que LL-37 pode induzir apoptose independente de caspase em células de cancro do cólon [19]. Para determinar se a apoptose mediada por a citotoxicidade de FK-16, a perda de assimetria de fosfatidilserina, o que é uma característica da apoptose, foi quantificada por citometria de iodeto de propídio anexina V células /duplo coradas. Como mostrado na Fig. 1B, o FK-16 induzida por externalização de fosfatidilserina, sem o aumento da proporção de iodeto de propídio

+ células, indicando que o FK-16 apoptose, mas não a morte celular necrótica induzida. Em ambas as 24 e 48 horas pontos temporais, FK-16 tratamento não aumentou clivagem PARP nem ativar caspases-3 e 7 (Fig. 1C). Concordantemente, o inibidor da pan-caspase z-VAD-fmk não conseguiu reverter a perda de viabilidade celular causada por FK-16 (Fig. 1D). Estes resultados sugeriram que a FK-16 induziu apoptose de um modo independente de caspases. FIA e EndoG, inicialmente localizada nas mitocôndrias e translocado para o núcleo após a activação, são conhecidos mediadores de apoptose independente de caspase [29]. Immunoblotting utilizando lisados ​​de proteínas fraccionadas demonstraram que a FK-16 aumentou os níveis de FIA ​​nucleares e EndoG (Fig. 1E). Imunofluorescência confirmou que a FIA e EndoG redistribuída a partir do citosol para o núcleo em células HCT116 tratados com FK-16 (Fig. 1F). O envolvimento funcional da FIA e EndoG na apoptose induzida por FK-16 foi ainda verificada por meio de experimentos de interferência de RNA, em que knockdown da FIA ou EndoG atenuada externalização de fosfatidilserina induzida por FK-16 (Fig. 1G). Estes resultados indicaram que, semelhante a LL-37, FK-16 apoptose induzida por AIF /EndoG-dependente, mas independente de caspase em células de câncer de cólon.

A indução de autofagia celular Morte por FK-16, mas não LL-37

para determinar o efeito de FK-16 na outra via de morte celular independente de caspases, ou seja, morte celular autophagic [30], analisou-se a expressão da proteína LC3 (particularmente LC3-II, que se sabe correlacionar com a extensão da autofagia) e duas outras proteínas relacionadas com a autofagia, ou seja Atg5 e Atg7. Os resultados demonstraram que a FK-16 aumentou LC3-I e LC3-II, bem como a expressão da proteína e Atg5 Atg7 (Fig 2A . 2B). FK-16 também induziu a formação de LC3

+ vacúolos autofágicos em HCT116 (Fig. 2C). Tanto a indução da expressão LC3-I /II e a formação de LC3

+ vacúolos autofágicos de FK-16 pode ser bloqueada por 3-metiladenina, um inibidor da Classe III fosfoinositida 3-quinase. Em contraste, o péptido de LL-37 de comprimento completo teve um efeito mínimo no LC3-I expressão /II (dados não mostrados). A análise ultra-estrutural por microscopia electrónica revelou que um 48-h de exposição a FK-16 vacuolização massiva induzida em células HCT116, em que foram observadas estruturas lamelares e de mielina como assemelhando-vacúolos autofágicos final (Fig. 2D). Formação de organelos vesiculares ácidas, o que é uma característica importante de autofagia, também foi melhorada por FK-16, como determinado por coloração vital de células HCT116 com laranja de acridina, um corante que emite fluorescência vermelha brilhante em vesículas ácidas mas fluorescência verde no citoplasma e núcleo (Fig. 2E). A formação de autolysosomes também foi aumentada em células tratadas com FK-16 como visualizado por coloração monodansylcadaverine (dados não mostrados). O aumento no fluxo autophagic causada por FK-16 foi confirmado por tratamento de células HCT116 com FK-16 e bafilomicina

1 (um agente de lysosomotropic), isoladamente ou em combinação. A inibição da função lisossómica pela bafilomicina

1 aumentou os níveis de ambos LC3-I e -II induzida por FK-16 (Fig. 2F), sugerindo que a FK-16 aumentou o fluxo de autophagic. Dependendo do contexto celular, autofagia pode servir como uma pro-morte ou mecanismo de pró-sobrevivência. Para determinar o papel funcional de autofagia induzida por FK-16, uma abordagem interferência de RNA foi usada para suprimir a autofagia por segmentação Atg5 e Atg7, ambos os quais são necessários para a formação de autofagossomas na fase inicial. Knockdown de Atg5 ou Atg7 reduziu significativamente o efeito citotóxico do FK-16 (Fig. 2G), sugerindo que a FK-16 da morte celular induzida autophagic em células cancerígenas do cólon.

(A) As células HCT116 exibiram expressão aumentada de proteínas de LC3-I /II, após o tratamento com FK-16 durante 24 h e 48 h. LC3 expressão induzida por FK-16 foi suprimido pelo inibidor autofagia 3-MA (5 mM, 1 h pré-tratamento). (B) o FK-16 também induziu a expressão da proteína e Atg5 Atg7. (C) tratar HCT116 com FK-16 durante 24 h ou 48 h proeminentemente aumentada a formação de vacúolos autofágicos como determinado por coloração de imunofluorescência para a LC3 (400 ×). A formação de LC3

+ autofagossomas induzidas pelo FK-16 foi bloqueada por 3-MA. Análise (D) ultra-estrutural por microscopia electrónica revelou a formação de autophagosome ou lisossomas secundários com o material digerido residual em células HCT116-tratados FK-16 (40? M; 48 h). (E) A acumulação de organelos vesiculares ácidas, que emitiu fluorescência vermelha brilhante, induzida por FK-16 (40 uM) foi visualizado por coloração com alaranjado de acridina (400 ×). (F) fluxo autofágica O aumento foi confirmado pelas células HCT116 co-tratamento com FK-16 e bafilomicina A

1. O tratamento com bafilomicina

1 (10 nmol /L) não impedem a sobre-regulação de LC3-I /II em células incubadas com o FK-16 (40 uM). (L) Queda de Atg5 ou Atg7 atenuou o efeito citotóxico de 48 h de tratamento de FK-16 (40 pM) em HCT116. Os dados são apresentados como médias ± S.D. de três experiências separadas. *,

p Art 0,05; **,

P

0,01 significativamente diferente do respectivo grupo de controlo.

†,

p Art 0,05;

††,

p

. 0,01 significativamente diferente do controle de células transfectadas com siRNA tratados com FK-16

Exigência de p53 para a apoptose induzida por FK-16 e autofágica Cell Death

O p53 proteína supressora de tumor é conhecido por participar tanto dependente de caspase e morte celular independente de, incluindo AIF /Endo-dependente apoptose e autofagia [31], [32]. Aqui, demonstramos que a FK-16 p53 activadas directamente para mediar ambas as vias de morte celular. Como mostrado na Fig. 3A, o FK-16 aumentou o nível nuclear de p53 e regulada positivamente a expressão de PUMA e Bax. Consistentemente, FK-16 reduziu a expressão de Bcl-2. Para elucidar o envolvimento funcional do p53 em AIF /Endo-dependente apoptose e morte celular autofágica desencadeada por FK-16, p53 foi derrubado por siRNA. Knockdown de p53 não só restabeleceu a expressão do Bax e Bcl-2, mas também notavelmente reduzida FK-16 induzida por LC3-I /II, expressão Atg5 e Atg7 bem como a expressão nuclear de AIF e EndoG, sugerindo que o p53 foi um comum activador de ambas as vias de morte celular (Fig. 3B). Por conseguinte, knockdown de p53 reduzida externalização fosfatidilserina (Fig. 3C), a formação de LC3

+ autophagic vacúolo (Fig. 3D) e a perda de viabilidade celular (Fig. 3E) induzida por FK-16.

(a) As células HCT116 foram incubadas com FK-16 durante 24 h ou 48 h. Citosólica e p53 nuclear e expressão total de Bcl-2 membros (PUMA, Bcl-2, Bax e Bak) foram determinados por Western blot. GAPDH e lamina A /C foram utilizados como controlos internos para as proteínas citosólicas e nucleares, respectivamente. (B) Queda de p53 inverteu a sobre-regulação dos factores pró-autofágicos (Atg5 e Atg7) e factores pró-apoptóticos (Bax, Bak, AIF nuclear e EndoG nuclear), bem como regulação negativa da proteína Bcl-2 de FK-16. (C) o FK-16 não conseguiu externalização phosphotidylserine induzida em células HCT116 empobrecido-p53. Após a transfecção com p53 de controle ou siRNA durante 48 h, as células foram tratadas com ou sem o FK-16 (40 pM) durante mais 24 h, seguida por iodeto de propidio /anexina V-coloração dupla. (D) Queda de 53 reduziu marcadamente o número de LC3

+ autofágicos vacúolos nas células tratadas com FK-16 (40? M; 48 h), como determinado por imunof luorescência confocal (400 ×). Núcleos (azul) foram coradas com DAPI. (E) Queda de p53 inverteu parcialmente o efeito inibitório do FK-16 sobre a viabilidade celular em HCT116 como determinado pelo ensaio de MTT. Os dados são apresentados como médias ± S.D. de três experiências separadas. *,

p Art 0,05; **,

P

0,01 significativamente diferente do respectivo grupo de controlo.

†,

p Art 0,05;

††,

p Art 0,01 significativamente diferente do controle de células transfectadas com siRNA tratados com FK-16

expressão alterada de Bcl-2 e Bax durante FK-. 16-a apoptose induzida e autophagic Cell Death

Uma vez que a família de Bcl-2 tem sido relatada para regular tanto a apoptose independente de caspase e autofagia em outros contextos biológicos [30], [32], que próxima questionado se FK- a morte de células de cancro do cólon 16-induzida foi mediada através de Bcl-2 e Bax, ambos os quais eram a jusante da p53 (Fig. 3B). Os resultados mostraram que a restauração de Bcl-2 de expressão através de transfecção com o plasmídeo de Bcl-2 que codifica ou a ablação genética de Bax usando Bax

– /- células HCT116 abolida expressão induzida por FK-16 de LC3-I /II, Atg5 e Atg7 bem como a expressão nuclear de AIF e EndoG (Figura 4A . B), o que sugere que a regulação negativa da proteína Bcl-2 e sobre-regulação de Bax foram necessários para autophagic induzida por FK-16 e sinalização apoptótica. De acordo com estas descobertas, a restauração de Bcl-2 de expressão ou a ablação genética de Bax reduziu a formação de LC3

+ autophagic vacúolo (Fig. 4C) e a perda de viabilidade celular (Fig. 4D) induzida por FK-16. Estes resultados indicam que a FK-16 actuado por meio da via do p53-Bcl-2 /Bax para induzir simultaneamente FIA ​​/EndoG-dependente apoptose e morte celular mediada por autofagia.

(a) reparação de Bcl-2 por expressão transfecção com o plasmídeo de Bcl-2 que codifica inverteu a sobre-regulação dos factores pró-autophagic (Atg5, Atg7 e LC3-I /II) e pró-apoptótica (FIA nuclear e EndoG nuclear) induzida por FK-16 (40? M; 48 h) em HCT116. (B) a ablação genética de Bax (Bax KO) em HCT116 invertida sinais apoptóticos e autofágicos induzidas por FK-16. Bax

+/- HCT116 tratados com ou sem FK-16 foi utilizado como controle. (C) Restabelecimento da expressão de Bcl-2 ou a ablação genética de Bax em HCT116 aboliu a formação de LC3

+ vacúolos autofágicos induzidas por FK-16 (40? M; 48 h), como determinado por imunof luorescência confocal (400 ×). (D) Recuperação da expressão de Bcl-2 ou a ablação genética de Bax inverteu parcialmente o efeito inibitório do FK-16 sobre a viabilidade celular em HCT116 como determinado pelo ensaio de MTT. Os dados são apresentados como médias ± S.D. de três experiências separadas. *,

p Art 0,05; **,

P

0,01 significativamente diferente do respectivo grupo de controlo.

††,

p Art 0,01 significativamente diferente de vazio ou transfectados com vector Bax

+/- células tratadas com FK-16

regulação recíproca entre os dois. caspase-independente apoptose e autofágica Cell Death

Para elucidar a interferência potencial entre a morte celular autofágica e apoptose AIF /EndoG-dependente na ação do FK-16, estes dois processos celulares foram abolidas por interferência RNA. As eficácias de knockdown de Atg5-, Atg7-, AIF- e EndoG-siRNAs foram confirmados por transferência de Western (Fig. 5A). A inibição da autofagia por Atg5- ou Atg7-siRNA aumentada substancialmente expressão nuclear da FIA e EndoG induzida por FK-16 (Fig. 5B). Concordantemente, knockdown de Atg5 ou Atg7 também reforçada FK-16 induzida por externalização de fosfatidilserina (Fig. 5C), sugerindo que a inibição da apoptose intensificada autofagia FIA induzida por FK-16 /EndoG-dependente. Reciprocamente, a supressão de apoptose FIA ​​/EndoG-dependente por AIF- ou EndoG siRNA expressão aumentada Atg5 e Atg7 induzida por FK-16 (Fig. 5D), que indica que a inibição da apoptose FIA ​​/EndoG-dependente do sinal ampliado autophagic em FK- 16-tratadas células cancerígenas do cólon. Concordantemente, AIF- e EndoG-siRNAs aumentou a expressão de LC3-I /II. Estes resultados indicaram a existência de uma regulação recíproca não declarada entre a morte celular autofágica e apoptose AIF /EndoG-dependente.

(A) As eficácias knockdown de AIF-, EndoG-, Atg5- e Atg7-siRNAs foram confirmados por downregulation dos níveis de proteína dos respectivos alvos em HCT116. (B) Knockdown de Atg5 ou Atg7 reforçada basal e FK-induzida-16 (40? M; 6 h) expressão nuclear da FIA e EndoG. (C) Queda de Atg5 ou Atg7 aumento FK-16-induzida (40? M; 48 h) phosphotidylserine externalização como determinado por coloração de anexina V e citometria de fluxo. (D) Knockdown da FIA ou EndoG reforçada basal e FK-16 induzida (40 mM; 48 h) Atg5 e Atg7 expressão da proteína. (E) Knockdown de Atg5 ou Atg7 abolida enquanto Knockdown da FIA ou EndoG reforçada FK-induzida-16; LC3-I expressão (40 mM 48 h) /II em HCT116. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Discussão

A indução de apoptose em células tumorais tem sido desde há muito reconhecido como uma abordagem essencial para a terapia do cancro [33]. No entanto, a resistência intrínseca de algumas células tumorais a apoptose ea rápida rebrota de tumor após a resposta inicial a agentes quimioterápicos continuam a ser grandes enigmas clínicos. Por conseguinte, existe um interesse crescente na comunidade científica para estudar a gama completa de morte celular independente de caspase e os agentes que actuam principalmente através do mecanismo independente de caspase identificação. No presente estudo, foi demonstrado que o tratamento com o péptido anti-cancro FK-16 reduziu fortemente a viabilidade de células cancerígenas do cólon, na ausência de activação de caspase ou a permeabilização da membrana, sugerindo que nem a apoptose dependente da caspase clássica nem necrose era responsável pela sua citotoxicidade . Para este fim, células exibiram características morfológicas e bioquímicas consistentes com AIF /apoptose dependente de EndoG e morte celular autophagic FK-16-tratada. Acima de tudo, knockdown de genes centrais para estes dois processos celulares atenuou a citotoxicidade de FK-16. Estas descobertas sugerem que a FK-16 é um activador de modo duplo de morte celular independente de caspases. No entanto, também vale a pena notar que em algumas configurações experimentais (Fig 1G . 3C), FK-16 aumentou ligeiramente coloração com iodeto de propídio. Esta observação pode ser explicada pelo stress celular aumentada associada com ARNsi de transfecção, o que pode tornar as células mais susceptíveis ao efeito de desregulação membrana de FK-16.

Um certo número de tensões celulares, incluindo danos no DNA e oncogene activação, têm mostrado activar a p53. Dependendo do estímulo inicial e do contexto celular, activação de p53 poderia provocar um repertório de respostas, incluindo a paragem do ciclo celular, a apoptose, senescência celular, a diferenciação e a autofagia [34]. Uma vez que a perda de expressão de p53 é comum em cancros humanos, restaurar a actividade de p53 é uma abordagem atractiva para a terapia do cancro. A este respeito, um número de agentes anti-cancro experimentais restaurando-p53 (por exemplo, CP-31.398 e nutlin) foram identificados [35]. Aqui, mostramos que a FK-16 é um novo activador de sinalização de p53. FK-16 não só aumentou a acumulação de p53 nuclear, mas também induziu a expressão de PUMA e Bax, ambos os quais são conhecidos alvos de transcrição de p53 [36], [37]. Knockdown de p53 também inverteu a apoptose induzida por AIF FK-16 /EndoG-dependente e morte celular autofágica. Além disso, o efeito pró-apoptótico e pró-autophagic de FK-16 necessária regulação positiva dependente de p53 de Bax e regulação negativa de Bcl-2. Nas linhas com estes resultados, os papéis centrais do p53-Bax /Bcl-2 em cascata em FIA /EndoG-dependente apoptose e autofagia têm sido relatados. Por exemplo, um análogo de ciclofosfamida de drogas que danificam o ADN e um dos principais polifenóis do chá verde têm mostrado activar a p53 e Bax para desencadear deslocalização nuclear de AIF e EndoG para mediar a apoptose em células tumorais [32], [38]. p53 como um fator de transcrição também estimula a autofagia através induzir vários genes pró-autofágicos, incluindo

DRAM

,

Skp2

,

SESN2

, e

ULK1 /2

, além de

PUMA

e

BAX

[30]. Além disso, de activação de p53 pode promover a dissociação do complexo de Bcl-2-beclin-1 e, assim, desinibidor beclin-1-dependente autofagia [39].

Um dado interessante que emerge a partir deste trabalho é a descoberta de um recíproco mecanismo de regulação entre as duas vias de morte celular independente de caspases. Nossos dados indicam que a abolição da apoptose AIF /EndoG-dependente aumenta a morte celular autofágica e vice-versa, indicando que estas duas vias mediar a citotoxicidade de FK-16 de forma cooperativa. Embora autofagia induzida por FK-16 é encontrado para ser pró-morte na natureza, o bloqueio de autofagia paradoxalmente induz a apoptose independente de caspase em células tratadas com FK-16. Uma explicação para este dilema é que o bloqueio de autofagia induzida por FK-16 evita a morte celular, mas ainda activa a apoptose independente de caspases de um modo de compensação e o resultado líquido é a conservação da viabilidade celular em comparação com as células em que ambas as vias de morte celular são activado. Para o efeito, a contribuição direta de autofagia à morte celular tem sido amplamente divulgado, apesar das recentes disputas sobre a existência real de “morte autofágica célula” [40], [41], [42], [43]. Enquanto co-ativação da autofagia e independente de caspase apoptose tem sido documentado em vários contextos biológicos [44], [45], [46], existem apenas estudos esporádicos na literatura que tentaram elucidar a relação entre estes dois processos. Consistente com nossos achados, Zheng

et al.

E Eimer

et al., Achou que a autofagia poderia proteger contra a apoptose independente de caspase em Hoechst 33342-tratados células HeLa e células de glioblastoma tratados com erlotinib, respectivamente [47], [48]. A inibição da autofagia por 3-metiladenina também acelera rottlerin induzida por apoptose independente de caspase em células de fibrossarcoma humano HT1080 [49].

Identificação de péptidos antineoplásicos da base de dados existente AMP é uma abordagem eficaz para o desenvolvimento de cancro da novela terapêutica. Neste estudo, o FK-16, um fragmento de LL-37, exibe uma actividade anti-cancro melhor que o péptido de comprimento total. FK-16 também se engata numa via de morte celular adicional, ou seja, morte celular autophagic. O comprimento encurtado do FK-16 pode também reduzir o custo de produção associados com a síntese de péptidos. Tomados em conjunto, o peptídeo anticancerígeno FK-16 induz AIF /EndoG-dependente apoptose e morte celular autofágica via comum p53-Bax /Bcl-2 em cascata em células cancerígenas do cólon (Fig. 6). Nossos dados também revela uma nova regulação recíproca entre estas duas vias de morte celular independente de caspase.

Materiais e Métodos

Peptídeos

O LL-37 sintético (LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES ), FK-16 (FKRIVQRIKDFLRNLV) e ovos mexidos () peptídeos DQVLRFRNFRIKLVKI com pureza . 95% foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA)

cultura de células e viabilidade celular Assay

o cancro do cólon HCT116 humano linhas celulares e LoVo foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). Bax

– /- e Bax

+/- células HCT116 foram gerados por gene alvo [50] e fornecido pelo Prof. Bert Vogelstein (Ludwig Center em Johns Hopkins). A linha de células da mucosa epitelial hormal cólon humano NCM460 foi adquirida da Incell Corporation. As células foram mantidas no seu respectivo meio de cultura recomendado suplementado com 10% de soro fetal de bovino, 100 U /mL de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 e 95% de ar . A viabilidade celular foi medida por MTT [brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio] ensaio. Em breve, foram plaqueadas 5000 células por poço em placas de 96 poços. Após o tratamento, a solução de MTT dissolvida no meio de cultura a uma concentração final de 0,5 mmol /L foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas durante mais 4 h. Dimetil sulfóxido foi então adicionado para solubilizar MTT tetrazólio de cristal. Finalmente, a densidade óptica foi determinada a 570 nm utilizando um leitor de microplacas de Referência Além disso, (Bio-Rad, Hercules, EUA).

A quantificação de células externalização de fosfatidilserina

Para a medição da externalização fosfatidilserina, tratados foram re-suspensas em tampão de coloração contendo iodeto de propídio e anexina V-isotiocianato de fluoresceína (Invitrogen, EUA). Após incubação durante 15 minutos no escuro, as células duplamente marcadas foram analisados ​​pelo programa do sistema FACSCalibur e CellQuest.

Extracção proteína nuclear e Western Blot usando

O isolamento de proteínas nucleares e citossólicos foi realizada NucBuster kit de extracção de proteína (Merck Biosciences, Darmstadt, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. Para o isolamento de proteínas de células inteiras, as células foram colhidas em tampão de radioimunoprecipitação contendo inibidores da proteinase e da fosfatase.