Abstract

Fundo

Os fatores de crescimento ativando os receptores ErbB foram descritos em tumores da próstata. A linha celular de cancro da próstata dependentes de androgénio, LNCaP, expressa as tirosina-quinases, ErbB-1 do receptor de erbB-2 e ErbB-3. Anteriormente, foi demonstrado que a NRG activa erbB-2 /ErbB-3 heterodímeros para induzir a morte de células LNCaP, que, EGF activa ErbB-1 /ErbB-1 ou ErbB-1 /erbB-2 dímeros para induzir o crescimento e sobrevivência celular. Foi também demonstrado que os inibidores de PI3K reprimido essa morte celular sugerindo que, em células LNCaP andrógeno privados, NRG ativa uma via dependente de PI3K associada à morte celular.

Metodologia /Principais Achados

No presente estudo demonstram que induz NRG autofagia em células LNCaP, usando LC3 como um marcador. No entanto, a autofagia induzida pela NRG pode ser incompleta já que os níveis de p62 elevar. Também demonstramos que a autofagia induzida NRG- é independente do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) inibição desde NRG induz Akt e S6K ativação. Curiosamente, a inibição de espécies reactivas de oxigénio (ROS) pela

N

-acetylcysteine ​​(NAC), inibiu-induzida NRG autofagia e morte celular. Nosso estudo também identificou JNK e beclin 1 como componentes importantes na autofagia induzida NRG e morte celular. NRG elevação induzida na fosforilação de JNK, que foi inibido por NAC. Além disso, o inibidor de JNK inibe a autofagia-NRG induzida e a morte celular. Além disso, em células que sobre-expressam Bcl-2 ou as células que expressam ARN-SH contra um beclin, os efeitos de NRG, nomeadamente a indução de autofagia e morte celular, foram inibidas.

Conclusões /Significado

Assim , em células de LNCaP, NRG-induz autofagia incompleta e a morte das células que dependem de níveis de ROS. Estes efeitos da NRG são mediados por via de sinalização que ativa JNK e beclin 1, mas é independente da inibição da mTOR

Citation:. Schmukler E, Shai B, Ehrlich M, Pinkas-Kramarski R (2012) Neurorregulina Promove incompleto autofagia de células cancerosas da próstata que é independente da mTOR via de inibição. PLoS ONE 7 (5): e36828. doi: 10.1371 /journal.pone.0036828

editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Itália |

Recebido: 05 de janeiro de 2012; Aceito: 06 de abril de 2012; Publicado em: 14 de maio de 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Schmukler et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Israel Science Foundation (concessão No. 732/08), pelo Ministério da Saúde Israel (concessão No. 3942), pela Associação Cancer Israel (concessão No. 4.914.422) e pelo Fundo de pesquisa do cancro da próstata Kauffman. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

prostática carcinoma é um dos cancros mais comuns do sexo masculino. o crescimento de células da próstata é regulado por hormonas, factores de crescimento e os seus respectivos receptores. Entre o grupo mais frequente de receptores implicados em cancros humanos, é a subfamília de ErbB de receptores tirosina-quinase [1], [2], [3]. Esta família inclui quatro receptores ErbB-1-erbB-4. Considerando ErbB-1 receptor (conhecido como receptor do factor de crescimento epidérmico, EGFR), é activado por EGF e ligandos de EGF-semelhantes, ErbB-3 e ErbB-4 receptores são activados pela NRG isoformas /neuregulina e receptor de erbB-2 não tem qualquer ligando conhecido [4]. Estes receptores são expressos no epitélio da próstata, ao passo que, ErbB-1 ligandos são expressos no estroma e NRGs são expressos no estroma e no epitélio secretor basal e [5].

Activação de ErbB-1 sinalização por EGF e factores de crescimento do tipo EGF desempenha um papel importante na proliferação de células de cancro da próstata e a adição de EGF a culturas de células de cancro da próstata estimula o seu crescimento [6]. Além disso, a sobre-expressão de ErbB-2 é um evento comum que parece conferir uma vantagem selectiva a diversos tipos de carcinomas incluindo o cancro da próstata [3], [7]. Normalmente, erbB-2 é expressa em células epiteliais da próstata [7], [8]. Maiores níveis de erbB-2 em comparação com tecidos normais foram observados em tumores prostáticos [9], [10]. Além disso, a sobre-expressão de erbB-2 e ErbB-3 tem sido implicada na transformação neoplásica de cancro da próstata [11]. Embora o papel exato desses oncogenes e fatores de crescimento no carcinoma de próstata ainda não é claro, sobre-expressão de ErbB-1 e erbB-2 tem sido relacionada com mau prognóstico e metástases à distância [12].

A autofagia, um processo de volume de negócios regulados de constituintes celulares, é importante para o controle do crescimento normal, mas pode estar com defeito em doenças [13], [14]. Sob nutrientes ou factores de crescimento condições limitadas, este processo é essencial para manter a produção de energia para a sobrevivência celular [15]. Autophagy também pode servir como um mecanismo pelo qual as células se livrar de organelos defeituosos e reciclar proteínas [16]. Por outro lado, pode levar a autofagia tipo não-apoptótico de morte celular (tipo II morte celular) desempenhando um papel na morte de desenvolvimento celular e a morte de estímulos tóxicos [17].

A formação de autofagossomas é controlada por várias proteínas ATG. Atg8 proteína (o homólogo humano é MAP-LC3) está associada com a membrana autophagosomal e serve como um marcador para a formação autophagosome [18]. Formação do autophagosome também requer classe III de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) [19]. Autophagy mediada por PI3K depende da interacção da proteína com este último atg6, dos quais beclin 1 é o homólogo humano [20]. Beclin 1 foi mostrado que actua como um gene supressor do tumor por meio do controle do processo de autofagia [21]. A sua interacção com a proteína anti-apoptótica de Bcl-2 [22] inibe a autofagia [23]. A regulação negativa da proteína Bcl-2 aparentemente pode promover autofagia [24], sugerindo que a autofagia beclin 1-mediada pode ser inibida pela sua interacção com Bcl-2. Mais recentemente, vários estudos identificaram o domínio interactuante de Bcl-2 em beclin 1 (um domínio BH3) [25], [26], [27].

Estudos anteriores demonstraram que a NRG (ErbB3 e ErbB4 ligando) inibe o crescimento das células de cancro dependentes de androgénio da próstata LNCaP quando cultivadas em meio completo [28] enquanto que na ausência de androgénio, NRG induziu a morte de células LNCaP [29]. Curiosamente, o inibidor de PI3K (3-metiladenina), que também inibe a autofagia, inibiu a morte celular induzida por NRG, sugerindo que NRG podem induzir a morte celular nessas células autophagic [29]. No presente estudo, nós dirigida a hipótese de que medeia NRG autofagia em células LNCaP e estudado as vias de sinalização que medeiam autofagia NRG induzida e a morte celular. Ao utilizar LC3 como um marcador, que demonstram que aumenta os níveis de NRG LC3-II. No entanto, os níveis de proteína p62 /SQSTM1 mutada, que se ligam e LC3 é degradado por autofagia [30], não foram reduzidas por tratamento NRG, indicando que a autofagia induzida pela NRG é incompleta.

também demonstram que a inibição de espécies reactivas de oxigénio (ROS) por

N

-acetylcysteine ​​(NAC) inibe a autofagia NRG-mediada e morte celular. Os nossos resultados indicam que a NRG activa classe I de PI3K, AKT, mTOR e pS6K via, uma via inibitória autofagia conhecida, o que não é inibido por NAC. Além disso, foi demonstrado que a activação de JNK NRG induz, a qual é inibido por NAC. Além disso, o inibidor da JNK, beclin um silenciamento e Bcl-2 sobre-expressão, inibiu autofagia-NRG induzida e a morte celular. Assim, propomos um modelo pelo qual a autofagia e morte celular de células LNCaP NRG-induzida envolvem beclin 1 e JNK vias de sinalização e é independente da via PI3K /Akt /mTOR sinalização inibição da via.

Resultados

NRG Induz Autophagy, que é inibida por 3-metiladenina (3-MA) ​​em células LNCaP

LNCaP é uma linha celular de carcinoma da próstata andrógeno-sensível que expressa os receptores ErbB [29]. Anteriormente, foi demonstrado que a NRG induz a morte celular que foi inibida por 3-MA, um inibidor de PI3K [29], e é independente de caspase (Não mostrado e [29]). Foi também demonstrado que a NRG induz alterações morfológicas em células LNCaP que foram inibidas por 3-MA (Vídeo S1 e [29]). No presente estudo, analisamos o efeito da NRG na autofagia e morte celular de células LNCaP cultivados sem mimética andrógeno. A fim de determinar a indução autofagia, utilizou-se proteína como um marcador LC3. Como mostrado na Figura 1A, as células LNCaP tratadas com NRG durante 14 h e 24 h, exibiu conversão de LC3-I lc3-II, que foi inibida por 3-MA melhorada, indicando que, de facto NRG induz autofagia em células LNCaP. Para demonstrar ainda mais a indução autofagia, utilizou-se células LNCaP que expressam estavelmente vector de expressão GFP-LC3. Como mostrado na Figura 1B, a NRG induzida formação autophagosome melhorada tal como reflectido por uma coloração melhorada pontuado de GFP-LC3. Como um controlo positivo, as células foram tratadas com rapamicina, que também induziu autofagia em células LNCaP (Figura 1B). Assim, as células LNCaP responder à NRG pelo aumento da indução autofagia. Para um estudo mais aprofundado autofagia induzida pela NRG, examinamos o nível de p62 /SQSTM1 expressão. A proteína p62 /SQSTM1 liga LC3-II e é degradado pela autofagia [30]. Surpreendentemente, o tratamento com a NRG não aumentou a degradação de p62, indicando que a autofagia induzida pela NRG pode ser incompleta. Como um controlo, as células foram tratadas com solução salina equilibrada de Earle (EBSS) e os níveis de LC3-II e p62 foram determinados por imunotransferência (Figura S1). Como mostrado, EBSS induzida elevação LC3-II e a degradação de p62 como esperado. De nota, tratamento reduziu os níveis de 3-MA LC3-II em células NRG tratados, bem como os níveis de p62 na ausência de NRG. A explicação para estes resultados são ainda desconhecidos.

células LNCaP (A) foram tratados com 100 ng neuregulina /ml (NRG) na presença ou na ausência de 10 mM de 3-metiladenina (3-MA) ​​durante o período de tempo indicado. Os lisados ​​de células inteiras foram preparados e submetidos a uma análise de imunotransf erência com anticorpos anti-LC3 e anti-p62.

Face superior,

resultados representativos.

Painel inferior,

análise densitométrica apresenta-se como a indução de dobragem ao longo das células não tratadas de controlo (n = 3; média ± D.P.; * p 0,05). células (B) LNCaP que expressam estavelmente LC3-GFP foram tratadas com 50 nM para a rapamicina ou durante a noite com 100 ng /ml NRG durante 5 h. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% e os núcleos foram coradas com bisdenzimide (Hoecsht 33258). A seguir à fixação e coloração, as células foram fotografados usando óptica de fluorescência Nikon microscópio de modelo TE-2000S (60 × ampliação).

Painel superior

, imagens representativas.

Painel inferior

, autofagia foi quantificada pela contagem dos pontos número LC3 por célula usando o software ImageJ. O resultado é mostrado representativos de duas experiências independentes. 70-80 células foram analisadas por tratamento; Dados apresentados como média ± SD (*

p Art 0,05)

induzida NRG Autophagy é incompleta

tratamento NRG induz a autofagia, mas também leva a um. aumentar os níveis de p62, o que indica que a autofagia induzida pela NRG é incompleta (Figura 1). Para confirmar ainda mais estes resultados, as células LNCaP que expressam de forma estável a proteína de fusão GFP-LC3 ou foram tratados com NRG durante 24 h ou incubadas com meio de EBSS durante várias horas. Os lisados ​​celulares foram coradas imunologicamente com o anticorpo anti-GFP para detectar os níveis de GFP LC3-I e II-LC3. Como mostrado na Figura 2A, tanto EBSS e NRG induzir autofagia, como julgado pelo aumento dos níveis de LC3-II-GFP em comparação com as células não tratadas. No entanto, em células incubadas com EBSS, níveis LC3-II-GFP diminui ao longo do tempo, ao passo que nas células tratadas com NRG os níveis de LC3-II-GFP é relativamente elevada, mesmo após 24 h de incubação. Além disso, na presença de bafilomicina-A

1 (inibidor de fusão autophagosome-lisossoma) a acumulação de LC3-II-GFP é significativamente mais elevada no EBSS células tratadas em comparação com as células NRG (Figura 2B) tratado. Tomados em conjunto, estes constatação indica que autofagia induzida NRG é incompleta.

células LNCaP (A) que expressam estavelmente LC3-GFP foram tratados com 100 ng /ml NRG durante 24 h ou incubadas com meio de EBSS durante o tempo indicado períodos. Os lisados ​​de células inteiras foram preparados e submetidos a uma análise de imunotransf erência com anticorpo anti-GFP. células (B) LNCaP que expressam estavelmente LC3-GFP foram tratados com 100 ng /ml NRG durante 24 h ou incubadas com meio de EBSS durante 2 e 4 horas. Os tratamentos foram realizados na presença ou ausência de 10 nM de bafilomicina-A1 (Bafilo-A1). Os lisados ​​de células inteiras foram preparados e submetidos a uma análise de imunotransf erência com anticorpo anti-GFP.

Painel superior

, blot representativo.

Painel inferior

, a análise densitométrica apresenta-se como a indução de dobragem ao longo das células não tratadas de controlo (gráfico da esquerda; *, P 0,05 e **, P 0,02 comparado com o controlo) ou como a diferença entre os valores medidos com ou sem 10 nM Bafilo-A1 em cada grupo (gráfico da direita; *, p 0,05 e ** p 0,02 em comparação com NRG tretment) (n = 3; significa ± SD)

. NRG induzida por autofagia e morte celular de células LNCaP é inibida pela redução das espécies reativas de oxigênio (ROS) Níveis

foi anteriormente demonstrado que a indução de autofagia depende da formação e acumulação de ROS [23], [31] [32], [33]. Portanto, para caracterizar o efeito de ROS em autofagia NRG-mediada e a morte celular, as células LNCaP foram estimuladas com NRG na presença ou na ausência do anti-oxidante geral

N

-acetylcysteine ​​(NAC) [34 níveis], e LC3 e p62 foram determinados por imunotransf erência (Fig. 3A). Pré-incubação com NAC inibiu completamente a elevação induzida por NRG LC3-II, o que indica que a autofagia NRG-induzida é ROS-dependente. Em seguida, examinamos se NAC pode proteger contra a morte celular induzida por NRG. As células LNCaP foram pré-tratados com NAC, com e sem tratamento NRG, e a viabilidade celular foi determinada utilizando o ensaio de coloração com azul de metileno. Como demonstrado na Figura 3B, a presença de NAC evitou a diminuição na viabilidade celular induzida por NRG. Dois métodos adicionais para a detecção da morte de células (ensaio de exclusão com corante Hoecsht e citometria de fluxo) suportado ainda mais esses resultados. NRG induzida morte celular aumentada, tal como evidenciado pelo aumento na população sub-G1 (Figura 3C) ou pela alta percentagem de células Hoecsht-positivos (Figura 3D). Esta morte celular foi marcadamente inibida por NAC. Além disso, o tratamento com NAC inibiu as alterações morfológicas induzidas NRG (S5). Por isso, os nossos resultados demonstram claramente que a NAC inibe a acumulação LC3-II, morte celular e alterações morfológicas induzidas pela NRG em células LNCaP.

células LNCaP (A) foram tratados com 100 ng /ml NRG com ou sem 10 mM

N

-acetylcysteine ​​(NAC) por 24 h. Os lisados ​​de células inteiras foram preparados e submetidos a uma análise de imunotransf erência com anticorpos anti-LC3 e anti-p62.

Painel esquerdo,

resultados representativos.

Painel direito,

análise densitométrica apresenta-se como a indução de dobragem ao longo das células não tratadas de controlo (n = 6; média ± D.P.; * p 0,05). (B) As células LNCaP foram testadas quanto à viabilidade celular utilizando o ensaio de coloração com azul de metileno. As células foram tratadas com 100 ng /ml NRG na presença ou na ausência de NAC 10 mM. ensaio de azul de metileno foi realizada 60 h depois. Os resultados são apresentados como% do controlo, e são a média ± D.P. de 4-6 determinações (** p 0,0001). Esta experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes. (C) As células LNCaP foram tratados com 100 ng /ml NRG com ou sem 10 mM de NAC. As células foram colhidas 60 h mais tarde e analisadas quanto ao seu teor de DNA por citometria de fluxo. A percentagem de células nas várias fases do ciclo celular é indicado. (D) As células LNCaP foram tratados com 100 ng /ml NRG na presença ou na ausência de NAC 10 mM, durante 60 h. As células foram coradas com o corante fluorescente bisbenzimida ADN (Hoecsht 33258, 1 ug /mL) para avaliar o número de células que morrem. Após coloração, as células foram fotografadas usando Olympus óptico invertido de contraste de fase microscópio modelo IX70 (20 × ampliação; barras de escala, 50 micrômetros).

Painel esquerdo

, imagens representativas.

Painel direito

, percentagem de células que morrem foi estimada pela contagem do número de células Hoecsht-positivos em comparação com as células número total em cada campo (10-15 campos para cada tratamento, 100-200 células por cada campo). Os resultados são apresentados como média ± SD (** p 0,0001)

induzida NRG LC3-II Elevação e morte das células LNCaP é independente da Akt /mTOR via de sinalização

a fim de determinar a via de sinalização que conduz a autofagia-NRG induzida e a morte celular, examinamos primeiro a via de sinalização de Akt /mTOR. células LNCaP expressar PTEN mutação que leva a activação de Akt [35], [36]. Akt activa mTOR, que é um regulador negativo de autofagia conhecido [37], [38]. Assim, foi razoável para examinar a fosforilação e activação destas proteínas. As células LNCaP foram tratados com NRG durante 24 h e a activação de Akt e mTOR foram examinadas utilizando anti-fosfo AKT e anticorpos anti-fosfo S6K. Como mostrado na Figura 4A, o nível basal de Akt fosforilada e S6K foi observado nas células de controlo não tratados, no entanto, o tratamento com a NRG aumentou o nível de fosforiladas Akt e S6K. NAC, que inibe a autofagia induzida por NRG, não teve efeito sobre os níveis de fosforilação de Akt nem nem S6K. Estes resultados podem sugerir que a autofagia induzida NRG é independente da inibição da mTOR. Para explorar ainda mais a via de sinalização envolvidos em autofagia-NRG induzida em células LNCaP, que examinaram a próxima activação de JNK e Erk, duas proteínas cinases activadas mitogénio conhecidos (MAPKs), que são componentes de sinalização a jusante de receptores ErbB [39]. Foram utilizados anticorpos anti-fosfo proteínas específicas para ERK1 /2 e JNK. Como mostrado na Figura 4, a NRG induzido um aumento da fosforilação de ERK1 /2 e JNK. NAC, que inibe a autofagia induzida por NRG, não teve efeito sobre a fosforilação Erk1 2 /, indicando que a activação de Erk não está envolvido na autofagia induzida NRG ou NAC que actua a jusante da activação de Erk. Por outro lado, a fosforilação de JNK foi fortemente reduzida na presença de NAC, indicando que a JNK podem ser um mediador potencial da autofagia induzida NRG.

células LNCaP (A) foram tratados com 100 ng /ml com NRG ou sem NAC 10 mM, durante 24 h. Os lisados ​​de células inteiras foram preparados e submetidos a uma análise de imunotransferência com os anticorpos indicados. Análise (B) densitométrica de várias repetições é apresentada como a indução de dobragem das células não tratadas de controlo. Os meios de intensidade de bandas foram padronizados em comparação com os sinais de proteínas totais não fosforilados (os dados são a indução de dobragem média ± SD; * p 0,05).

Uma vez que a fosforilação induzida NRG S6K, mas também induzida autofagia, nós próxima autofagia comparação induzida por inibição da mTOR à autofagia induzida pela NRG. O inibidor de mTOR, rapamicina, foi mostrado previamente para induzir autofagia por regular negativamente a actividade da mTOR [37], [40]. Descobrimos que o tratamento com rapamicina, bem como o tratamento NRG induzida autofagia, como julgado pelo aumento LC3-II /rácio LC3-I (Figura 5A e B) e por aumento da formação LC3 pontos lacrimais (Figura 1B). No entanto, como seria de esperar, S6K fosforilação foi aumentada após o tratamento com a NRG mas reduziu a seguir ao tratamento de rapamicina. Além disso, o tratamento com NAC inibiu autofagia induzida por rapamicina e NRG, no entanto, não teve efeito sobre a fosforilação induzida por NRG S6K. Curiosamente, o tratamento com rapamicina, embora o crescimento celular inibido [29], não teve nenhum efeito sobre a morfologia das células, enquanto NRG causou uma mudança morfológica dramática como descrito anteriormente [28], [29] e tal como demonstrado na Figura 5C e Figura S1 (redondas e isoladas células ). Estes resultados demonstram que a autofagia induzida NRG difere da autofagia desencadeada por rapamicina. Em seguida, examinou-se o efeito da co-tratamento com a NRG e rapamicina em autofagia-inducion em células LNCaP (Figura 5D). Como se mostra, o tratamento combinado induziu níveis mais elevados de LC3II sozinho, em comparação com cada tratamento, sugerindo que a rapamicina e NRG pode actuar através de diferentes vias de sinalização para induzir autofagia.

células LNCaP (A) foram tratados com 100 ng /mL NRG ou 50 nM de rapamicina (Rapa) durante 24 h, na presença ou na ausência de NAC 10 mM. Os lisados ​​de células inteiras foram preparados e submetidos a uma análise de imunotransf erência com anticorpos anti-LC3, anti-fosfo-S6K e anti-S6K. Análise (B) densitométrica dos resultados descritos em A é representada como a indução de dobragem do controlo de células não tratadas (n = 3, média ± D.P.). (C) Imagens representativas da morfologia celular após tratamentos com NRG e rapamicina são mostrados (Olympus, 20 × ampliação). (D) As células LNCaP foram tratados com 100 ng /ml NRG, 50 nM de rapamicina ou de ambos, durante 24 h. Os lisados ​​de células inteiras foram preparados e submetidos a uma análise de imunotransf erência com anticorpos anti-LC3. Esta experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes.

induzida NRG autofágica Cell Death em células LNCaP Depende JNK Activation

Porque via mTOR não está envolvido na autofagia induzida NRG e morte celular, temos procurado por outros mediadores possíveis. Nós escolhemos para analisar o envolvimento de JNK, uma vez que NRG fosforilação de JNK induzida, que foi inibido por NAC. Por isso, em primeiro lugar examinou o efeito do inibidor da JNK SP600125 em autofagia induzida NRG (Figura 6A). Como mostrado, na presença de autofagia SP600125, NRG-induzida foi inibido, tal como avaliado pela relação LC3-II /LC3-I diminuiu. No entanto, o tratamento SP600125 não teve efeito sobre os níveis de p62. Em seguida, examinou-se o efeito do inibidor de JNK sobre a viabilidade celular utilizando a exclusão de corante Hoecsht metileno e ensaios de coloração com azul (Fig. 6B e C, respectivamente). Como mostrado, na presença de inibidor de JNK, a morte celular induzida por NRG foi inibida; indicando que a activação de JNK por NRG pode ser importante para a indução de autofagia e morte celular de células LNCaP.

(A) As células LNCaP foram tratados com 100 ng /ml durante 24 NRG h com ou sem 20 uM SP600125. Os lisados ​​de células inteiras foram preparados e submetidos a uma análise de imunotransf erência com anticorpos anti-LC3, anti-p62, anti-p-JNK e anticorpos anti-JNK.

Painel esquerdo,

resultados representativos.

Painel direito,

análise densitométrica apresenta-se como a indução de dobragem ao longo das células não tratadas de controlo (n = 5; média ± D.P.; * p 0,05). (B) As células LNCaP foram tratados com 100 ng /ml NRG na presença ou na ausência de 20 uM SP600125 durante 60 h. As células foram coradas com o corante fluorescente bisbenzimida ADN (Hoecsht 33258, 1 ug /mL) para avaliar o número de células que morrem. Após coloração, as células foram fotografadas usando Olympus óptico invertido de contraste de fase microscópio modelo IX70 (20 × ampliação; barra de escala, 50 micrómetros).

Painel esquerdo

, imagens representativas são mostrados.

Painel direito

, percentagem de células que morrem foi estimada pela contagem do número de células Hoecsht-positivos em comparação com as células número total em cada campo (10-15 campos para cada tratamento, 100-200 células por cada campo). Os resultados são apresentados como a média ± D.P. (** p 0,0001). (C) As células LNCaP foram testadas quanto à viabilidade celular utilizando o ensaio de coloração com azul de metileno. As células foram tratadas com 100 ng /ml NRG na presença ou na ausência de 20 uM SP600125. ensaio de azul de metileno foi realizada 60 h depois. Os resultados são apresentados como% do controlo, e são a média ± D.P. de 4-6 determinações (** p 0,0001). Esta experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes.

beclin 1 é necessário para e-induzida NRG Bcl-2 confere resistência a autofagia e morte celular

beclin 1, um componente do a classe-III PI3K complexo, é um regulador principal de conhecido autofagia [41], [42]. Para determinar o envolvimento desta via na autofagia induzida NRG, as células LNCaP foram transfectadas com sh-beclin 1 ou controle mexidos vetores de expressão sh-RNA. Como mostrado na Figura 7A, o tratamento com a NRG autofagia aumentada nas células de controlo. No entanto, em SH-beclin 1 transfectadas, a NRG-autofagia mediada foi reduzida em comparação com as células de controlo. Estes resultados indicam que beclin uma proteína está envolvida na NRG autofagia mediada em células LNCaP.

(A) As células LNCaP foram transfectadas com um SH-beclin ARN (3 ug) ou controlo scrambled SH-ARN (3 ug) e incubadas em meio normal durante 72 h. As células foram então tratadas com 100 ng /ml NRG durante mais 24 h. Os lisados ​​de células inteiras foram preparados e submetidos a uma análise de imunotransf erência com anticorpos anti-anti-beclin 1 e LC3.

Painel esquerdo

, experiência representativa é mostrado.

Painel direito

, a quantificação dos resultados é mostrado. Os resultados são apresentados como a indução de dobragem em comparação com as células não tratadas de controlo (n = 3; média ± D.P.; * p 0,05). (B) ingénua ou Bcl-2-GFP expressando estavelmente células LNCaP foram tratados com 100 ng /ml NRG para os períodos de tempo indicados. Os lisados ​​de células inteiras foram preparados e submetidos a uma análise de imunotransf erência com anticorpos anti-LC3 e anti-Bcl-2 anticorpos.

Painel esquerdo

, blot representativo é mostrado.

Painel direito

, quantificação dos resultados apresenta-se como a indução de dobragem em comparação com as células não tratadas de controlo (n = 3; média ± D.P.; * p 0,05). (C) ingénua e Bcl-2-GFP expressando estavelmente células LNCaP foram testadas quanto à viabilidade celular utilizando o ensaio de coloração com azul de metileno. As células foram tratadas com 100 ng /ml NRG e o ensaio de azul de metileno foi realizada 60 horas mais tarde. Os resultados são apresentados como% do controlo, e são a média ± D.P. de 4-6 determinações (** p 0,0001). Esta experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes.

Os membros da família Bcl-2, anti-apoptótica foram mostradas anteriormente para inibir a actividade promotora de autofagia beclin 1 [23]. Também demonstrou-se que durante a autofagia a interacção entre proteínas Bcl-2 e anti-apoptóticos beclin 1 é inibida. Assumindo que beclin 1 está envolvido na autofagia-NRG induzida e a morte celular, a hipótese de que a sobre-expressão de Bcl-2 iria proteger as células LNCaP de autofagia-NRG induzida e a morte celular. Deste modo, o próximo examinou o efeito de Bcl-2-GFP sobre-expressão em autofagia NRG-mediada de células LNCaP (Figura 7B). Como mostrado, a autofagia em células LNCaP naive foi aumentada após 16 h e 24 h de tratamento com a NRG, enquanto que em células LNCaP que sobre-expressam de forma estável a Bcl-2-GFP, NRG tratamento não teve efeito sobre os níveis de indução autofagia. Além disso, a Bcl-2-GFP sobre-expressam as células LNCaP foram resistentes à morte celular induzida por NRG em comparação com células LNCaP naive (Fig. 7C). Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem fortemente que, além de ativação de JNK, beclin 1 é também essencial para o processo de autofagia promovido pela NRG.

Discussão

cancros da próstata geralmente começam como lesões andrógeno-sensíveis, mas freqüentemente se desenvolvem em lesões andrógeno-insensitive com a progressão para estágios avançados. A linha celular dependente de androgénio LNCaP expressa elevados níveis de erbB-2 e ErbB-3 em relação a outras células de cancro da próstata humanos [28]. Além disso, estas células não expressam a NRG mas que expressam TGF-α e EGF, que podem funcionar como activadores autócrinos do EGFR [28]. Anteriormente, demonstrou-se que em células LNCaP crescidas sem mimético de androgénio, NRG, mas não o EGF induz a morte celular. Este efeito de NRG na morte celular é mediada pelo erbB-2 /ErbB-3 heterodímeros [29]. Também foi demonstrado que a morte celular induzida pela NRG é inibida por inibidores de PI3K, indicando que NRG podem induzir a morte celular autophagic [29]. No presente estudo, nós demonstramos pela primeira vez que, de facto induz NRG autofagia em células LNCaP, utilizando dois ensaios: análise de imunotransf erência com anticorpos anti-LC3 e análise microscópica de coloração LC3-GFP em células LNCaP. Este efeito de NRG também foi inibida por 3-MA. No entanto, a autofagia induzida pela NRG é incompleta, uma vez não foi detectada qualquer degradação da proteína p62 após o tratamento NRG. Assim, NRG activar heterodímeros ErbB2 /ErbB3 induz autofagia incompleta e morte celular em células LNCaP.

espécies reactivas de oxigénio (ROS) foram implicados nas vias de sinalização iniciada por receptores tirosina-quinase, incluindo os receptores ErbB [43], [ ,,,0],44]. Vários linha de evidência demonstra que as espécies reactivas de oxigénio (ROS) desempenham um papel na autofagia. Em primeiro lugar, ROS são necessários para a autofagia induzida pela fome, aparentemente devido a regulação da atividade Atg4 [32]. Em segundo lugar, ROS si só podem induzir autofagia em certas linhas de células [31], [45]. Os nossos resultados indicam que a autofagia induzida NRG é sensível a níveis de ROS, uma vez que na presença do antioxidante NAC geral, a NRG-induzida autofagia e morte celular foram inibidas.

foi anteriormente demonstrado que mTOR serve como um negativo regulador de autofagia por suprimir a actividade de Atg13 /Atg1 complexo [46]. Assim, factores de crescimento e certas hormonas exercem o seu efeito anti-autophagic através da activação da via de classe I de PI3K /Akt /mTOR [47]. Por outro lado, os estímulos pró-autofágicos, tais como nutrientes e tratamento de rapamicina fome, conduzem à inactivação de mTOR seguido por indução autofagia. De facto, a inibição da mTOR por rapamicina induzida autofagia em células LNCaP. Nas mesmas células, os nossos resultados demonstram que a NRG induz a activação de mTOR, como é evidente pela fosforilação de S6K, e o seu regulador a montante Akt. Além disso, foi anteriormente demonstrado que induz a NRG ErbB2 /ErbB3 formação de heterodímero e activação de PI3K de classe I em células LNCaP [28]. Tomados em conjunto, parece que NRG activa uma via de sinalização anti-autophagic, ou seja, a /classe I de PI3K /Akt via ErbB /mTOR e ainda promove a indução autofagia em células LNCaP. NAC, que bloqueia completamente a autofagia induzida NRG, não afectou a fosforilação de Akt nem nem S6K. Por isso, sugerimos que a autofagia induzida NRG é independente da inibição da mTOR.

NRG induz a ativação de várias vias de sinalização. foi anteriormente demonstrado que em células LNCaP, NRG activa entre outras vias de sinalização, também as cinases de MAP: Erk, p38, JNK e as vias de PI3K [28]. Buscou-se seguir a via de sinalização que conduz a NRG autofagia induzida e a morte celular. Os nossos resultados indicam que a JNK está envolvida em autofagia-NRG induzida e a morte celular. Na verdade, o corpo crescente de evidência existe sobre o papel da JNK como um mediador da indução de autofagia na sequência de vários estímulos [48], [49], [50]. De acordo com estes resultados, mostramos que JNK fosforilação aumenta após o tratamento NRG em células LNCaP. Nós também descobrimos que NAC, um inibidor da autofagia induzida NRG e morte celular, blocos de fosforilação de JNK. Tomados em conjunto, sugerimos que JNK medeia o efeito pró-autofágica de NRG. Com efeito, na presença de SP600125 inibidor da JNK, a NRG-induzida morte celular e autofagia foram inibidas.

A nucleação e montagem do autophagosome requer a activação de classe-III PI3K complexo, que é composta da PI3K (vps34 ), vps15, atg14 e atg6 (beclin 1 em células de mamífero) [19], [20]. autofagia beclin 1-mediada é regulada negativamente pela sua interacção com BCL-2 anti proteínas apoptóticas.