fundo

células T reguladoras Abstrato (Treg) que expressa o fator de transcrição P3 proteína forkhead-box (Foxp3) foram identificados para neutralizar as respostas imunitárias anti-tumor durante a progressão tumoral. Além disso, a apresentação de Foxp3 por células de cancro, também ela, pode permitir-lhes evadir a partir de respostas de células T efectoras, resultando em um benefício de sobrevivência do tumor. Para o cancro colorectal (CRC) a relevância clínica da Foxp3 não foi avaliada em detalhe. Portanto, o objetivo deste estudo foi o de estudar o seu impacto no câncer colorretal (CRC).

métodos e resultados

Gene e análise de proteínas dos tecidos tumorais de pacientes com CRC foi realizado para quantificar a expressão de Foxp3 no tumor infiltrando células Treg e cancro do cólon. Os resultados foram correlacionados com os parâmetros clínico e pacientes de sobrevivência geral. análise morfológica de série demonstraram Foxp3 para ser expresso em células cancerosas. expressão Foxp3 alta das células cancerosas foi associada com mau prognóstico em comparação com pacientes com baixa expressão Foxp3. Em contraste, baixo e alto nível de Foxp3 no tumor infiltrando células Treg não demonstrou diferenças significativas na sobrevida global dos pacientes.

Conclusões

Nossos resultados sugerem fortemente que a expressão Foxp3 mediada por células cancerosas e não por Treg células contribuem para a progressão da doença

Citation:. Kim M, Grimmig T, Grimm M, Lazariotou M, Meier E, Rosenwald a, et al. (2013) A expressão de Foxp3 no câncer colorretal, mas não em células Treg se correlaciona com a progressão da doença em pacientes com câncer colorretal. PLoS ONE 8 (1): e53630. doi: 10.1371 /journal.pone.0053630

editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, China

Recebido: 07 de novembro de 2011; Aceito: 03 de dezembro de 2012; Publicação: 30 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a identificação de CD4 + CD25 + regulatórias T ( Treg) demonstrou desempenhar um papel crucial na manutenção da tolerância imunológica. O fator de transcrição P3 proteína caixa de forkhead (Foxp3) foi identificado como um jogador-chave na função Treg e é um marcador obrigatório de CD4 + CD25 + Treg [1]. Alguns subclasses de Treg exercem a sua influência supressora através da expressão de citocinas imunossupressoras, tais como interleucina (IL) -10 e factor de crescimento transformante (TGF) -β [2], [3]. Uma elevada densidade de tumor infiltrating Foxp3 + Treg no espécime de tumor tem sido associada com mau resultado em diversos tumores sólidos, incluindo os do ovário [4], do pâncreas [5], e o carcinoma hepatocelular [6]. Estes achados sugerem um papel crucial para Treg em diferentes entidades tumorais. Assim, visando Treg podem ter um impacto importante sobre as estratégias anti-câncer imunoterapia e a evolução clínica de pacientes com câncer [7].

Treg são suspeitos de reduzir a atividade das células T, mas não se sabe se a presença de Treg pode ter um impacto sobre o curso clínico e na sobrevivência do tumor relacionada de pacientes com CCR. O significado prognóstico da detecção Treg em pacientes com doença limitada e avançado ainda permanece controverso. Até o momento, poucos estudos têm analisado infiltrando Treg no CRC usando Foxp3 + coloração. Um estudo recente demonstrou que Treg densidade foi maior em localmente limitado do que na doença metastática, mas não foi associada com a sobrevivência de pacientes de CRC [8]. Contrariamente às conclusões observadas na maioria dos outros carcinomas humanos, não se observou relação significativa entre o número absoluto de Foxp3 + infiltrando células T e prognóstico em vários estudos com pacientes com CCR. Além disso, alguns outros estudos sugerem que uma alta frequência de tumor infiltrando Foxp3 + Treg está associada com prognóstico favorável no CRC [9].

Os dados clínicos recentes Mais de pulmão [10], de mama [11], [12] , pancreático [13], hepatocelular [14], e cancro da bexiga urinária [15], bem como o melanoma [16] fornecido primeira evidência para uma expressão de Foxp3 também em células tumorais. No entanto, o significado biológico da expressão de Foxp3 em células cancerosas de pacientes com CRC permanece desconhecida. Em particular, a contribuição de expressão de Foxp3 relacionadas com as células tumorais, em comparação com a expressão relacionada com Treg no CRC clínica não foi avaliada de modo distante. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a expressão Foxp3 entre tumor infiltrando células Treg e cancerosas em pacientes com CRC em diferentes estágios da doença, bem como para discriminar seu significado prognóstico a longo prazo.

Resultados

a detecção de CD4, CD25, Foxp3 e citocinas imunossupressoras IL-10 e os genes de TGF-p por meio de RT-qPCR e análise imuno-histoquímica

Para analisar se a CD4, CD25, Foxp3, IL-10, e expressão de TGF-β em CRC pode ser associada com a progressão do tumor clínica investigamos tumores de doença limitada (UICC I /II) e doença avançada (UICC III /IV). análise de RT-qPCR mostraram um aumento significativamente a expressão do gene de CD4 e CD25 em tumores doença limitada (UICC I /II) em comparação com tumores de doença avançada (UICC III /IV). Em conformidade com esta constatação, a expressão do gene de Foxp3 e citocinas imunossupressoras IL-10 e TGF-β foi significativamente diminuída em tumores doença limitada (UICC I /II) em comparação com aqueles da doença avançada (UICC III /IV) (

Figura

1A

).

(a) Um aumento significativo de expressão do gene de CD4 e CD25 no UICC fase I /II em comparação com tumores em estágio UICC III /IV. A expressão de genes de Foxp3, a IL-10 e TGF-β foi significativamente diminuída na fase I /II, tal como em comparação com aqueles no UICC III /IV. A normalização foi realizada com o tecido normal. O valor quantificação relativa, diferença vezes, é expressa como 2

-ΔΔCt. * P 0,001. (B) + Foxp3, IL-10 +, e TGF-β + expressando células de cancro aumentou de UICC I /II para UICC III /IV em comparação com o tecido normal. O resultado da coloração foi expressa em percentagem (%) de positividade. Todos os valores foram expressos como média ± DP; todos os testes de pares (Tukey) resultam em p 0,001, com exceção do controle vs. UICC I /II em Foxp3

+ (p 0,050).

Em seguida, examinaram a expressão de Foxp3 e citocinas imunossupressoras IL-10 e TGF-β em células cancerosas. Como mostrado na

Figura

1B

, Foxp3 +, IL-10 +, e TGF-β + expressando células cancerosas aumentou de cedo para estágios tardios da doença em comparação com o tecido normal. Foxp3

células cancerosas que expressam + foram encontrados em 60 dos 65 casos de tumor (n = 60/65, 92,3%). Além disso, coradas 36 dos globais 65 casos com um anticorpo anti-Foxp3 diferente (clone 2481) e confirma os resultados (dados não mostrados).

A análise imuno-histoquímica de células CD4 +, CD25 +, Foxp3 +, e citocinas imunossupressoras IL -10+ e TGF-β + em Treg

próxima examinados Treg e células cancerosas para uma análise detalhada de expressão de Foxp3, a IL-10 e TGF-β por imuno-histoquímica. Primeiramente, examinámos a expressão de CD4 +, CD25 +, + Foxp3, citocinas imunossupressoras e IL-10 e TGF-p na Treg. Como mostrado na

Figura

2A

, aumento de células CD4 +, CD25 +, + Foxp3, IL-10 +, e TGF-β + expressão foi observada em tumores doença limitada (UICC I /II), em comparação a tumores avançados da doença (UICC III /IV) e tecido normal. No geral, o Foxp3 + expressando Treg em quantidades diferentes foram encontradas em 61 dos 65 tumores de pacientes (n = 61/65, 93,8%). Imunofluorescência de dupla marcação demonstrou que Foxp3 + Treg eram de um fenótipo de células CD4 + T (

Figura

2B

). Apenas uma porção muito pequena de menos de 5% de células foi encontrado para representar uma subpopulação de células T CD8 + que expressam Foxp3 (dados

não mostrado

).

(a) aumento de células CD4 +, CD25 +, Foxp3 + , IL-10 +, e TGF-β + expressão no UICC fase I /II, tal como em comparação com aqueles no UICC III /IV. O resultado da coloração foi expressa em percentagem (%) de positividade. Todos os valores foram expressos como média ± DP. Todos os testes de pares resultar em p 0,001, com três excepções: Foxp3

+, controle vs. UICC III /IV, p = 0,091; IL-10

+, UICC I /II vs UICC III /IV, p = 0,021; TGF-ß

+, UICC I /II vs. UICC III /IV, p = 0,020. (B) Exemplo representativo de uma dupla imunofluorescência de Foxp3 + e CD4 + no Treg. expressão de Foxp3 foi observado principalmente em Treg CD4 + (seta) (400x de ampliação). FITC, Fluoresceinisothiocyanate verde, Cy3, indocarbocyanin vermelho, e DAPI 4 ‘, 6-diamidino-2- phenylindoldihydrochlorid azul -. Contracoloração nuclear

Gene e análise de proteínas de expressão Foxp3 em células cancerosas de pacientes com CRC e em linhas de células cancerígenas do cólon humano por RT-qPCR, imunofluorescência de dupla marcação e citometria de fluxo

primeiro, demonstrou expressão Foxp3 em células cancerosas de pacientes com CRC utilizando imunofluorescência de dupla marcação (

Figura

3

). Para confirmar a expressão de Foxp3 em células de tumor foi realizada RT-qPCR, análise FACS e imunofluorescência de dupla marcação análises em diferentes linhas celulares de cancro de cólon humano (SW480, SW620, e HCT-116). Como demonstrado por FACS 3,8% a 6,1% das células cancerosas, de facto expressas Foxp3 (

Figura

4A e B

).

G

eno análise por RT-qPCR confirmou a sua expressão (expressão relativa nas linhas celulares variaram entre 1,76 e 2,08,

Table

1 |).

exemplo representativo de uma dupla imunofluorescência, mostrando a expressão Foxp3 e costaining EPCAM em células cancerosas de pacientes com CCR (× 100 ampliação acima; × 400 ampliação abaixo). FITC, verde Fluoresceinisothiocyanate, Cy3, indocarbocyanin vermelho e DAPI 4 ‘, 6-diamidino-2- phenylindoldihydrochlorid azul -. Nuclear de contraste

(A) Citometria de fluxo de ensaio de expressão Foxp3 em SW480, SW620 e linhas celulares de cancro do cólon HCT-116, em comparação com o controlo de isotipo. 3,8% para 6,1% de células cancerígenas do cólon Foxp3 expressa; PE: ficoeritrina; FS: frente linear de dispersão. (B) Os exemplos representativos de imunofluorescência de dupla marcação de Foxp3 + expressão em SW480, SW620 e células cancerosas HCT-116. Cy3, indocarbocyanin vermelho e DAPI 4 ‘, 6-diamidino-2- phenylindoldihydrochlorid azul -. Nuclear de contraste (400 × ampliação)

Correlação de células cancerosas Foxp3 + com a expressão de citocinas imunossupressoras IL -10 e TGF-β

para examinar se a expressão das citocinas imunossupressoras IL-10 e TGF-β correspondiam com o Foxp3 + que expressam as células cancerosas que estratificados em dois grupos diferentes de acordo com as percentagens de expressão na imuno-histoquímica análise. Considerando Foxp3 + expressão em células cancerosas como variável contínua, a análise de regressão mostrou que a expressão celular de cancro Foxp3 + apresentavam uma correlação directa fraca, mas significativa com a expressão das citocinas imunossupressoras IL-10 (R

2 = 0,23, P 0,001, n = 65; r = 0,48) e TGF-β (R

2 = 0,33, p 0,001, n = 65; r = 0,57) (

Figura

5A e B

) .

(a /B) correlação significativa da expressão de células de cancro Foxp3 + com a expressão de IL-10 (a) e TGF-β (B). Análise de regressão; R

2, coeficiente de determinação. (C /D) Exemplo representativo de uma coloração por imunofluorescência dupla da IL-10 + (C) e de TGF-β + (D) + Foxp3 em células de cancro (setas). FITC verde Fluoresceinisothiocyanate, Cy3 vermelho e DAPI 4 ‘, 6-diamidino-2- phenylindoldihydrochlorid azul -. Contracoloração nuclear

imunofluorescência de dupla marcação indicou a expressão das citocinas imunossupressoras IL-10 e TGF-beta em Foxp3 + expressando células cancerosas (setas) (

Figura

5C e D

).

Correlação de Foxp3 + Treg com células cancerosas Foxp3 +

Para examinar se Foxp3 + expressão Treg correspondeu-se com a expressão de células de câncer Foxp3 +, estratificamos dois grupos diferentes de acordo com percentagens expressão de análise imuno-histoquímica. Considerando a expressão de células de câncer de Foxp3 + como uma variável contínua, análise de regressão mostraram que a expressão da célula cancerosa Foxp3 + tiveram uma correlação inversa fraca, mas significativa com a expressão Foxp3 + Treg (R

2 = 0,17, p = 0,01, n = 65; r = -0,41) (

Figura

6A

). Imunohistoquímica mostraram aumento da expressão Foxp3 + Treg no Foxp3 tecido do estroma câncer negativo (seta) (

Figura

6B

). Em contraste, não houve ou expressão Foxp3 + Treg insignificante encontrado em Foxp3 tecido canceroso positiva (seta) (

Figura

6C

).

(A) correlação inversa significativa de expressão de células Foxp3 + câncer com a expressão Foxp3 Treg. Análise de regressão; R

2, coeficiente de determinação. (B) aumento do número de Foxp3 + Treg em Foxp3 tecido canceroso negativo (seta). (C) Apenas ocasionalmente ou nenhuma Foxp3 + Treg no tecido canceroso positiva Foxp3 (seta). cor marrom DAB, Haemalaun cor azul – contracoloração nuclear. exemplo representativo demonstra área de ampliações x100 (esquerda) e x200 (direita).

A sobrevida global

A análise de regressão multivariada de Cox foi realizado por etapas, incluindo idade, sexo, tumor primário (cólon ou reto), UICC (I /II ou III /IV), profundidade de invasão tumoral (categoria T 1/2 ou 3/4), a diferenciação (1/2 ou 3/4), metástase linfonodal (categoria N), Foxp3 (%), Treg (%), TGF-ß (%), e IL-10 (%). O procedimento passo a passo mantidas no modelo da categoria N e expressão Foxp3 em células de cancro do cólon como parâmetros prognósticos (estatística Chi-Quadrat, p 0,01,

Table

2

).

resultados univariada de Kaplan-Meier

Os fatores prognósticos identificados a partir de modelo de regressão Cox são apresentados nas Figuras 7A e C. O valor de expressão de células de câncer Foxp3 + dizer com análise imuno-histoquímica para todas as amostras de tecidos estudados de os 65 tumores foi determinada em 16%. Entre os pacientes com CRC, aqueles com alta Foxp3 + expressão de células de câncer ( 16%) tiveram um pior prognóstico do que aqueles com níveis de Foxp3 + expressão baixas ( 16%) (p 0,001, teste log-rank) (

Figura

7A

e

Table

3

).

() pacientes A com alta Foxp3 + expressão de células de câncer ( 16%, como média de corte) teve um pior prognóstico do que aqueles com perfis célula cancerosa Foxp3 + expressão baixas ( 16%, média de cut-off: 16%), (p 0,001, teste log-rank). (B) Não houve diferença significativa na sobrevida global comparando pacientes com perfis de expressão baixa e alta Foxp3 + Tregs (média de corte: 12%), (p = 0,202, teste log-rank). (C) Os pacientes com metástases linfonodais tiveram um pior prognóstico do que aqueles sem metástases em linfonodos (p 0,001, teste log-rank). Os tempos dos dados censurados são indicadas por linhas verticais curtas.

Considerando análise imuno-histoquímica das amostras a partir das amostras de tecidos para 65 expressão Foxp3 + Treg o valor médio foi calculado em 12%. Não houve diferença significativa na sobrevida global comparando pacientes com baixos níveis de expressão e de alta Foxp3 + Tregs ( 12% ou 12%) (p = 0,204, teste log-rank) (

Figura

7B

e

Table

3

).

em pacientes sem metástase ganglionar houve diferenças significativas na sobrevida global em comparação com pacientes com metástase linfática. (p 0,001, teste log-rank) (

Figura

7C

)

Outros parâmetros, tais como TGF-ß, IL-10, UICC, e da categoria T mostraram diferenças adicionalmente significativas na sobrevida global para a expressão inferior correspondente e classificação, respectivamente (p 0,001, log-rank testes)

Idade, sexo, tumor primário, e diferenciação histológica não foram associados com. prognóstico na análise univariada.

Discussão

o presente estudo prevê a primeira evidência de um tempo de expressão relacionada com o tumor significativamente aumentada do factor de transcrição Foxp3 em células de cancro colorrectal que está associado com prognóstico desfavorável . proteína detalhada e análise do gene foi usado para estudar os seus perfis de expressão em tecido de tumor de cada um dos pacientes. Com base nos achados clínicos mais recentemente descritos de uma expressão Foxp3 em células cancerosas de tumores como pulmão, hepatocelular e câncer de bexiga urinária, bem como melanoma que sugerem que os níveis de expressão elevada Foxp3 não necessariamente associada a Treg sozinho, mas também para as células cancerosas [10 ], [14], [15]. A expressão de Foxp3 por células cancerosas lhes permitam regular negativamente respostas de células T efectoras dirigidos contra o tumor. Isso daria evidência clínica de um mecanismo eficaz de uma evasão derivado de tumor directa da destruição imunológica no CRC. Discriminando expressão Foxp3 de células cancerosas de se infiltrar Treg e correlacionando com a sobrevida global por um longo prazo follow-up que fornecem novos insights em seu significado prognóstico.

De acordo com estudos anteriores em várias doenças malignas encontramos significativamente números mais elevados de infiltração Treg (CD4 + CD25 + Foxp3 +) em todas as amostras de CRC em comparação com tecidos normais do cólon [4] – [6], [17] – [20]. No entanto, a associação de expressão Foxp3 em Treg e seu impacto na sobrevida global permanece controverso. dados ambíguos sugerem que a infiltração do tumor por Foxp3 + Treg não está sempre associada a um prognóstico pobre, mas, pelo contrário, pode ser associada a um melhor prognóstico em alguns tipos de cancro como no CRC [8], [9], [21], [22]. Além disso, não foi observada nenhuma relação significativa entre o número absoluto de Foxp3 + Treg e prognóstico no CRC [23], [24]. sobrevivência melhorada e o papel potencialmente protector de Treg pode ser explicada pela sua capacidade de reduzir o desenvolvimento de uma agressiva e citotóxico, potencialmente proliferogenic meio de citocina, que é a base para um progresso-driven inflamação de doenças malignas [25], [26] .

estudos experimentais em ratos mostraram que CD4 + CD25 + Treg não só desempenham um papel central na manutenção da tolerância imunológica, mas que Treg são também inibidores potentes de respostas imunes antitumorais [27], [28]. Estudos anteriores examinaram as capacidades supressores de células CD8 + CD25 + Foxp3 + T em tecidos de cancro colorrectal [29]. Em CRC espécimes o número absoluto de células CD8 + CD25 + Foxp3 + foram baixos ( 5%). Além disso, estas células estavam ausentes na maioria das amostras de tecidos normais, mas a maioria dos espécimes presentes no CRC; no entanto a sua relevância clínica permanece desconhecido [29]. Vários grupos observaram expressão Foxp3 por vários tipos de câncer e seu potencial papel na vigilância imunológica através da produção de citocinas imunossupressoras, como a IL-10 e TGF-β [30].

Por fim, analisamos a sobrevida global de pacientes com baixa ou alta infiltração Foxp3 + Treg no tumor, em comparação com a sobrevivência de pacientes com baixo ou elevado de expressão de Foxp3 das suas células cancerosas. Os pacientes com alta Foxp3 + perfil de expressão em células de câncer foram associados a um pior prognóstico do que pacientes com baixo perfil de expressão de Foxp3 + em suas células cancerosas. Esta correlação de padrão de expressão Foxp3 alta com mau prognóstico não foi observado para se infiltrar Treg no tumor. As células cancerosas expressão de Foxp3 seguido por secreção de citocinas imunossupressoras para o microambiente do tecido de tumor pode dar o tumor uma ferramenta poderosa para contornar destruição imunológica. Curiosamente, foi observada uma correlação inversa entre o número de Foxp3 + Treg e o nível de células cancerosas Foxp3 + nos doentes com CCR sugerindo um efeito anti-proliferativo de FTC-β em Treg.

Em conclusão, apesar do facto que o tamanho da amostra nesta coorte é pequena para tirar conclusões definitivas, o nosso estudo mostra para esta primeira vez que a alta expressão Foxp3 em células de câncer está associada a um prognóstico sombrio no CRC. análise de regressão multivariada de Cox demonstrou metástase linfática (categoria N) e expressão Foxp3 em células de cancro do cólon parâmetros prognósticos como significativos da sobrevivência no CRC humano.

Materiais e Métodos

declaração Ética

a aprovação ética para esta pesquisa foi obtido a partir Comitê de Ética em pesquisa da Universidade de Wuerzburg. Todos os pacientes que fornecem tecido do tumor, bem como amostras de tecido do cólon normais assinaram um termo de consentimento antes da remoção cirúrgica do câncer intestinal para permitir essa investigação a realizar.

Pacientes e controles

Sessenta cinco pacientes com diagnóstico histológico de câncer CRC submetidos a ressecção cirúrgica curativa em nosso departamento entre 01/2001 e 06/2004 foram incluídos no estudo. O estágio histológico do tumor foi determinada de acordo com o sistema de Union Internationale Contre Cancer le (UICC) -TNM estadiamento [31]. Os tumores foram avaliados quanto à localização, fase, e grau de diferenciação. Os dados relativos à idade, sexo, nível de infiltração parede e metástases em linfonodos foram coletadas em um banco de dados. visitas médicas regulares dos pacientes após terapia curativa foram realizadas em intervalos de acordo com as diretrizes governamentais para pacientes com tumor. Pacientes, submetidos a qualquer tratamento neoadjuvante ou R1 ressecção foram excluídos da análise. amostras de tecido de tumor, bem como amostras de tecido de cólon normais de pacientes foram congeladas instantaneamente em azoto líquido, e armazenado a -80 ° C até serem analisadas. tecidos do cólon normal a partir de indivíduos saudáveis ​​serviram como controlos (n = 10). A análise imunohistoquímica confirmou que nenhum tumor analisados ​​do grupo de pacientes expressa hMLH1 e hMSH2 indicativo para a instabilidade de microssatélites (reparo incompatível positivo [MMR] status). O fenótipo mucoso do CRC pode ser associado a reacções subcelulares de falsos positivos por imuno-histoquímica e, portanto, foi excluído do nosso estudo. As características clínicas da população do estudo estão resumidos no

Table 3

. Todos os pacientes completaram pelo menos 60 meses de acompanhamento após a ressecção.

cultura celular

As linhas celulares de cancro do cólon humano SW620, SW480 e HCT-116 foram obtidas de ATCC (Manassas, VA ) e as células foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO

2, utilizando meio RPMI 1640 (Life Technologies, Gibco, Carlsbad, CA) suplementado com 10% (v) de soro v /fetal de bovino (Life Technologies, Gibco, Carlsbad , CA), 1% (v /v) de L-glutamina (Biochrom AG, Berlim, Alemanha) e 1% (v /v) de penicilina /estreptomicina (Biochrom AG, Berlim, Alemanha).

A citometria de fluxo (FACS)

células cancerosas de linhas de células de cancro do cólon humano SW620, SW480, e HCT-116 foram colhidas em fase de crescimento exponencial utilizando uma solução de dissociação de células livres de enzima (Merck Millipore, Billerica, MA) e analisados para a expressão Foxp3. Depois de se lavar com dPBS (Life Technologies, Gibco, Carlsbad, CA) duas vezes, 5 × 10

5 as células foram tratadas com o kit de Foxp3 tampão de coloração (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante e incubaram-se com PE- anticorpo conjugado Foxp3 ou IgG1 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) durante 30 min a 4 ° C no escuro. A fluorescência de Foxp3 foi medida e analisadas com um citómetro de fluxo FACS (Coulter EPICS XL, Beckman Coulter, Brea, EUA).

imuno-histoquímica e imunofluorescência coloração

anticorpos

CD4 e CD25 foram fornecidos por Dako (Hamburgo, Alemanha). Dois Foxp3 clones de anticorpo diferentes (ab22510 monoclonal de ratinho e de cabra ab2481 policlonais) foram adquiridos a Abcam (Cambridge, Reino Unido), o anticorpo de TGF-β foi fornecida por Serotec (Duesseldorf, Alemanha), e IL-10 de ratinho por R D Systems (Wiesbaden -Nordenstadt, Alemanha). Os anticorpos de controlo de isotipo foram adquiridas de eBioscience (San Diego, EUA). anticorpos secundários utilizados para a coloração dupla imunofluorescência e imunohistoquímica foram fornecidos por Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. (Suffolk, Inglaterra). EPCAM secundário e anticorpos de CD4 conjugado com FITC foram AffiniPure burro anti-IgG de cabra e anticorpo secundário de Foxp3, a IL-10 e TGF-β foi Cy3-conjugado de IgG anti-ratinho de burro AffiniPure a uma diluição 1:200 (Jackson ImmunoResearch).

Para células de carcinoma preparações de cytospin colorretais dos pacientes com CRC foram cultivados em culturas primárias de curto prazo e linhas celulares de cancro de cólon humano estabelecidos foram colhidas em uma fase de crescimento exponencial utilizando a solução de dissociação de células enzima livre (Merck Millipore, Billerica , MA). Depois de se lavar com dPBS (Life Technologies, Gibco, Carlsbad, CA) duas vezes, as células foram ajustadas a uma concentração de 2 x 10

5 células /mL. Citospinas foram realizados com 50 ul de suspensão de células a 550 rpm durante 1 min num Cytospin4 Citocentrífuga (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).

A coloração de células T CD4, CD25, Foxp3, a TGF-β, e IL 10 foi realizada em cortes seriados criost�icas dos espécimes CRC 65 congeladas em tumores em estágio inicial (UICC I /II) e tumores em estágio final (UICC III /IV) com tecido do cólon normal, vizinhos e 10 espécimes de cólon normais. Todos os tumores coradas positivas para citoqueratina-20 (CK-20) (Dako, Hamburgo, Alemanha) e negativo para a citoqueratina-7 (CK-7) (Dako), um padrão característico para o adenocarcinoma do cólon [32]. Inicialmente foi avaliada H.E. secções de cada tecido tumoral para diferenciar entre as áreas de células de cancro, áreas do estroma e células do sistema imunológico que se infiltram. Em seguida, coradas para CD4, CD25, Foxp3, a TGF-β, e IL-10 na sequência de secções seriadas. Para citoplasmática Foxp3 expressão, citoplasmático perinuclear e padrão de coloração nuclear foram diferencialmente determinada [30]. secções criostáticas de série (5 um) foram incubadas com o anticorpo primário ou anticorpo de controlo e com o anticorpo secundário conjugado com FITC (Fluoresceinisothiocyanate). Em seguida, as lâminas foram subsequentemente incubadas com o segundo anticorpo primário seguido de incubação com o anticorpo secundário conjugado com Cy3. As lâminas foram contrastadas com DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) e coberto com polivinil-álcool meio de montagem (DABCO, Sigma-Aldrich) e analisados ​​utilizando uma câmara Zeiss (Oberkochen, Alemanha).

para imuno-histoquímica, o pré-tratamento (fixação) dos diapositivos era o mesmo que o descrito para imunofluorescência. Após a incubação com o anticorpo primário, utilizou-se uma peroxidase de rábano (HRP) -conjugated AffiniPure de burro anti-rato ou um anti-IgG de cabra de burro (Jackson ImmunoResearch). As lâminas foram subsequentemente incubadas em DAB (3,3′-diaminobenzidina) (Biogenex, San Ramon, EUA), contrastadas com Haemalaun e montado com Glycergel (Dako, Hamburgo, Alemanha). A quantificação de cada coloração imunoenzimática de células de tumor de 65 tecidos de tumor individuais em seis campos individuais ampliada (ampliação de × 400) para cada amostra de coloração foi marcado por contagem de células realizadas por dois investigadores independentes, cegos para a doença subjacente. Os campos ampliadas eram representativas para a seção do tumor inteiro. O resultado da coloração foi expressa em percentagem (%) de positividade. Todos os valores foram expressos como média ± SD.

reversa em tempo real quantitativa de transcrição-PCR análise

Para analisar a expressão do gene de CD4, CD25, Foxp3, TGF-β e IL-10 por RT-qPCR, que extraiu o ARN celular total utilizando o RNeasy Minikit da Qiagen (Hilden, Alemanha). Áreas de interesse (únicas regiões epiteliais) para cada secção de tecido foram microdissectados manualmente usando uma lâmina de bisturi. Quantidades iguais de áreas de tecidos foram avaliadas (2 × 1,5 cm

2 área de superfície por secção, espessura de 10 um). extração de RNA de amostras de pacientes e linhas de células do cólon humano estabelecidas (por Foxp3) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Os conjuntos de iniciadores foram obtidos a partir Qiagen, 18S RNA pares de primers (forward: TCA AGA ACG AAA GTC GGA GGT TCG, inverta: TTA TTG CTC AAT CTC GGG TGG CTG) foram desenhados por Biomers (Ulm, Alemanha). ADNc combinado do cólon humano foi adquirido a Pharmingen (Heidelberg, Alemanha) como controlo e foi padronizado para linha de base. A desidrogenase genes housekeeping gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH), de ß-actina, e 18S de ARN [33] foram usadas para a quantificação relativa de ADNc e de controlo de qualidade. Todas as reacções de PCR foram realizadas com um Opticon 2 Sistema Motor de DNA (MJ Research, Biozym, Oldendorf, Alemanha). O valor quantificação relativa, diferença vezes, foi expressa como 2

-ΔΔCt. Para a análise no câncer de cólon linhas celulares de expressão é indicado no valor médio, ΔCt e expressão relativa (genes Foxp3 /limpeza).

A análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando SAS 9.2. A sobrevivência global foi definida como o período de tempo entre a aleatorização e morte de qualquer causa. Pacientes, que foram perdidos para follow-up foram censurados na data do último contato. A sobrevivência global foi avaliada por meio de PROC PHREG (Proporcional de Cox perigos Modelo). Os parâmetros do potencial de prognóstico, identificadas em um procedimento gradual, foram investigados pelo método de Kaplan-Meier (PROC LIFETEST). Para a análise univariada significa valor de corte para a expressão alta ou baixa foi fixada em 12% para Foxp3 no tumor infiltrando Treg e 16% para Foxp3 em células cancerosas. A análise univariada de significância para a expressão Foxp3 de tumor infiltrando Treg e as diferenças de expressão em células de câncer em curvas de sobrevida foram avaliadas pelo teste Log-rank. Da mesma forma curvas de sobrevida foram comparados para as categorias N e T, bem como tumor primário.

Dois grupos independentes de pacientes foram analisadas pelo teste t de Student (Satterthwaite). Mais de dois grupos foram analisados ​​aplicando PROC GLM (análise de variância) com o teste post-hoc (Tukey). distribuições de frequência foram comparados usando tabelas KXM (Chi-Quadrat). coeficiente de correlação de Pearson foi usado para descrever e testar correlações bivariadas. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Reconhecimentos

Os autores agradecem Mr. Dipl.-Math. Mathias Brosz para o conselho estatística e Sra Sabine Müller-Morath, Sra Mariola Dragan, Ms. Nadine Gutermuth, e Sra Ingrid Strauss por seu apoio técnico.