Abstract

O fulvestrant (ICI-182780) foi recentemente mostrado para reprimir eficazmente o crescimento de células de câncer de próstata

in vitro

e

in vivo

. Mas é claro se microARNs desempenhar um papel na regulação da expressão do oncogene no cancro da próstata tratados com fulvestrant. Aqui, este estudo relata

HSA-miR-765

como o primeiro-driven fulvestrant, miRNA ERP-regulada exibindo atividades significativas supressores de tumor como fulvestrant, contra o crescimento de células de câncer de próstata através do bloqueio da progressão do ciclo celular no G2 /M de transição, e a migração celular e invasão possivelmente através da redução da formação de fibras de stress-filopios /intensa. Fulvestrant mostrou upregulate

expressão hsa-miR-765

através do recrutamento de ERP ao 5′-regulamentar-região de

hsa-miR-765

. HMGA1, uma proteína oncogénica em cancro da próstata, foi identificada como um alvo a jusante de

HSA-miR-765

e fulvestrant em experiências à base de células e de um estudo clínico. Tanto o anti-estrogénio e a expressão da proteína HMGA1

hsa-miR-765

imitam suprimida. Num estudo de neo-adjuvante, os níveis de

HSA-miR-765

foram aumentadas e expressão HMGA1 foi quase completamente perdido em amostras de cancro da próstata em doentes tratados com uma dose única (250 mg) de fulvestrant 28 dias antes da prostatectomia . Estes resultados revelam uma cascata de sinalização romance fulvestrant envolvendo regulação positiva da transcrição ERP mediada por

hsa-miR-765

que suprime a expressão da proteína HMGA1 como parte do mecanismo subjacente à acção supressora de tumor de fulvestrant no câncer de próstata.

Citation: Leung YK, Chan QK-Y, Ng CF, Ma FM-T, Tse HM, a KF, et al. (2014) HSA-miRNA-765 como um mediador-chave para inibir o crescimento, migração e invasão no câncer de próstata fulvestrant-tratada. PLoS ONE 9 (5): e98037. doi: 10.1371 /journal.pone.0098037

editor: Jindan Yu, da Universidade Northwestern, Estados Unidos da América

Recebido: 21 Janeiro, 2014; Aceito: 28 de abril de 2014; Publicado em: 16 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Leung et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado por Hong Kong Fundo University Grant Conselho-Geral de Investigação (M469107 para KML) e da Universidade chinesa de Hong Kong directos Investigação (CU2041252 e CU2041563 para KML), um Veterans Affairs Merit Award (I01BX000675 a SMH) e doações de Institutos Nacionais de saúde (ES019480, ES020956, ES015584, ES006096, CA112570, CA015776 a SMH) e uma subvenção do Programa de Estudos Investigator-patrocinados da AstraZeneca (a JM). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Dr. Jodi Maranchie recebeu o Programa de Estudos Investigator-patrocinados da AstraZeneca. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O desenvolvimento normal e tumor maligno da próstata são regulados não só por andrógenos, mas também pelo estrogênio [1]. O β receptor de estrogénio (ER) é o receptor responsável principal expresso no epitélio da próstata e em várias fases do cancro da próstata (CaP), incluindo metástases ósseas [2], [3]. O estrogênio sintético dietilestilbestrol (DES), através da sua acção de privação de androgênio, era uma vez o tratamento de primeira linha para CaP metastático [1], [4]. DES, eventualmente perdido favorável devido à sua alta toxicidade e tromboembólica risco cardiovascular [5], [6], com parentérica estradiol-17β (E2) a ganhar popularidade recente como uma terapia para metastático, resistente à castração CaP (CRPC) [7], [ ,,,0],8] por causa do seu perfil de toxicidade cardiovascular baixo e acção protectora contra a osteoporose [9]. Outros moduladores selectivos de ER (por exemplo, tamoxifeno, toremifeno, e reloxifene) têm sido investigados em ensaios clínicos, mas verificou-se ter uma eficácia limitada quando comparada com DES [10] – [13]. Com a aprovação em 2005 de fulvestrant (ICI 182,780), um antagonista do receptor de estrogénio puro sem acção agonista conhecido, para o tratamento de câncer de mama metastático receptor-positivo, o interesse na sua utilização para CRPC surgiu.

Na pré-clínico modelos, fulvestrant demonstrou características de uma terapia promissora para CaP. Num modelo de CaP induzida por estrogénio [14] – [17], fulvestrant impediu a evolução das lesões pré-cancerosas, inverteu o transcriptoma-E2 induzido [16], [17], e induziu a sua própria assinatura de genes [16]. Em DU145, uma linha de células CaP humana que expressa ERP e nenhum ERa, fulvestrant suprimiu o crescimento celular através do receptor [18] e regulamentado um conjunto único de genes, possivelmente através de cross-talk entre ERP e NFkB [19]. Além disso, o fulvestrant suprimiu o crescimento de DU145 e PC-3 xenoenxertos através de uma via mediada por RpE KLF5 sinalização [20] e o crescimento das células LNCaP também inibida pela regulação negativa do receptor de androgénio [21].

Na única fase II estudo de fulvestrant conduzido até agora [22], 20 pacientes CRPC receberam um regime de dose de carregamento (500 mg no dia 0 e, em seguida, 250 mg no dia 14, dia 28, e depois mensalmente). Após seis meses de tratamento, o fulvestrant foi bem tolerado, embora nenhuma resposta clínica ou PSA favorável foi observada [22]. No entanto, aumentando a dose de carga durante o primeiro mês (500 mg a cada 14 dias), o nível de PSA foi reduzido eficazmente por 40-99% dentro 0.27-2.67 meses em seis das sete pacientes CRPC altamente pré-tratados sem qualquer toxicidade óbvia [23 ]. Esta última descoberta dá apoio à realização de mais pesquisas em otimização de dose, e em profundidade estudos sobre os mecanismos de fulvestrant como uma terapia para CaP.

Os microRNAs (miRNAs) são pequenas (17-25 nucleotídeos) RNAs não-codificantes que regulam expressão gênica pós-transcricional. Cada miARN pode ligar-se a uma ou mais sequências alvo no-3 ‘não traduzida da região seus transcritos alvo e provocam a degradação de ARNm ou supressão da tradução da proteína, dependendo do grau de emparelhamento de bases complementar [24]. Uma única miARN normalmente regula a expressão de um grande número de transcritos [25] – [27]. expressão aberrante de miRNAs específicos confere uma vantagem de crescimento às células cancerosas mais células normais por perturbar múltiplas vias oncogénico /supressor de tumor. miARNs CaP específicas foram identificadas-[28] – [30], e alguns estão relacionadas com androgénio [31]. Até à data, no entanto, nenhum miRNA tem sido associada a estrogénios ou antiestrogenos em CaP.

Aqui, nós examinamos o papel de miRNA em mediar a ação de fulvestrant no CaP. profiling global de expressão miRNA em células DU145 identificados

hsa-miR-765

como um miRNA-regulado fulvestrant. As análises promotor definido uma sequência mínima na região 5′-regulação da

HSA-miR-765

que recruta ERP e que é fundamental para a regulação fulvestrant. Os efeitos dos miARN no crescimento CaP celular, migração e invasão foram comparados com aqueles de fulvestrant. A dependência das ações de fulvestrant no ERP foi demonstrada por experiências knockdown. A mudança na expressão de

HSA-miR-765

e a sua proteína oncogénica jusante, grupo de alta mobilidade AT-1 gancho (HMGA1), foi avaliada em amostras de prostatectomia obtidos a partir de pacientes depois de terem sido tratados com fulvestrant para um mês.

Materiais e Métodos

tratamento fulvestrant

DU145 e linhas celulares PC3 foram adquiridos da ATCC (Manassas, VA). células DU145 (ATCC) foram mantidas como descrito anteriormente [18]. células PC3 (ATCC) foram cultivadas em RPMI 1640 com FBS inactivado por calor a 10% (hiFBS). A identidade de cada linha celular foi recentemente autenticado pela ATCC usando método de repetição de perfil curta em tandem. Todas as células foram mantidas em meio hiFBS despojado-carvão a 5% durante 24 h antes do tratamento droga. As células foram tratadas com 10

-6 M fulvestrant em 0,1% ou 0,1% de etanol. culturas de controlo foram tratados apenas com veículo.

Mirna e expressão gênica

Para miRNA perfil, RNAs totais foram extraídos e rotulados diretamente usando o rápido Labeling Sistema NCode (Invitrogen, Grand Island, NY) e formado no NCode miARN humano Microarray V3 (Invitrogen).

a expressão tecidual de miARN foi estudada através da extracção de ARN totais de criocortes (5-10 ^ M) usando RNAzol RT (Molecular Research Center, Cincinnati, OH), poli (a) -tailed e reversamente transcrito com o iniciador universal de RT utilizando o kit de ADNc de primeira cadeia NCode microARN (Invitrogen). PCR em tempo real foi realizada com SYBRGreen PCR Master-Mix (Invitrogen) usando o

hsa-miR-765 U6

específico ou spliceosomal RNA nuclear pequeno (RNU6) espec�ico qRT frente primário (Tabela S2) e um reversa universal qPCR iniciador (Invitrogen).

Os ARNs totais foram preparados com hexâmero aleatório (Invitrogen). proteína ribossomal 3 (RPS3, Tabela S2) foi utilizado como o controlo de arrumação. expressão gênica relativa foi determinada pelo

método de T [32] ΔΔC.

espécimes clínicos

Os pacientes com diagnóstico histológico de, clinicamente localizada CaP receberam uma única injeção intramuscular de 250 mg de fulvestrant , 28 dias antes de uma prostatectomia radical retropúbica programado. Os pacientes eram excluídos se tivessem um glóbulo branco contagem 3.000 /l, uma contagem de plaquetas 100.000 /mL, hemoglobina 11 g /dl, INR 1,6, ou bilirrubina AST ou níveis de creatinina 1,5 vezes superior limite do normal. Os pacientes também foram excluídos se necessário corticosteróides para o tratamento de outras doenças sistêmicas ou tiveram uma história de insuficiência cardíaca congestiva, angina ativa, infecção ou neoplasia ativa. Todos os indivíduos tinham uma soma final de Gleason de 6 ou 7 na prostatectomia. Espécimes de pacientes não tratados com uma soma Gleason semelhante e todas as amostras de pacientes tratados com fulvestrant foram obtidos a partir da Universidade de Massachusetts Medical School (UMMS) sob um protocolo (PI. Dr. Maranchie) aprovado pelo Comitê para a Proteção dos Sujeitos Humanos em Pesquisa e Institucional Review Board na UMMS. Todos os indivíduos forneceram consentimento informado para participar neste estudo e que foram de-identificados.

Knockdown de RpE

siRNAs para ERP ou embaralhar siRNA (Invitrogen) foi transfectado em células DU145 (2 × 10

5) utilizando X-tremeGENE (Roche, Indianapolis, IN). As células tratadas com siRNA foram tratados quer com fulvestrant ou etanol durante mais 2-4 dias e, em seguida, submetido a em tempo real de RT-PCR, a análise de actividade de promotor, ensaio de crescimento celular, e a coloração de F-actina.

5 “região -regulatory analisa

A 5 ​​’regiões genômicas montante de

hsa-miR-765

precursor (Chr1:. 156,906,923-156,906,036 adesão não NC_000001.10) -3.208-100 foi amplificado e clonado no pGL3-basic (Promega, Madison, WI) como o

pGL3-HSA-miR-765

. deleções em série a partir da extremidade 5 ‘da sequência clonada no vector foram conduzidos para gerar pb pGL3-miR-765-Δ1192 (sequência de ADN -2.016-100), pGL3-miR-765-Δ1766 pb (sequência de ADN a partir de – 1442-100), pGL3-miR-765-Δ2414 pb (sequência de ADN a partir de -792 a +100), pGL3-miR-765-Δ2618 pb (sequência de ADN a partir de -590 a +100), pGL3-miR-765- Δ2972 pb (sequência de ADN a partir de -236 a +100), e pGL3-pb de miR-765-Δ3113 (sequência de ADN a partir de -95 a +100). atividades repórter de outros vetores truncadas ou mutantes, no células DU145 foram determinados com ou sem fulvestrant e /ou ERP siRNA knockdown usando o sistema de ensaio de repórter de luciferase duplo (Promega).

Mirna alvo repórter ensaio

células DU145 foram transfectadas com vector repórter de luciferase PMIR-miR-765 que foi clonado com sequência complementar de miR-765 HSA-perfeito como o miR-765-alvo e, em seguida, tratados quer com HSA-miR-765 mímico-controlo negativo ou mímica. Os lisados ​​foram submetidos ao ensaio de repórter de luciferase duplo. A região 3′-translacional de

Grupo de Mobilidade alta AT-hook 1