células

Abstract

Tetraplóide (4 N) são considerados importantes no câncer porque eles podem exibir aumentou tumorigenicidade, a resistência às terapias convencionais, e são acreditados para ser precursores de toda aneuploidia cromossômica. Portanto, é importante para determinar como as células cancerosas tetraploid surgem, e como orientá-las. P53 é uma proteína supressora de tumor e regulador chave da tetraploidia. Como parte do “ponto de verificação tetraploidia”, p53 inibe a proliferação de células tetraplóides através da promoção de uma G1-prisão em células tetraplóides incipientes (referida como uma paragem em G1 tetraplóides). Nutlin-3a é um medicamento pré-clínico, que estabiliza p53, bloqueando a interacção entre p53 e MDM2. No estudo actual, nutlin-3a promoveu uma paragem em G1 tetraplóide dependente de p53 em dois clones diplóides da linha celular de cancro do cólon HCT116. Ambos os clones foram submetidos a endorreduplicação após remoção nutlin, dando origem a clones tetraplóides estáveis ​​que mostraram um aumento da resistência à radiação (IR) e cisplatina (CP) de apoptose induzida por ionizante em comparação com os seus precursores diplóides. Estes resultados demonstram que a activação de p53 por nutlin transiente pode promover a formação de células tetraplóides a partir de precursores diplóides e tetraplóides as células resultantes são a terapia (IR /CP) resistente. Mais importante, os clones seleccionados tetraplóides após o tratamento nutlin expressa aproximadamente duas vezes mais

P53

e

MDM2

ARNm como precursores diplóides, expressa aproximadamente duas vezes mais complexos de proteína p53-MDM2 (por co-imunoprecipitação) , e foram mais susceptíveis à apoptose e paragem de crescimento dependente de p53 induzida por nutlin. Com base nestes resultados, propomos que o p53 desempenha novos papéis, tanto na formação e orientação das células tetraplóides. Especificamente, propomos que 1) de activação de p53 transiente pode promover uma captura tetraplóide-G1 e, como resultado, pode inadvertidamente promover a formação de células tetraplóides resistente à terapia, e 2) células tetraplóides resistente à terapia, em virtude de ter maior

p53

número de cópias do gene e expressar o dobro de complexos p53-MDM2, são mais sensíveis à apoptose e /ou a paragem do crescimento por MDM2 antagonistas anti-cancro (por exemplo nutlin)

citação:. Davaadelger B, Shen H, Maki CG (2014) Funções inovadoras para a P53 no Genesis e segmentação de células cancerosas tetraplóide. PLoS ONE 9 (11): e110844. doi: 10.1371 /journal.pone.0110844

editor: Andrei L. Gartel, Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de junho de 2014; Aceito: 24 de setembro de 2014; Publicação: 07 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Davaadelger et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grant 1RO1CA137598-01A1 do Instituto Nacional do Câncer (NCI) (a C.G.M.). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Autor Carl Maki é um membro do PLOS One conselho editorial. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas e critérios editoriais.

Introdução

células tetraplóides contêm o dobro da quantidade normal de DNA e são raras na maioria dos tecidos normais. No entanto, as células tetraplóides são relativamente comuns no cancro e são pensados ​​para contribuir para o desenvolvimento do tumor, aneuploidia, e resistência à terapia [1]. A evidência directa para o potencial tumorigénico de células tetraplóides foi fornecida por Fujiwara et ai. [2] que isolou, células mamárias tetraplóides binucleadas epiteliais de ratos sem p53. Notavelmente, estas células eram mais susceptíveis a transformação induzida por carcinógeno para (crescimento soft-agar) que congéneres diplóides e tetraplóides as células formaram tumores em ratinhos nus, enquanto as células diplóides não o fez. Outros estudos têm ligado tetraploidia à radiação e resistência à quimioterapia. Por exemplo, Castedo et ai. [3], [4] isolados clones tetraplóides e diplóides a partir de duas linhas celulares de cancro humano com p53 de tipo selvagem. Importante, clones tetraplóides foram resistentes à radiação e vários agentes de quimioterapia em comparação com congéneres diplóides. Finalmente, há evidências de que as células cancerosas aneuploides são gerados a partir de qualquer divisão assimétrica ou perda cromossômica progressiva a partir de precursores tetraplóides. As primeiras evidências para este veio de estudos no esófago de Barrett pré-malignas. Nestes estudos, o aparecimento de células tetraplóides correlacionada com a perda de p53 e precedida aneuploidia bruto e carcinogénese [5], [6]. Em suma, as células tetraplóides podem ter maior potencial tumorigénico, seja terapia e resistente à radiação, e ser precursores de aneuploidia câncer. Portanto, é importante para identificar como as células tetraplóides surgem e como eles podem ser direcionados para tratamento de câncer.

P53 é um supressor tumoral e importante regulador da tetraploidia [7]. p53 é mantida em níveis baixos pela MDM2, um E3-ligase que se liga p53 e promove a sua degradação [8], [9]. danos no ADN e outras tensões perturbar ligação da p53-MDM2, fazendo com que os níveis de p53 a aumentar. O aumento da p53 pára a proliferação através da indução de expressão de genes que promovem G1-prisão (

P21

) ou apoptose (

PUMA, Noxa, BAX

) [10]. A prova de que as funções de p53 em um “checkpoint tetraploidia” vem em grande parte a partir de estudos utilizando inibidores de microtúbulos (MTIS) que as células de bloco em metáfase. Células presos em metáfase por exposição prolongada MTI pode, eventualmente, sair mitose e entrar em um estado pseudo-G1, conhecido como G1 tetraploid [11], [12]. Endoreduplicação refere-se ao caso em que estas células tetraplóides entrar fase S e replicar o seu DNA, dando origem a células de alta ploidia com duplicações crescentes do genoma (8N, 16N, 32N, etc.). As células com falta de p53 /p21 são mais propensas a endorreduplicação-MTI induzida do que as células do tipo selvagem [11] – [14]. Isto suporta um p53-p21 checkpoint tetraploidia dependente que bloqueia a entrada da fase S por 4N células.

G1-prisão Tetraplóide é tipicamente caracterizada pela depleção de proteínas G2 /M (por exemplo, ciclinas A /B, CDC2) e aumentou expressão de proteínas a paragem em G1 (por exemplo p53, p21) em células 4N [15] – [19]. Os agentes que danificam o ADN e.g. radiação ionizante (IR) ativar as células p53 e apreensão no G1 e G2-fases. Dois relatos iniciais encontrado IR causada p53 e p21 dependente de depleção de CDC2, ciclina A e ciclina B de ARNm e proteína [20], [21]. Em um caso, a depleção destas G2 /M marcadores coincidiu com Endoreduplicação 1-6 dias após o tratamento [21]. Estas descobertas sugerem que a activação de p53-p21 em células tratadas com RI pode promover uma paragem em G1 tetraplóide seguido posteriormente por endorreduplicação. Nutlin-3a (nutlin) é uma droga que estabiliza pré p53, bloqueando a p53-MDM2 de ligação. Nós relatado que nutlin poderia promover uma paragem em G1 tetraplóide em várias linhas de células de p53 do tipo selvagem, caracterizado por depleção de proteínas de G2 /M e um aumento da expressão de p53 e p21 em células 4N [18], [19]. Após a remoção nutlin, p53 e p21 diminuiu e, em alguns casos, as células foram submetidas a endorreduplicação [18]. p53 e p21 foram necessários tanto para a prisão G1 tetraploid e para endorreduplicação após a remoção nutlin. Importante, tetraplóides clones estáveis ​​poderiam ser isoladas a partir de células tratadas nutlin, e estes clones tetraplóides eram resistentes à cisplatina e IV (CP) de apoptose induzida por [19]. Estes estudos sugerem que a p53-p21 activada por nutlin pode promover uma paragem G1-tetraplóides e, quando os níveis de p53 diminuição (remoção nutlin) as células podem replicar o seu DNA (endorreduplicação) e dar origem a células tetraplóides que são IR e CP-resistente. No entanto, uma ressalva destes estudos anteriores é que eles foram realizadas em linhas celulares de cancro, que podem incluir uma mistura de células diplóides e tetraplóides, alguns dos quais podem ser inerentemente IR /CP-resistente. É possível que tínhamos isolado IR clones tetraplóides /CP-resistente que já estavam presentes na população, ou que os clones tetraplóides nós isolados foram derivadas de células diplóides que já estavam IR /CP-resistente. Assim, não ficou claro se a activação transiente de p53 por nutlin poderia converter as células diplóides e tetraplóides em células, se sim, se os clones resultantes tetraplóides exibiria um aumento da resistência à apoptose induzida por terapia. O estudo foi iniciado para responder a estas perguntas, e para testar a possibilidade de que as células cancerosas tetraplóides podem ser especialmente sensíveis aos antagonistas de MDM2.

Materiais e Métodos

linhas de células e condições de cultura

p53 do tipo selvagem e células HCT116 sem p53 (descrito em [11] foram obtidas do Dr. Bert Vogelstein (Universidade John Hopkins). D3 e D8 foram descritos [22] e são diplóides clones que foram isolados a partir de p53 As células HCT-116 do tipo selvagem por diluição limitante. As células foram cultivadas em meio 5A de McCoy com soro a 10% de bovino fetal (FBS), penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 ug /ml). As células foram plaqueadas 24 horas antes de ser tratada com nutlin-3 (10 umol /L, Sigma), a irradiação (10 Gy), cisplatina (Bedford Laboratório), ou tal como indicado

imunotransferência

Os extractos celulares totais foram preparados por ressuspensão. os sedimentos celulares em tampão de lise (NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 0,5% de Nonidet P-40, Tris 50 mM, pH 7,5), resolvidas por SDS-PAGE e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (NEN Life Science Products). Os anticorpos para p21 (H-164), ciclina A (H-432), geminin (FL-309), Cdk2 (M2) e p53 (AB-6) foram de Santa Cruz Biotechnology; anticorpos para ciclina B1 (V152), CDC2 (POH1), e Tyr-15 de Phospho-CDC2 foram de Cell Signaling; anticorpos para MDM2 (2A10) eram da Calbiochem. Anticorpo de Ciclina E (HE-2) era da BD Pharmingen. Os anticorpos primários foram detectados com anticorpos de cabra anti-ratinho (Pierce) ou de cabra anti-coelho (Life Technologies) anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano, utilizando quimioluminescência Clareza (Bio-Rad).

citometria de fluxo de células vivas e Triagem

Para a análise do ciclo celular, as células foram colhidas e fixadas em etanol a 25% durante a noite. As células foram então coradas com iodeto de propídio (25 ug /ml; Calbiochem). A análise de citometria de fluxo foi realizada no Gallios citómetro de fluxo (Beckman Coulter) e analisados ​​com o programa CellQuest (Becton Dickinson) e FlowJo 8,7 (Treestar, Inc). Para cada amostra, foram coletados 10.000 eventos. Por triagem de células vivas, as células foram incubadas com Hoescht 33342 (2 mol /litro; Invitrogen) durante 90 min a 37 ° C e em seguida colhido. separação de células foi realizada com base no conteúdo de ADN, utilizando um citómetro MoFlo equipado com um laser de excitação UV. As células separadas foram plaqueadas a baixa densidade.

a análise do mRNA

quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) foi realizada para medir os níveis de mRNA de ciclina A2, ciclina B1, CDC2, P21, Bax, Noxas, Puma, P53R2, actina em células que não foram tratados ou tratados com nutlin, cisplatina, ou IV, como indicado. A reacção em tempo real quantitativa de PCR foi executado em tempo real do sistema de PCR 7300 (Applied Biosystems, Foster, CA) utilizando SybrGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) seguindo as instruções do fabricante. A termociclagem foi feito num volume final de 20 ul contendo 2 ul de ADNc e 400 nmol /L de iniciadores (iniciadores estão listados na Tabela S1). Todas as amostras foram amplificadas em triplicado usando o esquema seguinte ciclo: 95 ° C durante 2 minutos, 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos e 55 ° C durante 60 segundos. A fluorescência foi medida em cada ciclo e os níveis de ARNm foram normalizados usando os valores de actina em todas as amostras. Um único pico foi obtido para alvos, apoiando a especificidade da reacção.

metafase espalha

células foram incubadas com colcemida (50 ng /mL) (Sigma-Aldrich) durante uma hora a 37 ° C, colhidas e lavadas com PBS e solução hipotónica (2 partes de 0,075 M de KCl e 1 parte de 0,7% Citrato de Na). As células foram então fixadas em fixador (3 partes de metanol e 1 parte de ácido acético) e espalhada sobre uma corrediça. Os spreads foram examinados sob um microscópio de contraste de fase.

Análise FISH

As células foram colhidas e lavadas com PBS. Em seguida, incubadas com uma solução hipotónica (2 partes de 0,075 M de KCl e 1 parte de 0,7% Citrato de Na) durante 20 minutos a 37 ° C. As células foram então fixadas em fixador (3 partes de metanol e 1 parte de ácido acético). As lâminas foram preparadas e envelhecida a 55 ° C durante 3 minutos em uma thermobrite. As lâminas foram incubadas com 0,05% de pepsina (Fisher # P53-100) durante 16 minutos a 37 ° C e, em seguida, lavadas com PBS e desidratadas em 70%, 85% e etanol a 100% durante 1 minuto cada, à temperatura ambiente. Em seguida, a sonda Vysis LSI TP53 SpectrumOrange /CEP 17 SpectrumGreen (Abbott Molecular Inc # 01N17-020) adicionou-se hibridar a 73 ° C durante 5 minutos e 37 graus durante 18 horas. Em seguida, as lâminas foram lavadas com tampão SSC (Gibco # 15557-044) com 0,5% de NP-40 (Fisher # P53-100) durante 2 minutos a 73 ° C e contrastadas com DAPI II (Abbott Molecular Inc # 30-804818). As lâminas foram examinadas sob o microscópio fluorescente.

clonogênica de Ensaio.

As células foram cultivadas 24 horas antes de ser tratada ou tratada com CP, IR, ou nutlin em diluições apropriadas para formar 50-100 colónias. Após 2-3 semanas, as colónias foram fixadas com formol e coradas com violeta de cristal a 0,05%. As colónias foram contadas e normalizada com a eficiência de plaqueamento de células não tratadas.

Resultados

nutlin promove uma G1-prisão tetraploid em células diplóides

Nós queria perguntar se p53 transitória activação por nutlin poderia promover a formação de células tetraplóides a partir de precursores diplóides e, se sim, se as células tetraplóides resultantes teriam aumentado a resistência à apoptose induzida por terapia. HCT116 é uma linha celular de cancro de cólon humano que expressa a p53 selvagem. No nosso estudo anterior, HCT116 foram plaqueadas a uma densidade de célula única e dez clones individuais foram isolados diplóides (clones designados D1-D10) que variaram na sua sensibilidade em relação à cisplatina (CP) induzidas por apoptose [22]. Nós escolhemos clones diplóides D3 e D8 para o estudo atual, porque estes clones mostrou uma sensibilidade relativamente elevada a CP em nosso estudo anterior. D3 e D8 tratada com nutlin durante 24 horas acumuladas com 2N e conteúdo de DNA 4N (Fig 1A). Imunotransferência mostraram que o tratamento em ambos os clones nutlin causada completa ou quase completa depleção de ciclina A, ciclina B1, e Tyr-15 CDC2 fosforilada (pCDC2), e o esgotamento parcial de CDC2 proteína total (Fig 1B). Ciclina A, ciclina B1, e ARNm CDC2 também foram reduzidos nas células tratadas nutlin, sugerindo a diminuição do nível de estes G2 /M proteínas pode resultar da diminuição da transcrição (Figura 1C). Em contraste, os níveis de p53 e proteína p21 foram acentuadamente aumentada por tratamento nutlin (Fig 1B). Os nossos estudos anteriores mostraram p53 e p21 foram aumentadas em ambos o 2N e células 4N nutlin-presos [18]. Assim, nutlin causa depleção de proteínas G2 /M e aumento da expressão de proteínas G1-de prisão (p53, p21) nas 4N células presos, indicativos de uma parada G1 tetraploid. Importante, nutlin teve nenhum efeito sobre a ciclina A, ciclina B1, pCDC2, e os níveis totais de CDC2 em células HCT116 sem p53 (Fig 1B), e não causou uma 2N e parada 4N nestas células (Fig 1A), demonstrando a tetraplóide paragem em G1 induzida por nutlin é dependente de p53. Nós também monitorizada níveis de geminin, um inibidor da replicação de ADN que está ausente em G1 e acumula em S, G2 e M-fase [23]. Geminin foi esgotada por nutlin em células D3 e D8, consistente com as células a ser (Fig 1B) prendeu-G1. níveis cdk2 ficaram inalterados por nutlin, enquanto os níveis de proteínas ciclina em fase G1 ciclina D1 e ciclina E foram aumentadas, também consistente com células sendo preso em G1 fase. Em suma, os resultados demonstram que nutlin provoca uma tetraplóide G1-prisão dependente de p53 em clones HCT116 diplóides D3 e D8.

A) HCT116 clones diplóides D3 e D8, e HCT116 que expressam p53 de tipo selvagem (p53 + /+) ou são p53 nulo (p53 – /-) não foram tratados ou tratados com nutlin (NUT 10 uM) durante 24 horas, e o perfil do ciclo celular por citometria de fluxo. B) Expressão das proteínas indicadas foi monitorizada por imunotransferência em células não tratadas ou tratadas com nutlin (NUT 10 uM) durante 24 horas. níveis C) de mRNA para os factores indicados em células não tratadas ou células tratadas com nutlin (NUT 10 mM) durante 24 horas foi determinada por qRT-PCR.

tratamento Transient nutlin promove a formação de clones resistentes tetrapolid terapia a partir de células precursoras diploides

Nós já mostrou 4N células presos pode reiniciar a síntese de DNA após a remoção nutlin e replicar seu DNA sem uma divisão mitótica intervir, um processo conhecido como endorreduplicação [18], [19]. Para perguntar se D3 e D8 sofrer endorreduplicação, após remoção nutlin, as células foram tratadas nutlin durante 24 horas, seguido por remoção nutlin para vários pontos de tempo. A citometria de fluxo foi utilizada para monitorizar os perfis do ciclo celular e imunoblots utilizados para monitorizar os níveis de proteína após remoção nutlin (Fig 2). D3 e D8 acumulada com conteúdo 2N e 4N de ADN quando nutlin tratados durante 24 horas, tal como na figura 1. Ambos os clones foram submetidos a endorreduplicação após remoção nutlin, evidenciado pelo aparecimento pronunciada de células 4N 16 horas após a remoção nutlin e a sua acumulação transiente em um pico 8N. O surgimento de 4N células e a sua acumulação em um pico 8N é indicativo de células que iniciam a síntese de ADN 4N, replicar o seu DNA, e entrando em mitose. A ciclina A2, ciclina B1, e os níveis de CDC2 devolvido 16 horas após a remoção nutlin, consistentes com as células sendo principalmente na fase G2 /M a este ponto de tempo. actividade de ciclina E-CDK2 é acreditado para promover ou ser necessária para a iniciação da síntese de ADN [24], [25], e a p21 se liga a e inibe a actividade de ciclina E-CDK2 [26]. Notavelmente, o surgimento de 4N, as células de DNA replicar 12-16 horas após a remoção nutlin coincidiu com uma diminuição acentuada dos níveis de proteína p21. Nós especulamos diminuição dos níveis de p21 após a remoção nutlin permitiu a activação da ciclina complexos E-CDK2, que poderia conduzir a síntese de DNA.

A) clones HCT116 diplóides D3 e D8 foram tratados (NT) ou expostos a nutlin (NUT 10 uM) durante 24 horas, seguida pela remoção nutlin. As células foram colhidas nos tempos indicados após remoção nutlin. As células fixadas foram coradas com iodeto de propídio (25 ug /ml) e sujeito a análise de citometria de fluxo. B) As células foram tratadas (NT) ou expostos a nutlin (NUT 10 uM) durante 24 horas, seguido por remoção nutlin. Os lisados ​​celulares foram recolhidos a pontos de tempo indicados e analisados ​​por imunotransferência com os anticorpos indicados. Actina foi como um controlo de carga.

P-Cdc2

, fósforo-Cdc2 (Tyr-15).

Em seguida, queríamos perguntar se endorreduplicação após a remoção nutlin poderia dar origem a clones tetraplóides estáveis ​​e, se sim , se os clones resultantes tetraplóides seria resistente a CP ou radiação (IR) de apoptose induzida por ionizante. Para este fim, D3 e D8 foram nutlin tratados durante 24 horas, seguido por remoção nutlin durante mais 16 horas. As células foram então marcadas com o corante de ADN-de células vivas Hoechst 33342. As células 2N e 8N foram isoladas por citometria de fluxo e novamente plaqueadas a baixa densidade para o isolamento de clones individuais (Fig 3A). Um total de 11 clones de D3 e 12 clones D8 foram obtidos a partir de populações isoladas 8N que surgiram após remoção nutlin. 7 dos 11 D3 clones (63%) e 8 dos 12 D8 clones (66%) cresceram como células 4N tetraplóides. Isto foi evidenciado por: 1) o pico G1 destes clones que se sobrepõem a G2 /M, pico das células diplóides D3 e D8 (Fig 3B), 2) a contagem cromossoma da metáfase, que apoiaram os clones tetraplóides têm duas vezes o conteúdo em ADN do diplóide D3 e precursores D8 (Fig 3C), e 3) análise de FISH utilizando

P53

cromossómicas e sondas específicas para os 17. Esta análise FISH mostrou clones tetraplóides têm 4 cópias do cromossomo 17 e

P53

, enquanto as células D3 e D8 diplóides têm 2 cópias do cromossoma 17 e

P53

(Fig 3D). Finalmente, nós testamos se clones tetraplóides que surgiram após o tratamento nutlin foram mais resistentes à CP e apoptose induzida por IR do que congéneres diplóides. Em primeiro lugar, 5 clones tetraplóides e 5 clones diplóides isoladas a partir de células tratadas nutlin D3 ou D8 foram expostas a CP (20? M) ou IR (10 Gy), e apoptose monitorizada 48 horas depois por o teor de ADN sub-G1. Como mostrado na Fig 4A, os clones tetraplóides como um grupo eram significativamente mais resistentes a CP e a apoptose induzida por IR do que as células parentais e os clones isolados após o tratamento diplóides nutlin. clones tetraplóides individuais (T3 e TD6) também foram mais resistentes à CP e apoptose induzida por IR em comparação com congéneres diplóides (D3 e D81B), evidenciado por uma menor percentagem de células sub-G1 após CP e tratamento IR (Fig 4B) e menor expressão de PARP clivada e clivada da caspase-3 (Fig 4D). Estes resultados são consistentes com relatos de nós e outros mostraram que as células tetraplóides podem ser resistentes a terapia [3], [19]. Estudos anteriores relataram que o p53 e p21 pode contribuir para o CP e IR-resistência em HCT116 e outras células, muito provavelmente através da indução ou execução de uma paragem do ciclo celular que bloqueia CP ou células de proliferação e a tentativa para dividir IR-tratada [27] – [31]. Notavelmente, verificou-se p53, MDM2, e as proteínas p21 foram induzidas para níveis comparáveis ​​em CP e diplóide-IR tratados e os clones tetraplóides (Fig 4C), e que os genes de paragem do ciclo celular p53-sensível (

P21

), genes de reparo do DNA (

P53R2

) e genes apoptóticos (

PUMA, Noxa, Bax

), foram também induziu comparavelmente na CP e diplóide tratados IR e clones tetraplóides (Fig 4E). Estes resultados sugerem CP e IR-resistência nos clones tetraplóides não está associada com o aumento dos níveis de p53 ou actividade. No total, os resultados indicam a activação de p53 por nutlin transiente pode promover uma paragem em G1 e tetraplóides endorreduplicação após remoção nutlin em células precursoras diplóides, conduzindo à geração de terapia (CP /IR) clones resistentes ao tetraplóides.

A ) é mostrado o procedimento para isolar clones diplóides e tetraplóides de células temporariamente expostos a nutlin. D3 e D8 foram não tratadas (NT) ou tratados com 10 uM nutlin (NUT) durante 24 horas, seguida pela remoção nutlin durante mais 16 horas. As células foram, então, viver-coradas com Hoechst 33342 (5 ug /ml). separação de células foi realizada com um citómetro MoFlo equipado com um laser de UV de comprimento de onda de excitação. células Ordenado 2N e 8N foram semeadas a baixa densidade em meio normal (menos nutlin) e clones individuais isolados. B)

Top of, a comparação dos perfis de ADN entre D3 e um clone representativo tetraplóide isolado de D3.

inferior, a comparação dos perfis de ADN entre um clone representativo diplóide (D81B) isolado a partir de células D8, e um clone representativo tetraplóide (TD6) isolado a partir de células D8. C) metaphase propagação Representante a partir de células D3 diplóides e células T3 tetraplóides. O número no canto inferior direito indica o número de cromossomos contados. D) Análise de peixe com cromossomo 17 (Chr 17) e sondas específicas para o p53 mostra) células T3 (tetraplóides contêm 4 cópias de p53 e Chr 17, enquanto a) células diplóides (D3 contêm 2 cópias de p53 e Chr 17.

A) cinco clones diplóides isoladas de nutlin tratada células D3 (D3 diplóides) e células D8 (D8 diplóides), e cinco clones tetraplóides isoladas de nutlin tratada células D3 (D3 tetraplóides) e células D8 (D8 tetraplóides) estavam sem tratamento (NT) ou expostos a CP (20? M) ou IR (10 Gy) por 48 horas. Determinou-se a percentagem de células com ADN sub-G1. São mostrados os resultados médios de três experiências separadas,

bares

, erro padrão (SE). * Valor de significância (P 0,05). B) Os clones tetraplóides (T3, TD6) e os seus homólogos diplóides (D3, D81B) foram não tratadas (NT) ou expostos a CP (20? M) ou IR (10 Gy) por 72 horas. Determinou-se a percentagem de células com sub-G1 ADN (coloração com iodeto de propídio). São mostrados os resultados médios de três experiências separadas,

bares

, erro padrão (SE). * Valor de significância (P 0,05). C) O diplóide indicado e tetraplóides clones eram não tratadas (NT) ou expostos a CP (20? M) ou IR (10 Gy) por 24 horas. p53, p21, e os níveis de proteína MDM2 foram determinados por immunoblotting e quantificado. Os números indicam o nível relativo de cada proteína. Actina foi utilizado como um controlo de carga. D) O diplóide e os clones indicou tetraplóides não tratadas (NT) ou expostos a CP (20? M) ou IR (10 Gy) por 48 horas. níveis de PARP clivada e da proteína caspase-3 foram determinados por immunoblotting e quantificada em relação à não tratada. E) qRT-PCR foi utilizado para determinar os níveis de ARNm para os genes indicados em células diplóides (D3, D81B) e os clones tetraplóides (T3, TD6) que foram ou não tratadas (NT) ou expostos a CP (20? M) ou IR (10 Gy ) durante 24 horas. O nível de cada transcrito mRNA em clones diplóides não tratados (D3 NT, D81B NT) foi considerado “1.0”, e todos os outros valores são plotados em relação a ele.

clones tetraploides são mais suscetíveis a p53- apoptose dependente e parada do crescimento induzido por nutlin

foi um pouco surpreendente que a p53 foi induzida comparavelmente pela CP e IR em clones diplóides e tetraplóides, apesar do fato de que os clones tetraplóides abrigar duas vezes mais cópias do

gene P53

(FISH, Fig 3D). Isto indica o nível a que a p53 é induzido por CP e IV não é dependente de

P53

número de cópias, mas em vez disso pode ser limitada por outros factores, talvez, a quantidade de DNA danificado ou o nível de activação de estresse induzido quinases que estabilizam p53. No entanto, especulado que o nível ao qual a p53 é induzido por antagonistas de MDM2 (por exemplo nutlin) pode depender do

P53

número de cópias, e que as células tetraplóides pode, portanto, expressam níveis mais elevados de p53 em resposta a nutlin e ser hiper- sensível à inibição do crescimento mediada por nutlin. Para testar isso, diplóide D3 e D81B e os seus homólogos tetraploid T3 e TD6 foram nutlin tratada durante 24 horas. os níveis de proteína p53 e MDM2 foi determinada por imunotransf erência e os níveis de mRNA determinado por qRT-PCR. Os resultados mostraram que os clones tetraplóides expressar p53 elevado (mais ~2X) e ARNm de MDM2 e a proteína do que os clones diplóides, tanto basal (Figura 5A) e depois do tratamento nutlin 24 h (Figuras 5C). Para avaliar os níveis de complexos p53-MDM2, as células foram tratadas com inibidor de proteassoma MG132 para bloquear a degradação de p53, e os complexos p53-MDM2 determinada por co-imunoprecipitação. Estes estudos mostraram clones tetraplóides tinha mais complexos p53-MDM2 após o tratamento MG132 do que os clones diplóides de onde eles surgiram (Fig 5B). Assim, os clones tetraplóides expressar níveis mais elevados de p53 e MDM2, e contêm níveis mais elevados de complexos p53-MDM2. Especulamos em clones tetraplóides isso se traduziria para níveis mais elevados de p53 após o tratamento nutlin e um consequente aumento da prisão G1 dependente de p53 e apoptose. Para testar isso, nós comparamos a sensibilidade relativa de clones diplóides e tetraplóides a paragem do ciclo celular induzida por nutlin ou apoptose. Em primeiro lugar, os clones diplóides e tetraplóides foram tratados com doses crescentes de nutlin (1,0-5,0 uM) durante 24 horas. Aumento G1 /S rácio, reflectindo a depleção de células em fase S e a acumulação de células em fase G1-, foi usado como uma medida de paragem em G1-induzida nutlin. Como mostrado na Fig 6A, os clones tetraplóides como um grupo eram mais susceptíveis a paragem em G1-induzida nutlin do que as células parentais ou clones diplóides (rácio G1 /S aumentou mais com o aumento das doses nutlin em clones tetraplóides que os clones parentais ou diplóides). Individual clones tetraplóides T3 e TD6 também foram mais suscetíveis a prisão G1 induzida nutlin do que congéneres D3 e D81B (Fig 6B) diplóides. Como mostrado na Fig 6C, proteínas p53 e p21 foram induzidas para níveis mais elevados e com menores doses nutlin nos clones tetraplóides em comparação com os clones de diplóides. Esses resultados indicam os clones tetraplóides expressam níveis mais elevados de p53 e p21 após o tratamento nutlin e são mais suscetíveis que os clones diplóides a prisão G1 induzida nutlin. Em seguida, os clones diplóides e tetraplóides foram tratados com uma dose mais elevada nutlin (20 uM) durante 72 horas, e monitorizada por apoptose de células por cento com teor de ADN sub-G1 e /ou expressão de PARP clivada e caspase-3 clivada. Como mostrado na Fig 6D, clones tetraplóides como um grupo foram mais susceptíveis à apoptose induzida por nutlin do que os clones diplóides. clones tetraplóides individuais (T3 e TD6) também foram mais suscetíveis à apoptose induzida por nutlin do que congéneres diplóides (D3 e D81B), evidenciado por uma mais elevados células sub-G1 por cento após o tratamento nutlin e aumento da expressão de PARP clivada e caspase-3 ( Figuras 6E e F).

a) P53 e níveis de mRNA MDM2 foram comparados em clones não tratados tetraplóides (T3, TD6) e os seus homólogos diplóides (D3, D81B). B) diplóide (D3, D81B) e tetraplóides (T3, TD6) clones eram não tratadas ou tratadas com inibidor de proteassoma MG132 (10 uM) durante 8 horas.

Altos

Níveis de MDM2, p53, e actina (controlo de carregamento) em não tratada e MG132 trataram células são mostrados.

Baixa

Para determinar os níveis de complexos p53-MDM2 em células diplóides e tetraplóides células, lisados ​​de proteína foram imunoprecipitadas com anticorpo anti-p53, seguido por imunotransf erência para MDM2. C) diplóide (D3, D81B) e os clones tetraplóides (T3, TD6) não foram tratados ou tratados com nutlin (10 uM) durante 24 horas. os níveis de proteína p53 e MDM2 foi detectada por imunotransferência e quantificada utilizando software de imagem-J. A quantidade relativa de proteína p53 e MDM2 nos clones diplóides não tratados foi determinado um valor de “1,0”. Os números indicam o nível relativo de cada proteína. Actina foi utilizado como um controlo de carga.

A) Cinco clones diplóides isoladas a partir de células tratadas nutlin D3 (D3) e células diplóides D8 (D8) diplóides e tetraplóides cinco clones isolados a partir de células tratadas com nutlin D3 (D3 tetraplóide) e células D8 (D8 tetraplóide) não foram tratados ou tratados com o aumento da nutlin (1,0-5,0 uM) durante 24 horas. As células por cento G1 e em fase S foi determinado por citometria de fluxo, e a mudança de dobra G1 /S rácio é traçada. Se não for tratada clones diplóides G1 rácio /S foi dado um valor de 1,0. É mostrada a média de três experiências separadas, +/- SE. B) Os clones tetraplóides (T3, TD6) e homólogos diplóides (D3, D81B) não foram tratados ou tratados com nutlin (1,0-5,0 uM) durante 24 horas. A mudança de dobragem de relação de G1 /S é traçada. É mostrada a média de três experiências separadas, +/- SE. C) diplóide (D3, D81B) e os clones tetraplóides (T3, TD6) não foram tratados ou tratados com o aumento da nutlin (1,0-5,0 uM) de 24 horas. os níveis de proteína p53 e p21 foram quantificados usando o programa Image-J. Os números indicam os níveis relativos de cada proteína. os níveis de p53 e p21 em clones diplóides não tratados foi dado um valor de “1.0”. Actina foi utilizado como controlo de carga. D) Cinco clones diplóides isoladas de nutlin tratada células D3 (D3 diplóides) e células D8 (D8 diplóides), e cinco clones tetraplóides isoladas de nutlin células tratadas D3 (D3 tetraplóides) e células D8 (D8 Tetraplóide) foram não tratadas (NT) ou tratada com nutlin (20 pM) 72 horas e determinaram apoptose. São mostrados os resultados médios de três experiências separadas,

bares

, erro padrão (SE). * (P 0,05). clones E) diplóide Representante (D3, D81B) e tetraplóide (T3, TD6) não foram tratados (NT) ou tratados com nutlin (20 mM) durante 72 horas. Determinou-se a percentagem de células com teor de ADN sub-G1 (coloração com iodeto de propídio). São mostrados os resultados médios de três experiências separadas,

bares

, erro padrão (SE). * Valor de significância (P 0,05).