Sumário
Nós usamos perfil de expressão gênica para identificar as citocinas inflamatórias que se correlacionam com o desenvolvimento do cancro da bexiga. perfis das amostras de tecido de expressão gênica foram investigados utilizando microarrays de cDNA que continham 103 não-musculares cancros da bexiga invasivo (NMIBC), cânceres de 62 músculo da bexiga invasivo (CINM), 58 amostras de tecidos circundantes aparência normal histologicamente, e 10 indivíduos normais e saudáveis que serviu como grupo de controlo para comparação. Nós agrupados os conjuntos de dados de acordo com as caracterizações biológicas e focada em genes da resposta imune com expressão diferencial, pelo menos, duas vezes em MIBC vs controlos. A data-set experimental identificou 36 genes relacionados ao sistema imunológico que foram significativamente alterados em amostras CINM. Além disso, 10 genes foram supra-regulados e 26 genes foram regulados negativamente em amostras CINM em comparação com os tecidos normais. Entre as 10 moléculas sobre-regulada examinados, a capacidade tanto para-cicatrização de feridas migração e invasão foi aumentada em resposta a IL-5, IL-20, e IL-28A em linhas celulares de cancro da bexiga (células 253J e EJ), em comparação com células não tratadas. Os níveis de IL-5, IL-20, IL-28A e de expressão foram aumentadas em doentes com MIBC. Todos os 3 citoquinas e os seus receptores foram produzidos em linhas celulares de cancro da bexiga, tal como determinado por PCR em tempo real, análise de imunotransferência e de imunofluorescência confocal. A regulação da MMP-2 e MMP-9 foi encontrado após a IL-5, IL-20, e estimulação de IL-28A em ambos os tipos de células. Além disso, um ensaio EMSA mostraram que o tratamento com IL-5, IL-20, IL-28A e a activação induzida de factores de transcrição NF-kB e AP-1, que regulam o promotor de MMP-9. Finalmente, observou-se a activação de MAPK e sinalização Jak-Stat após a adição de IL-5, IL-20, e IL-28A para células cancerosas da bexiga. Este estudo sugere que a presença de citoquinas inflamatórias específicas (IL-5, IL-20, e IL-28A) associação mediada por no desenvolvimento do cancro da bexiga. Todos os 3 citocinas podem ser novos alvos moleculares importantes para a modulação da migração e invasão no cancro da bexiga
Citation:. Lee S-J, Lee E-J, Kim S-K, Jeong P, Cho Y-H, Yun SJ, et al. (2012) Identificação de citocinas pró-inflamatórias Associated com o músculo invasivo cancro da bexiga; Os papéis de IL-5, IL-20 e IL-28A. PLoS ONE 7 (9): e40267. doi: 10.1371 /journal.pone.0040267
editor: Nikolaos Frangogiannis, Albert Einstein College of Medicine, Estados Unidos da América
Recebido: 26 Janeiro, 2012; Aceito: 4 de junho de 2012; Publicação: 04 de setembro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Lee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo Programa de Pesquisa em Ciência básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2010-0.001.736) e da Coreia do Healthcare Tecnologia R D Project, Ministério da Saúde Bem-estar, República da Coreia (A100651-1011-0000200). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de bexiga é uma das neoplasias mais prevalentes em países economicamente avançados, e cancros da bexiga quase todos malignos são carcinoma de células transicionais (TCC), que surgem do epitélio de transição [1], [2]. Dois tipos de TCC foram histologicamente classificados: não-muscular câncer de bexiga invasivo (NMIBC) e músculo câncer de bexiga invasivo (CINM) [3], [4]. Na apresentação inicial, 70-80% de pacientes são diagnosticados com NMIBC que é limitada à mucosa. A parte restante dos casos apresenta MIBC com invasão das camadas muscular da bexiga. Os pacientes com NMIBC pode ser tratada com sucesso, enquanto que a maioria das mortes ocorrem em pacientes com MIBC incidente [4]. Portanto, muito esforço tem sido focada na compreensão dos mecanismos de desenvolvimento CINM para possíveis aplicações terapêuticas.
é agora amplamente aceito que a imunoterapia intravesical com Bacilo Calmette Guerin (BCG) é o agente adjuvante mais eficaz para o tratamento de NMIBC [5] – [7]. No entanto, o método terapêutico mais úteis para o tratamento dos pacientes com MIBC continua a ser identificado. Por conseguinte, muitos estudos foram realizados a fim de obter mais conhecimento sobre os mecanismos de desenvolvimento de MIBC, que podem conduzir à descoberta de um tratamento terapêutico potencial. Os estudos bioquímicos e biológicos associados à TCC agressivo foram analisados para determinar os indicadores de prognóstico, ou para desenvolver agentes para aplicação em diagnóstico e terapêutica. Vários marcadores moleculares específicos têm sido identificados pelos perfis de expressão de genes em cancro da bexiga, incluindo reguladores do ciclo celular, proliferação celular, apoptose e factores de angiogénese [8]. A inflamação está envolvido no desenvolvimento de várias doenças, tais como a aterosclerose, diabetes e tumores, e é acompanhado pelo aparecimento de numerosos marcadores inflamatórios [9] – [11]. No entanto, a associação inflamatória-fenótipo que regula o desenvolvimento ea metástase do câncer da bexiga é ainda pouco compreendido.
Uma enorme quantidade de dados mostrou que interleucinas exercem inúmeras funções de regulador de crescimento celular, sobrevivência celular, diferenciação e apoptose em várias doenças [11]. Interleucinas também podem apresentar efeitos distintos sobre a regulação de respostas imunes e patogénese do cancro da bexiga [4] – [7]. O tratamento com interleucina-6 (IL-6) foi associada com efeito anti-tumoral através da indução da apoptose no carcinoma da bexiga de rato [12]. de entrega de genes de IL-15 apresentaram efeito anti-tumor num modelo de cancro da bexiga ortotópico de rato [13]. Em contraste, IL-6, o tratamento foi encontrada para contribuir para o crescimento celular em células cancerosas da bexiga humanos
in vitro
[14]. Além disso, a expressão de IL-8 e IL-17 tem sido implicada no crescimento de tumores e metástases no cancro da bexiga humano [15], [16]. Embora muitos estudos têm analisado os efeitos das interleucinas no crescimento do cancro da bexiga [12] – [16]., O seu papel exacto e mecanismo molecular no processo de migração e invasão de TCC associada com estudo clínico não foi elucidado
neste estudo, nós utilizamos uma abordagem baseada em microarrays para identificar clinicamente e biologicamente padrões de expressão informativos que diferem entre pacientes com NMIBC e MIBC e amostras de controlo. Os nossos resultados focada nas diferenças entre as amostras de controlo CINM e nos padrões de genes que desempenham um papel importante nos processos celulares mais importantes envolvidos na resposta inflamatória de expressão. Os genes com a expressão de pelo menos duas vezes diferencial em MIBC foram identificados vs controlos, e as novas funções e vias de sinalização em uma série inflamatória à base de bexiga TCC foram elucidadas.
Resultados
Diferencial padrões de expressão genética entre os pacientes Grupos em
Foram caracterizados os padrões de amostras de pacientes com câncer de bexiga 233 expressão gênica; 103 NMIBCs, 62, e 68 MIBCs cancros da mucosa ou mucosa circundante (adjacente a) Normal (Tabela 1). Nós aplicada pela primeira vez a análise de agrupamento hierárquico dos padrões de expressão gênica para avaliar as características moleculares das diferentes grupos de pacientes. Como esperado, a análise hierárquica de agrupamento de dados de expressão de genes a partir de todos os tecidos produziram 3 grupos principais, uma que representam a mucosa da bexiga normal, 1 que representa o grupo de MIBC paciente, e 1 representa o grupo de doentes NMIBC (Figura 1). Assim, os padrões de expressão de genes que reflectem a configuração molecular eram facilmente distinguíveis entre tumores da bexiga e tecidos não tumorais.
foram seleccionados genes com valores de expressão que tinha um desvio padrão de pelo menos 0,7 (4.145 genes) . As cores vermelhas e verdes refletem os níveis de expressão de alto e baixo, respectivamente.
A seguir, tentou identificar conjuntos de genes que foram diferencialmente expressos entre os 3 grupos diferentes. Nós aplicamos Venn comparação diagrama de listas de genes 2 para comparar os padrões de NMIBCs e MIBCs de expressão gênica. Em primeiro lugar, nós geramos 2 listas de genes diferentes através da aplicação de um teste t de 2 amostras (Figura 2A,
P
0,001). lista Gene A representa os genes que foram diferencialmente expressos entre a mucosa normal e NMIBC e lista de gene B representa os genes que foram diferencialmente expressos entre a mucosa normal e CINM. Ao comparar as listas de genes 2, foram observadas 3 padrões diferentes: S não I (1.452 genes), S e I (679 genes), e eu não S (381 genes) (Figura 2B). Genes no S eu não categoria mostrou padrões de expressão NMIBC específicos de, enquanto genes no não me categoria S apresentaram padrões de expressão de genes específicos do CINM. Genes na categoria S e eu exibiram ambos os padrões de expressão NMIBC e CINM, o que significa que 679 genes na categoria S e eu estávamos comum tanto para o desenvolvimento NMIBC e MIBC.
(A) diagrama de Venn de genes selecionados por um 2 -Sample t-teste. O círculo azul (gene lista S) representa genes diferencialmente expressos entre mucosa normal e NMIBCs. O círculo vermelho (gene lista I) representa genes diferencialmente expressos entre mucosa normal e MIBCs. A cut-off
P
-valor de menos de 0.001 foi aplicada para selecionar genes com uma expressão que foi significativamente diferente entre os dois grupos. padrões (B) a expressão de genes seleccionados do diagrama de Venn. Os dados são apresentados no formato de matriz em que as linhas representam genes individuais e colunas representam cada tecido. As cores vermelhas e verdes refletem os níveis de expressão de alto e baixo, respectivamente.
Classificação Funcional da Assinatura Gene Expression para CINM Desenvolvimento
Para determinar se a nossa assinatura de expressão gênica foi enriquecida no conhecido funções biológicas, classificação funcional da bioinformática análises dos genes que foram diferencialmente expressos entre a mucosa normal e MIBC foram realizadas. Esta análise revelou uma série de desenvolvimento de MIBC associada com as categorias funcionais. classificações funcionais de conjuntos de genes encontram-se ilustrados na Figura 3. Verificou-se que os genes envolvidos no ciclo celular, cancro, crescimento e proliferação celular, morte celular, e DNA-replicação e -consertos foram significativamente enriquecida. Nós também descobrimos que genes envolvidos nos mecanismos de infecção, doença imunológica e doença inflamatória também estiveram presentes em números significativos. É interessante que um número significativo de genes envolvidos na doença renal e urológica, desenvolvimento celular, o desenvolvimento de tecidos, e distúrbios do desenvolvimento foram observadas, que inspirou confiança nos nossos resultados. Tem havido muito progresso na investigação do cancro da bexiga em genes que contribuem para o ciclo celular, desenvolvimento celular, crescimento celular, ou a proliferação de células, que foram altamente significativas funções na Figura 3. A fim de identificar os níveis de expressão do gene em tumores da bexiga, nós analisou ainda os conjuntos de dados de microarranjos. As amostras individuais de tumores de pacientes com cancro da bexiga revelou 664 genes que foram diferencialmente expressos em todas as amostras de tecido de tumor, em que os genes estavam diferenciais quer para cima ou para baixo-regulado (Tabela S1, S2, S3, e S4).
enriquecimento classificação foi determinada utilizando software Ingenuity Pathway Analysis (versão 8.8). O significado de cada função foi estimada utilizando o método de teste exato de Fisher. O limite de significância estatística foi -log (
P
= 0,05).
No presente estudo, analisamos o perfil dos genes envolvidos na proliferação celular expressão, apoptose, células controlo do ciclo, a angiogénese, a cura de feridas, ADN-replicação e -consertos, citoesqueleto e adesão celular entre a mucosa normal e MIBC (Tabela S1 e S2). Em CINM, os níveis de expressão de mRNA dos genes relacionados à proliferação celular vax1, TTK, TPX2, intemporal, Stil, TBRG4, MCM7, KIF2C, HGS, DHCR7, CENPF, BRCA1, UHRF1, TRAIP, RecQL4, RACGAP1, ARN, MKI67, KISS1R, KIF15, ENTR 1, IMPDH1, FGF18, E2F1, DLG7, BUB1B, BUB1, BRCA2, e BLM foram regulados positivamente comparar com mucosa normal (Tabela S1). O próximo conjunto foi composto por genes relacionados com a apoptose que estavam sobre-expressos (TOP2A, Scotin, MTP18, GSK3B, FANCG, BIRC5, AKT1S1, yars, TRIB3, TRAF2, SCARB1, RAD21, FAF1, ESPL1, E2F2, BCL2L12, ATF5, e AATF) em MIBC (Tabela S1). Os genes pertencia a uma família correlacionado com o citoesqueleto e foram significativamente sobre-expressos em MIBC: TUBG1, SPTBN2, SPAG5, SCYL1, RCC2, rae1, PRC1, PPP4C, NUSAP1, MYOHD1, LMNB2, KIFC1, KIF4A, KIF20A, KIF14, KIAA1688 , GTSE1, CCNB1, C9orf48, C18orf24, AZI1, AURKB, TUBA6, STMN1, corte, SLC9A3R1, SAC3D1, ODF2, Nek2, LMNB1, KNTC1, KIF22, ITGB4BP, FAM33A, CCNB2, e ANLN (Tabela S1). Nós também detectada a expressão regulada para cima de moléculas relacionadas com a adesão celular, tais como TSTA3, TROAP, ADAM15, TINAG, PVR, PPFIA1, CELSR3 e ADRM1 no CINM (Tabela S1). genes moleculares relacionadas com angiogénese incluindo TOP2A, POLD1, PFS2, ORC1L, MCM7, NPR1 e FGF18 está regulada para cima no CINM (Tabela S1). No entanto, a expressão regulada para cima do factor angiogénico VEGF foi inesperadamente observada em NMIBC (Tabela S1). replicação do DNA e genes relacionados com a reparação foram regulados positivamente no CINM: TDP1, DNA2L, Tyms, TDG, POLQ, POLE2, POLD2, POLA2, ORC6L, Mcm10, PRPF19, MGC32020, GTF2H4, EME1, RUVBL2, RAD51AP1, NUDT1, FANCB, e FANCA (Tabela S1). Finalmente, os presentes dados mostraram os níveis sobre-expressos de genes regulados pelo ciclo celular, que contribuem para a progressão do tumor e invasão: UBE2C, TREX1, RCC1, PSMD8, PA2G4, LIN9, GSG2, E2F3, CDT1, CDK5RAP1, CCNF, ZWINT, PKMYT1 , CDC45L, CCNE2, CCNA2, SUV39H1, RAD54L, POLD1, HCAP-G, H2AFX, GPS1, FLJ22624, FANCD2, CHAF1A, CDCA3, ASPM, XRCC2, SPBC25, SMC4L1, SGOL1, SC65, PTTG1, pólo, PBK, MCM2, KNTC2 , KIAA1794, EXO1, CIT, CHAF1B, CEP55, CDCA8, CDCA5, CDCA2, CDCA1, C20ort172, ANAPC11, CDC2, CDC20, cdc25C, Cdc7, CDC27 e Cdc25A (Tabela S1).
IL-5, IL-20 e IL-28A estimular a migração e invasão de células cancerosas da bexiga
o câncer de bexiga é uma doença imune-relacionadas ou inflamação, e imunoterapia, como a instilação intravesical de Bacillus Calmette-Guérin (BCG) é o opção de tratamento mais importante para NMIBC para prevenir a progressão da doença [5] – [7], [9]. Estudos indicaram que cumulativos alteração nos níveis de citocinas pode ser um evento chave na determinação da progressão da doença de cancro da bexiga [17] – [19]. Para a análise seguinte, por conseguinte, que seleccionado funções imunológicas ou inflamatórias dos seus resultados de classificação funcional (Figura 3). Por causa de morte em doentes com cancro da bexiga é fortemente relacionada com o desenvolvimento de MIBC [4], analisou-se os padrões de imuno-representativo ou genes associados a inflamação, comparando MIBC e amostras de controlo de expressão do gene (Tabela 2 e 3). Dez (10) destes genes (IL-5, IL-26, IL-22RA1, IL-1RAPL1, IL-1F5, IL-17RB, IL-17RE, IL-20, IL-28A, e TRAF2) mostraram expressão aumentada e 26 genes foram regulados negativamente em amostras CINM, em comparação com amostras de controlo (Tabela 2 e 3). Foram divididos os 10 genes sobre-regulada em 3 tipos: (1) citocinas (IL-26, IL-5, IL-20, e IL-1F5) (2) receptores de citocinas (IL-22RA1, IL-17RB, Il- 17RE, IL-1RAPL1, e IL-28AR1), e (3) proteína adaptadora do receptor de citocina (TRAF-2). Em primeiro lugar, para analisar a capacidade de induzir a migração e a invasão, utilizou-se citocinas IL-26, IL-5, IL-20 e IL-1F5. Em segundo lugar, utilizou-se citocinas IL-22, IL-17E, IL-17C e IL-28A porque estas citocinas medeia as respostas celulares através da sua interacção com os seus receptores (IL-22 /IL-22RA1, IL-17E /IL-17RB, IL-17C /IL-17RE, IL-28A /IL28AR1) [20] – [23]. No caso de IL-1RAPL1, utilizou-se a sobre-expressão do gene de ADNc de IL-1RAPL1 porque o ligando de IL-1RAPL1 ainda não tinham sido identificados [24]. Finalmente, também usou o gene cDNA TRAF2 tivéssemos clonado. Relatórios anteriores indicaram que o desenvolvimento CINM foi fortemente associado com a migração e invasão de células [4] cancerosas, [15]. Para determinar se os genes regulados positivamente em MIBC induzir a migração e a invasão de células cancerosas da bexiga, realizamos ensaios de cicatrização de feridas e em ensaios de invasão 253J cancro da bexiga EJ e células utilizando proteínas recombinantes ou de genes de cADN. Entre as 10 moléculas examinadas, IL-5, IL-20, IL-28A e significativamente aumentada tanto a migração e a invasão de células 253J à cicatrização da ferida, em comparação com células não tratadas (Figura 4A e 5A). Resultados semelhantes foram encontrados em células EJ (Figura 4B e 5B). Além disso, a proliferação de células não foi observada em qualquer dos 3 casos de células cancerosas da bexiga tratados com citocina (Figura S1A e B). No entanto, o outro 5 citocinas e 2 genes não teve efeito sobre a migração e invasão de células de câncer de bexiga (Figura S2, S3, e S4).
(A, B) O confluentes células cancerosas da bexiga foram incubadas com meio isento de soro e tratadas com a proteína recombinante IL-5, IL-20, e IL-28A para os tempos indicados. As larguras das linhas de ferimento feitos em células foram então examinadas a 0 e 24 h. migração de cicatrização é representado por as larguras das linhas de ferimento.
(A, B) As células foram colocadas na câmara superior, e as concentrações indicadas de IL-5, IL-20, e IL-28A foram colocados em baixo poço da câmara de quimiotaxia. o número de células invadidas foram contadas após os tempos indicados. Os resultados são expressos como o número de células invadidas comparação com um controlo não tratado, tal como determinado a partir de 3 experiências independentes. **
P
. 0,01 em comparação com nenhum tratamento
IL-5, IL-20 e IL-28A Expressão foi regulada em Pacientes com MIBC
Para validar o nível de IL-5, IL-20, e IL-28A, que ao lado mediu os níveis de mRNA de 62 MIBCs e 68 amostras normais por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que os níveis de IL-5, IL-20, e ARNm de IL-28A de expressão foram geralmente mais elevada em pacientes CINM do que em indivíduos saudáveis (Figura 6), o que sugere que a expressão de IL-5, IL-20, e IL-28A é fortemente e significativamente associada com o câncer de bexiga invasivo.
Quantitative PCR em tempo real foi usada para validar a expressão do gene de IL-5, IL-20 e IL-28A em pacientes CINM e saudável indivíduos. As amostras clínicas foram obtidos de 62 pacientes CINM e 68 indivíduos saudáveis. O ARNm foi isolado e usado para realizar PCR em tempo real para a IL-5, IL-20, e IL-28A. Os resultados são representados como a IL-5, IL-20, IL-28A e a expressão de ARNm em relação à expressão de ARNm de GAPDH. *
P
. 0,01 em comparação com indivíduos saudáveis
IL-5, IL-20, IL-28A, e seus receptores detectado por PCR em tempo real, Immunoblot e confocal Microscopia de imunofluorescência em células cancerosas da bexiga
a fim de determinar se a IL-5, IL-20, IL-28A e ARNm foram expressos tanto em células 253J e EJ, ensaio de PCR em tempo real foi levado a cabo. Como mostrado na Figura 7A e D, a expressão de IL-5, IL-20, e ARNm de IL-28A foi endogenamente detectado em ambas as linhas celulares. Tratamento de ambas as linhas celulares com 10% de FBS durante 24 h mostrou significante sobre-regulação de IL-5, IL-20, e a expressão de IL-28A em níveis de ARNm (Figura 7A e D). Além disso, a análise por PCR em tempo real mostraram a expressão dos receptores de citocinas 3, IL-5Rα, IL-20R1, e IL-28AR1 em ambas as células EJ (Figura 7B e E) e 253J. proteínas IL-5, IL-20, IL-28A e foram observadas por imunotransferência de extractos proteicos a partir de ambas as linhas celulares (Figura 7C e F). IL-5, IL-20, e a expressão da proteína IL-28A foi aumentada pela adição de 10% de FBS (Figura 7C e F). Usando a microscopia confocal de imunofluorescência, que a próxima examinados localização sub-celular de IL-5, IL-20, e a proteína IL-28A em ambas as linhas celulares. Todos os 3 citocinas foram dispersas no citoplasma e nas áreas peri-nuclear (Figura 8A e B).
(A, B, D, e E) As células foram incubadas com as várias concentrações de FBS durante 24 h , e os níveis de IL-5 de expressão de mRNA de IL-20, IL-28A (a, D) e os seus receptores (B, e) foram quantificados por PCR em tempo real. Os resultados foram expressos como a IL-5, IL-20, IL-28A e do seu receptor de expressão de ARNm em relação à expressão de ARNm de GAPDH. *
P
0,01 comparado com nenhum tratamento. (C, F) As células foram tratadas com várias concentrações de SBF durante 24 horas, e os níveis de proteína de IL-5, IL-20, IL-28A e foram analisados por imunotransf erência. expressão de GAPDH foi usada como controlo de carregamento.
células (A, B) e EJ 253J, respectivamente, foram coradas com anticorpos contra a IL-5, IL-20, e IL-28A QD565-conjugado (vermelho). Ambos os núcleos (anti-DAPI) e no citoplasma (anti-tubulina-Alexa488) são contrastadas com DAPI (azul) e tubulina-Alexa488 (verde).
IL-5, IL-20 e IL -28 Ativa MMP-9 expressão através da ativação dos fatores de transcrição NF-kB e AP-1 em células do cancro de bexiga
relatórios anteriores demonstraram que a MMP-9 expressão foi intimamente associado com a invasão do tumor da bexiga e da migração [4], [15], [25] – [29]. Os nossos dados mostraram que a IL-5, IL-20, e IL-28A estimula a migração e a invasão de células cancerosas da bexiga (Figura 4 e 5). Estes resultados levaram-nos a examinar se a IL-5, IL-20, e IL-28A induz a expressão de MMP-9. O tratamento de ambos os tipos de células cancerosas com IL-5 resultou em significativa sobre-regulação da expressão de MMP-9 de um modo dependente da sua concentração e do tempo, detectada usando zimografia de gelatina e análise de imunotransferência (Figura 9A, 9B, 10A, e 10B) . Resultados semelhantes foram observados após tratamento com IL-20 ou IL-28A, respectivamente (Figura 9A, 9B, 10A, e 10B). Além disso, a expressão de MMP-2, uma outra metaloproteinase de matriz, foi também estimulada em IL-5-, IL-20, e as células-28A-tratados com IL, tais como 253J e células EJ (Figura 9A, 9B, 10A, e 10B). A região 5′-regulação da MMP-9 promotor humano contém diversos motivos de consenso para NF-B, AP-1, e os factores de transcrição SP-1 [30] – [32]. Nós fundamentado que a MMP-9 expressão por IL-5, IL-20, e IL-28A pode estar correlacionada com o aumento da actividade de NF-kB, AP-1 e SP-1 no núcleo. Para este fim, foi realizado um teste de desvio de mobilidade electroforética (EMSA), utilizando extractos nucleares de células cancerosas da bexiga induzidas por IL-5, IL-20, e IL-28A. IL-5, IL-20, IL-28A e induzida aumento significativo no NF-kB e actividades de ligação AP-1 em linhas celulares 253J (Figura 11). Sem complexos de ligação específicos para Sp-1 foi observada em células tratadas com qualquer uma das interleucinas (Figura 11). No entanto, no caso de células EJ, tanto a IL-5 e IL-28A estimulou a actividade de ligação de NF-kB (Figura 12). Aumento de NF-kB e AP-1 actividades de ligação foram detectados em células EJ-tratados com IL 20 (Figura 12).
(A) células foram cultivadas até 70% de confluência em DMEM suplementado com FBS a 10% e o o meio foi mudado para um meio isento de soro. As células foram tratadas com diferentes concentrações de IL-5, IL-20, e IL-28A para 24 h. (B) dependente do tempo de MMP-9 a expressão em células de cancro da bexiga induzidas por IL-5-, IL-20, e IL-28A. As células em meio sem soro foram incubadas com IL-5-, IL-20, e IL-28A (100 ng /ml) durante vários tempos. O meio condicionado a partir de (A) e (B) foram analisadas pela actividade de MMP zymographic. A expressão da proteína de MMP-2, MMP-9 e GAPDH foi determinada por análise de imunotransferência.
células confluentes (A) foram cultivadas em DMEM suplementado com FBS a 10%, e o meio foi mudado para um soro médio -livre. As células foram estimuladas com concentrações indicadas de IL-5, IL-20, e IL-28A para 24 h. (B) A indução da expressão de MMP-9 dependente do tempo nos níveis de IL-5, IL-20, e as células cancerosas da bexiga tratados com IL-28A. Células em meio isento de soro foram estimuladas com IL-5-, IL-20, e IL-28A (100 ng /ml) para os tempos indicados. Zymographic actividade de MMP foi analisada utilizando meios condicionados a partir de (A) e (B). A expressão da proteína de MMP-2, MMP-9 e GAPDH foi sujeita a análise de imunotransferência.
As células foram cultivadas com meio isento de soro contendo as concentrações indicadas de IL-5, IL-20, e IL -28. Após 24 h, os extractos nucleares das células foram analisadas por EMSA para activada de NF-kB, AP-1 e SP-1 utilizando sondas de oligonucleótidos marcados radioactivamente.
As células foram incubadas com meio isento de soro durante as concentrações indicadas de IL-5, IL-20, IL-28A e durante 24 h. Em seguida, os extractos nucleares a partir de células foram submetidos a EMSA para testar NF-kB, AP-1 e SP-1 a actividade de ligação utilizando sondas de oligonucleótidos marcados radioactivamente.
A indução da MAPK e Jak-Stat Sinalização Caminho em células cancerosas da bexiga induzidas por IL-5, IL-20, e IL-28A
Porque sinalização para citocinas activa primariamente o Jak /Stat e vias de transdução de sinal MAPK [8], que em seguida investigadas as cascatas de sinalização induzida por IL-5, IL-20, e IL-28A, em células cancerosas da bexiga. experimentos curso de tempo foram realizadas em células 253J e EJ. IL-5 tratamento induziu a ativação de ERK1 /2, JNK, JAK1, JAK2, Stat1, Stat2 e Stat3 em células 253J (Figura 13a e 14a). A estimulação de células EJ com IL-5 resultou na activação de ERK1 /2, p38MAPK, JAK1, JAK3, Stat1, e Stat3 (Figura 13B e 14B). Além disso, a IL-20 aumentou a activação de ERK1 /2 em ambas as células EJ (Figura 13A e 13B) e 253J. Activação de JAK2, JAK3, Stat2, e Stat5 foi detectada em células 253J IL-tratadas com 20 (Figura 14a). O tratamento com IL-20 estimulou a activação de JAK1, JAK2, Stat1, Stat2, e Stat5 em células EJ (Figura 14B). No caso de IL-28A, a activação de ERK1 /2 foi observada nas células 253J (Figura 13A), a activação de p38MAPK era sobre-regulada em células EJ (Figura 13B). O tratamento de células com IL-253J 28A induziu a activação de JAK2, JAK3, Stat3, e Stat5 (Figura 14A). Além disso, a activação de JAK2, Stat1, e Stat3 foi induzida pelo tratamento com IL-28A em células EJ (Figura 14B). No entanto, a activação AKT não foi influenciada de IL-5-, IL-20, e as células cancerosas da bexiga tratados com IL-28A (Figura S5A e B).
(A, B) As células foram incubadas em IL -5, IL-20, e IL-28A (100 ng /mL) durante os tempos indicados, e foram, então, colhidas, lisadas e sujeitas a análise de imunomarcação para os níveis de activação de MAPK, utilizando anticorpos específicos.
(a, B) as células foram tratadas com IL-5, IL-20, e IL-28A (100 ng /mL) durante os tempos indicados, e foram depois colhidas. Os níveis de ativação de Jak-Stat foram detectados por análise de imunotransferência utilizando anticorpos específicos.
Discussão
Muitos estudos têm utilizado a expressão gênica profiling de cancro da bexiga urinária usando microarrays. Estudos anteriores que envolvem a análise de perfis de expressão de genes têm-se centrado sobre a proliferação celular, regulação do ciclo celular, replicação e reparação do ADN, a apoptose, a transdução de sinal, factores de transcrição, a angiogénese, a adesão celular, curas de feridas, e o citoesqueleto. No presente estudo, os padrões de um número de genes clássicos relacionadas com tumores de expressão (por exemplo, VEGF, PGF, FGF18, AKT, E2F1, ATF5) dentro nosso conjunto de dados de microarray foram detectados como previsto. A análise de agrupamento hierárquico sugeriu que muitos genes podem participar em redes de regulação envolvendo os vários sistemas biológicos que são necessários para o desenvolvimento de cancro da bexiga. No entanto, pouco se sabe sobre as citocinas inflamatórias ou imunológicas associadas envolvidas no desenvolvimento de cancro da bexiga urinária humana.
Com base nos resultados do presente conjunto de dados microarray, nós determinamos as diferenças nos padrões de expressão de genes responsivos imunes entre normal e CINM. Dez (10) genes (Tabela 2) foram up-regulada com base em seus padrões de expressão gênica em MIBC, em comparação com amostras de mucosa normal, sugerindo que estes genes up-regulamentados estão intimamente ligados com o desenvolvimento de câncer de bexiga. Na primeira fase do estudo, a partir destes 10 genes que encontramos 3 principais citocinas, IL-5, IL-20, e IL-28A, os quais participam na migração, invasão e expressão de MMP, sem afectar a proliferação celular, o que indica um programa coordenado cluster para permitir a progressão da CTP, conforme determinado pela migração em cicatrização de feridas, ensaio de invasão, zimografia, os níveis de proteína, e os níveis de actividade de EMSA. Além disso, também se identificaram que MAPK e sinalização Jak /Stat são activadas em células cancerosas da bexiga seguindo tratamento com IL-5, IL-20, e IL-28A.
IL-5 foi originalmente identificado como um t -cell substituindo o factor (TRF), e foi subsequentemente encontrado para regular a activação, proliferação e sobrevivência de eosinófilos [33]. IL-5 também tem provado ser um regulador importante para a diferenciação de células B de ratinho [34]. do receptor de IL-5 é um heterodímero composto de a- e p-subunidades. A subunidade α é específica do ligando (IL-5Rα), enquanto que a subunidade β-(βc) é comum a IL-3 e IL-5 [33], [34]. Estudos anteriores têm demonstrado que a IL-5 activado Lyn [35], Jak2 /Stat1 [36], MAPK [35], a Syk [37], e PI3K [38] em eosinófilos. A activação de Jak2, tirosina-quinases Btk, PI3K, Shc, Vav, e HS1was associada com a proliferação induzida por IL-5 de células B [39]. O promotor de IL-5 continha factores de transcrição essenciais, incluindo SP1, E12 /E47, Oct-2, e C /EBP p em células B e eosinófilos [40]. O uso de vacinas rBCG para o tratamento de carcinomas da bexiga não produzem citocinas Th-2, incluindo a IL-tipo 5 níveis [41]. No presente estudo, tanto a IL-5 e IL-5Rα foram detectados por RT-PCR e imunotransferência em células cancerosas da bexiga. Também identificamos a ativação de ERK1 /2, p38MAPK, JNK, JAK1, JAK2, JAK3, Stat1, Stat2 e Stat3 em células de cancro da bexiga. A nossa observação nesta experiência é consistente com um recente relatório mostrando que os níveis circulatórios de IL-4, IL-5 e IL-10 foram significativamente mais elevados no cancro da bexiga de soro de paciente do que em amostras normais [19]. Assim, os aumentos nos níveis de IL-5 níveis neste estudo pode ser responsável pelo desenvolvimento aumentado de células de tumor da bexiga e da sua incapacidade de ser reconhecido por inflamatória.
IL-20, a citocina inflamatória pleiotrópica, é encontrado em queratinócitos e identificado como um membro da família das citocinas IL-10, que inclui IL-10, IL-29, IL-20, IL-22, IL-24 e IL-26 [42], [43]. IL-20 estimula os sinais através de 2 complexos heterodiméricos alternativos, que consistem quer de IL-20R1 e IL-20R2 ou IL-22R1 e IL-20R2 [42], [43]. Os resultados do presente estudo mostrou expressão de IL-20 e IL-20R1 em células de cancro da bexiga. No que respeita à sinalização, induzida por IL-20 de activação de Stat3 em queratinócitos [42]. Um relato anterior mostrou que a activação de MAPK, tais como ERK1 /2, p38 MAPK e JNK, em células HUVEC tratados com IL-20 [44]. IL-20 também induziu um tratamento de activação a Jak2 /Stat3 e ERK1 /2 via em células de glioblastoma GBM8901 [45]. Os resultados a partir de células cancerosas da bexiga indicam que a IL-20 induzida por activação de ERK1 /2 e Jak1, Jak2, Jak3, Stat1, Stat2, e Stat5. Além disso, a IL-20 é associado com várias doenças inflamatórias [45], [20], incluindo psoríase, artrite reumatóide, insuficiência renal, lesão cerebral, e aterosclerose.