Abstract

Fundo

dipeptidil-peptidase IV (CE 3.4.14.5) (DPPIV) é uma peptidase serina envolvido na diferenciação celular, adesão, a modulação imune e apoptose, funções que controlam neoplásica transformação. Estudos anteriores demonstraram expressão alterada e da atividade do tecido e circulando DPPIV em vários tipos de câncer e propôs a sua utilidade potencial para o diagnóstico precoce do câncer colorretal (CRC).

Métodos e resultados principais

A actividade e expressão de mRNA e proteína de DPPIV foi prospectivamente analisado em adenocarcinomas, adenomas, mucosa colorectal não envolvido e plasma de 116 pacientes com CCR por fluorimétrica, quantitativa métodos imuno-histoquímica RT-PCR e. Os resultados foram correlacionados com os dados patológicos clássicos mais importantes relacionados com a agressividade e com taxas de sobrevida em 5 anos. Os resultados mostraram que: 1) os níveis de actividade de DPPIV e de ARNm aumentada em neoplasias colorectais (teste de Kruskal-Wallis, p 0,01); 2) Ambos os adenomas e CRCs apresentada a imunocoloração citoplásmica positiva com reforço membrana luminal; 3) atividade plasmática DPPIV foi menor nos pacientes com CCR do que em indivíduos saudáveis ​​(Mann-U test, p 0,01); 4) A atividade DPPIV Plasmatic esteve associada ao pior sobrevida global e livre de doença (-rank log P 0,01, Cox análise p . 0,01)

Conclusão /significado

1) Up-regulação de DPPIV em tumores colorrectais sugere um papel para esta enzima na transformação neoplásica de tecidos colo-rectais. Esta descoberta abre a possibilidade de novos alvos terapêuticos nesses pacientes. 2) Plasmatic DPPIV é um fator prognóstico independente na sobrevida dos pacientes com CCR. A determinação dos níveis de actividade DPPIV no plasma pode ser uma maneira segura, minimamente invasivo e de baixo custo para definir a agressividade do CRC na prática diária

Citation:. Larrinaga G, Perez I, Sanz B, Beitia M, Errarte P, Fernandez, A. et al. (2015) dipeptidil-peptidase IV Actividade está correlacionada com cancro colorectal prognóstico. PLoS ONE 10 (3): e0119436. doi: 10.1371 /journal.pone.0119436

Editor do Academic: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPÃO

Recebido: 07 de setembro de 2014; Aceito: 14 de janeiro de 2015; Publicação: 19 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Larrinaga et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações do Governo Basco (IT8-11 /13), da Universidade do País Basco UPV /EHU (UFI 11/44), eo Gangoiti Fundação Barrera. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

CRC é a terceira neoplasia maligna mais comum em homens e mulheres nos Estados Unidos, com mais de 136.500 novos casos estimados e mais de 50.000 mortes estimadas em 2014 [1]. Europa e outras regiões desenvolvidas mostram taxas semelhantes de incidência e mortalidade [2]. Tradicionalmente relacionadas com hábitos alimentares [3], a sua frequência tem aumentado nas últimas décadas nos países ocidentais, como resultado do estilo de vida moderno para tornar-se um problema de saúde de grande preocupação. enormes recursos estão sendo investidos na prevenção e diagnóstico precoce da doença. campanhas de rastreio de base populacional tentar descobrir o máximo cedo tumores e lesões precursoras do possível, com o objetivo de diminuir a incidência da doença, para simplificar o manejo clínico de pacientes uma vez que a lesão se desenvolve, e para melhorar a sobrevivência.

do ponto de vista patológico, lesões adenomatosos no intestino grosso são precursores do CRC [4,5] ea sequência adenoma-carcinoma ainda fornece um modelo sólido para a pesquisa sobre a carcinogênese [6] totalmente aceito. No entanto, um grande número de processos metabólicos celulares ainda largamente desconhecidos estão envolvidos na origem e o desenvolvimento dos processos neoplásicos [7].

peptidases desempenhar um papel-chave na carcinogénese de várias maneiras, por exemplo regulando péptidos bioactivos que sejam crucial no crescimento neoplásico e de resposta imune, degradar a matriz extracelular, actuando como moléculas de adesão ou participar na sinalização intracelular [8]. Além disso, alguns estudos têm demonstrado que a atividade e expressão destas enzimas variam em tumores diferentes, dependendo dos vários parâmetros patológicos como grau histológico, Palco, e sobrevida do paciente [8-12]. Por esta razão, peptidases são ferramentas úteis para o desenvolvimento de estratégias clínicas para tratamento e acompanhamento de pacientes com câncer.

dipeptidil-peptidase IV (CE 3.4.14.5) (DPPIV), também conhecido como diferenciação de cluster antígeno CD26 , é uma peptidase de serina expressa numa variedade de células incluindo epitélio, endoteliais e linfócitos [13]. Como outras glicoproteínas ligadas a membranas, também pode ser libertado sob a forma activa a fluidos corporais, tais como plasma, soro e urina [14]. cliva DPPIV dipéptidos N-terminal a partir de péptidos bioactivos seleccionados, incluindo algumas citocinas, quimiocinas e neuropeptídeos, levando a sua inactivação e /ou degradação. Independente da sua actividade enzimática, a DPPIV interage com os componentes da matriz extracelular (ECM), incluindo o colagénio e a fibronectina, regulando, assim, as interacções célula-célula e célula-ECM, e com vários receptores e proteases, que leva à secreção de metaloproteases de matriz (MMPs). Através destas funções múltiplas, de DPPIV regula diversos processos biológicos incluindo a diferenciação celular, adesão, apoptose e modulação imune, funções que controlam a transformação neoplásica [13].

Muitos estudos têm descrito que a expressão e a actividade de DPPIV é significativamente alterado em várias tecidos de tumores sólidos e que estas alterações estão associadas com o grau do tumor, estágio e os pacientes sobrevida de 5 anos, que apontam para esta enzima como uma ferramenta de diagnóstico potencial e alvo terapêutico [12,13,15]. Além disso, foi demonstrado que os níveis de sangue de DPPIV são significativamente mais baixos em pacientes com cancro do que em indivíduos saudáveis, uma descoberta que tornou-se de grande interesse no desenvolvimento de marcadores tumorais adicionais [14,16-19].

em relação CRC, dois estudos recentes observaram que a maior expressão imunohistoquímica de DPPIV em tecidos CRC está correlacionada com metástases e pior sobrevida global dos pacientes CRC [20] e que os níveis circulantes de DPPIV estão correlacionados com a recorrência distante da CRC [21]. Nós e outros grupos também descrito que o perfil de outras peptidases de serina relacionadas com a DPPIV expressão e actividade variar ao longo da sequência adenoma-adenocarcinoma e que são independentemente correlacionado com a sobrevivência de pacientes de CRC [22-26]. Todas estas evidências acumuladas apontam para as análises de peptidases de serina tais como DPPIV como ferramentas promissoras no desenho de novos biomarcadores de diagnóstico /prognóstico e alvos terapêuticos no CRC [14,20-26].

Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi estudar de forma prospectiva os perfis metabólicos e expressão de DPPIV em pacientes com CRC analisando tecido a partir das amostras de seqüência adenoma-adenocarcinoma e plasma, e correlacionar os resultados obtidos com parâmetros histopatológicos clássicos para o prognóstico de tumores e sobrevivência .

Materiais Métodos

Os autores declaram que todos os experimentos realizados neste estudo cumprir com os regulamentos legais espanholas e da União Europeia em vigor. As amostras e os dados de pacientes incluídos no estudo foram fornecidos pelo Biobank Basco de Investigação-OEHUN (www.biobancovasco.org). Todos os pacientes foram informados sobre o uso potencial de investigação dos seus tecidos cirurgicamente ressecados, e aceitou esta eventualidade através da assinatura de um documento específico aprovado pela ética e científica Comités do Sistema País Basco de Saúde Pública (Osakidetza) (CEIC 11/51).

os pacientes

Um total de 116 pacientes com CCR foram prospectivamente incluídos no estudo. Todos os pacientes receberam colectomias parciais. A distribuição topográfica foi de 41 direita lados CRCs, 51 deixaram lados e 24 do reto. 7 pacientes receberam a terapia pré-operatória, 49 pacientes receberam quimioterapia ou quimio-radioterapia após ressecção, e 60 pacientes não receberam qualquer terapia.

Em 20 pacientes, pólipos adenomatosos tanto e adenocarcinomatous foram diagnosticados. 13 adenomas foram tubular, 6 eram adenomas túbulo e 1 adenoma viloso. Além disso, 16 apresentaram leve displasia a moderada e 4 apresentaram displasia de alto grau. O tamanho médio foi de 2,1 centímetros (com uma gama de 0.6-4cm). Estes 20 casos foram utilizados para analisar a atividade DPPIV e expressão de mRNA /proteína em toda a sequência normal mucosa-adenoma-adenocarcinoma.

O Comité Misto americana sobre o sistema de Câncer (AJCC, 7

th edition) [27 ] foi aplicado para atribuir estágio e grau. Follow-up foi fechada em 30 de junho de 2014. Naquele tempo, 43 pacientes (37%) tinham morrido da doença. O seguimento médio foi de 53 meses (intervalo 4-88).

O plasma também foi coletado no pré-operatório e analisados ​​em 98 destes pacientes. Plasma de 72 voluntários saudáveis, sem história clínica de doenças neoplásicas foi usado como amostra de controlo.

Os dados clínicos incluídos no estudo foram obtidos a partir dos registos clínicos dos doentes e são resumidos na tabela 1.

Tissue espécimes

ressecções cirúrgicas foram submetidos

em fresco

ao Pathology Lab dentro de um período de 30 minutos após a remoção. O material para este estudo vem do excesso de tecido de diagnóstico patológico. Manipulação de amostras foi realizada seguindo protocolos convencionais para a gestão de ressecções cirúrgicas de cólon e reto [28]. As características do tumor foram reconhecidos no exame macroscópico e fragmentos de tecidos tumorais e não tumorais foram congelados em isopentano e armazenados a -80 ° C seleccionada. procedimentos de rotina no Pathology Lab incluídos fixação de formalina do espécime e inclusão em parafina cirúrgica dos fragmentos de tecidos selecionados para exame histopatológico. lâminas histológicas foram coradas com hematoxilina-eosina. Além disso, as amostras de sangue venoso periférico de 98 destes pacientes foram obtidas antes da cirurgia e centrifugou-se a 1500 rpm durante 15 minutos. O plasma obtido também foi armazenada a -80 ° C. ensaio de enzima foi realizada no plasma foi obtido a partir de 72 voluntários saudáveis ​​(emparelhados por sexo e idade).

A preparação da amostra

amostras tumorais explantadas foram homogeneizadas em 10 mM de tampão Tris-HCl a pH 7,4, durante 30 segundos a 800 rpm utilizando um homogeneizador Heidolph Selecta PZR 50, e ultracentrifugado num aparelho Centrikon T-2070 Kontron Instruments em 100000

g

durante 35 minutos. Para evitar a contaminação com as enzimas solúveis, os sedimentos resultantes foram lavadas três vezes por suspensão em tampão Tris 10 mM-HCl a pH 7,4. Os sedimentos foram então homogeneizados em tampão Tris 10 mM-HCl a pH 7,4, e centrifugadas a baixa velocidade (1500

g

) durante 3 min para purificar as amostras. Os sobrenadantes assim obtidos foram utilizados para determinar a actividade de DPPIV e de concentrações de proteína. Todos os passos acima mencionados foram realizados a 4 ° C.

medições da actividade DPPIV

a actividade de DPP IV foi medida em triplicado usando H-Gly-Pro-β-naftilamida como substrato, na sequência de um versão modificada do método de Alponti et ai. [29]. O ensaio baseia-se na fluorescência dos produtos gerados a partir da hidrólise do substrato pelo enzima. As reacções foram iniciadas por adição de 30-50 uL de amostra de 1 ml da mistura de incubação apropriado (50 mM de tampão Tris-HCl, pH 7,4, e aminoacil-β-naftilamida 0,2 mM). Após 30 min de incubação a 37 ° C, 1 ml de tampão de acetato de sódio 0,1 M (pH 4,2) foi adicionado à mistura para terminar a reacção. O produto libertado foi determinada medindo a intensidade de fluorescência com um Shimadzu RF-540 Spectrofluorophotometer (os comprimentos de onda de excitação e emissão eram 345 e 412 nm, respectivamente). Os espaços em branco foram usadas para determinar a fluorescência de fundo. A fluorescência relativa foi convertido em picomoles de produto usando uma curva padrão construída com concentrações crescentes de β-naftilamina.

Para verificar que a formação de β-naftilamina (β-Na) foi devida à acção de DPPIV e não devido a outros enzimas, foram realizados ensaios de inibição em tecido e no plasma de CRC com um inibidor específico da enzima (diprotina a, 0,2 mM). A liberação de β-NA foi inibida principalmente em tecidos colo-rectais (82%) e em amostras de plasma (86%).

Proteína concentração foi medida em triplicado pelo método de Bradford [30], utilizando BSA (1 mg /mL) como o calibrador. Os resultados de CRC os tecidos e em amostras de plasma foram registrados como unidades de peptidase por miligrama de proteína (UP /mg de prot) e por litro de plasma (UP /L), respectivamente. Uma unidade de actividade de peptidase (UP) é a quantidade de enzima necessária para libertar uma pmol de β-naftilamina por minuto. ensaios fluorogênicos foram lineares com respeito ao tempo de hidrólise e teor de proteína.

Imunohistoquímica

fixado em formalina e tecido embebido em parafina a partir de 20 CRCs, pólipos adenomatosos e os não envolvidos mucosa circundantes foram imunocoradas com um anticorpo monoclonal anticorpo específico para a DPPIV /CD26 (Novus Biologicals NB 100-59.021, coelho anti-humano, trabalhando diluição 1: 250). O processo de imunocoloração foi realizada de acordo com métodos de rotina em um imunohistoquímica automática (Dako Autostainer Plus). Em resumo, a actividade da peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação das lâminas em peróxido de hidrogénio a 3% em metanol absoluto durante 10 minutos. A recuperação de antígenos foi realizada em tampão de citrato (10 mM, pH = 6) por 15 minutos a 100 ° C num forno de microondas. O anticorpo primário foi aplicado durante 1 hora à temperatura ambiente. Uma reacção subsequente foi realizada com anticorpos secundários e polímero marcado com biotina livre enzima HRP do sistema de detecção EnVision-Flex (Dako, Carpinteria, CA). IgG não específica foi utilizado como um controlo negativo. Uma reacção positiva foi visualizado com solução diaminobenzydine seguido de contracoloração com hematoxilina.

análise em tempo real RT-PCR quantitativo

A expressão de

DPP4

, o gene que codifica DPPIV , foi analisada a partir de 20 no tecido CRCs, pólipos adenomatosos e os não envolvidos da mucosa circundante. Para evitar a degradação, as secções de tecido foram imersas em RNAlater imediatamente após a cirurgia e armazenado a -80 ° C até serem processadas. O ARN total foi extraído a partir de 20 mg de tecido, utilizando TriReagent (Sigma, St. Louis, MO). As amostras de ARN foram então incubadas com RNase-free DNase I e de RNasin (Promega, Madison, WI) para remover o ADN genómico residual. O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado a partir de 5 ug de ARN total de cada amostra humana utilizando o kit da primeira cadeia de síntese de cDNA (Roche, Mannheim, Alemanha). As amostras de ADNc resultantes foram amplificadas por PCR com pares de iniciadores específicos de oligonucleótidos concebidos com o iniciador de software de análise 3 e sintetizados por Sigma-Genosys (Cambridge, Reino Unido). Com base em experiências anteriores em carcinoma de células renais humana [15], [12] CRC e outros tecidos humanos [31] escolhemos da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (

GAPDH), da polimerase (ARN) II (DNA- Directed) polipeptídeo A (

POLR2A

), hipoxantina fosforribosil 1 (

HPRT1

), β-actina (

ACTB

), succinato complexo desidrogenase, subunidade A (

SdhA

), TATA ligação caixa de proteína (

TBP

) e peptidilprolil isomerase A (

PPIA

) como genes de referência endógenos. A sequência dos iniciadores utilizados para amplificar

DPP4

e os sete genes de manutenção são apresentados na Tabela 2.

A expressão de

DPP4

e os genes de limpeza foi quantificada em todos os ADNc por PCR em tempo real utilizando o aparelho de detecção em tempo real iCycler iQ (Biorad Laboratories, Hercules, CA, EUA). As experiências foram realizadas essencialmente como descrito anteriormente [12,15,32]. As diluições do modelo de cDNA foram preparados a partir de cada tecido e amplificado em triplicado usando SensiFAST mistura SYBR (Bioline Ltd., Londres, Reino Unido). Três controlos negativos (sem molde, sem transcriptase reversa e sem RNA na reacção de transcriptase reversa) também foram incluídos em cada placa para detectar qualquer possível contaminação. Após um arranque a quente (10 min a 94 ° C), os parâmetros utilizados para amplificação por PCR foram: 10 s a 94 ° C, 20 s a 60 ° C e 30 s a 72 ° C, durante 50 ciclos

em tempo real de dados de PCR foram expressos como a variação de dobragem da expressão do gene alvo em relação à expressão de ARNm de média geométrica (g) dos genes de manutenção, em cada amostra, como descrito por Vandesompele et ai. [33]. A mudança vezes na expressão do gene foi calculada pela fórmula: 2

-ΔΔ C

t, onde C

T é o ciclo limiar, calculada pelo software iCycler, ôc

T = (C

Ttarget gene-C

genes Tg.m.reference) e ΔΔC

T = (Sc

Ttest amostra-Sc

exemplo TControl).

as amostras do mesmo paciente sempre foram medidos em uma mesma corrida analítica para excluir variações entre corridas. dados de PCR obtidos em uma das amostras normais CRC foram arbitrariamente escolhido como controle, e essa amostra foi incluído em todas as experiências de PCR para corrigir possíveis variações interensaio.

A análise estatística

Kolmogorov-Smirnov e testes de Shapiro-Wilk foram aplicados aos dados obtidos a partir de amostras de tecido e de plasma, respectivamente, para saber se os números seguidos ou não de uma distribuição normal. Com base nesta informação (p 0,05), a actividade de DPPIV no tecido e no plasma foi analisada com sondas não paramétricos: testes de Mann-Whitney e teste de Kruskal-Wallis foram utilizados para detectar as diferenças entre dois ou três grupos, respectivamente

Finalmente, as curvas de Kaplan-Meier e teste log-rank foram realizados para avaliar a associação entre atividade DPPIV e sobrevida de 5 anos, comparando os grupos criados por pontos de corte com base na característica (ROC)-operacional do receptor. Um modelo de regressão de Cox foi utilizado para testar os efeitos independentes de variáveis ​​clínicas e patológicas e atividade DPPIV na sobrevivência. SPSS® 21.0 software foi utilizado para a análise estatística.

Resultados

atividade DPPIV e de expressão em tecidos colorretais do CRC pacientes

Quando a atividade DPPIV foi analisada ao longo do adenoma- colorectal sequência adenocarcinoma, uma actividade mais elevada foi encontrada em CRCs e adenomas que na mucosa adjacente não envolvido (teste de Kruskal-Wallis, p = 0,015).

DPP4

expressão de ARNm mostraram um padrão semelhante, a níveis mais elevados em ambos os neoplasmas do que no tecido não tumoral (teste de Kruskal-Wallis, p = 0,001). Estes resultados estão descritos na Tabela 3.

Quando os dados foram estratificados por distribuição topográfica dos CRCs, não encontramos qualquer diferença significativa (teste de Kruskal-Wallis, p = 0,965). atividade DPPIV tecido também foi semelhante entre os doentes que receberam tratamento pré-operatório, a terapia pós-operatório e os pacientes que não receberam qualquer terapia após a ressecção (teste de Kruskal-Wallis, p = 0,842).

Fig. 1 mostra a expressão imuno-histoquímica da DPPIV em adenocarcinoma do cólon, adenoma e mucosa adjacente normal. mucosa normal não expressou DPPIV imunocoloração. No entanto, ambos os adenomas (tubular, túbulo e vilosidades) e CRCs exibiu imunomarcação citoplasmática positiva com reforço membrana luminal. O componente inflamatório em todos os casos também foi positiva.

imunocoloração DPPIV está localizada no citoplasma das células de adenomas e CRC exibindo reforço membrana luminal.

actividade DPPIV de tecido de acordo com a 5-ano sobrevivência e características patológicas

para determinar os melhores valores de corte para a sobrevida global (oS) (Fig. 2A) e sobrevida livre de doença análises (DFS) (Fig. 2B), foram realizadas curvas ROC. Para a atividade DPPIV tecidos, 2600 UP Ponto /mg de proteína de corte mostraram os índices mais ideais de sensibilidade e especificidade (EP = 47% e Sp = 55% para o OS, e S = 48% e Sp = 55% para DFS) (Fig . 2A e 2B)

índices de sensibilidade e especificidade óptimas foram observados usando o seguinte valor de corte:.. 2600 UP /mg prot da atividade DPPIV tecido para oS (a) e DFS (B)

curvas de Kaplan-Meier e teste log-rank mostrou que OS de cinco anos e DFS de pacientes com CRC não se correlacionou com a atividade DPPIV tecidos (teste-log rank, p = 0,8 para OS, e p = 0,67 para DFS) (Fig. 3A e 3B, respectivamente).

a sobrevida global (a) e as curvas de sobrevida livre de doença (B) de pacientes com CCR de acordo com seu padrão de atividade DPPIV tumor. O número de pacientes em risco em cada grupo em momentos individuais também está incluído.

Da mesma forma, a estratificação da atividade DPPIV por diversas variáveis ​​patológicas não jogue qualquer resultado estatisticamente significativo (Tabela 4).

actividade DPPIV em amostras de plasma de pacientes CRC

no plasma a partir CRC atividade DPPIV pacientes foi significativamente menor do que em indivíduos saudáveis ​​(175 ± 7,2 UP /L vs. 218 ± 10,1 UP /L, de Mann-Whitney p 0,01) (Figura 4).. No entanto, a estratificação dos dados de acordo com variáveis ​​patológicas não deu qualquer resultado significativo (Tabela 5).

Os valores são médias ± SE de unidades de peptidase por litro de plasma (UP /L). (*) O teste t de Student, p . 0,01

Em amostras de plasma curvas ROC foram realizadas tanto para a atividade DPPIV e os níveis de antígeno carcinoembrionário (CEA). Para a atividade DPPIV plasmática, 165 UP /L valor de corte mostraram os índices de sensibilidade e especificidade mais ideal (SE = 64% e Sp = 63% para o OS, e S = 65% e Sp = 58% para DFS) (Fig. 5A e 5B). Um valor de corte de 5 ng /mL para o CEA, que é conhecido por ter um impacto prognóstico em CRC [34], demonstrou uma menor sensibilidade (44% de SO, e 39% para o DFS) mas maior especificidade (68% para OS e 64% para DFS) do que DPPIV (Fig 5A e 5B)

índices de sensibilidade e especificidade óptimas foram observados usando o seguinte valor de corte:.. 165 UP /L para a atividade DPPIV plasmática tanto para oS ( A) e DFS (B). Um valor de corte de 5 ng /mL para o CEA, apresentaram menor sensibilidade, mas maior especificidade do que DPPIV.

curvas de Kaplan-Meier e teste log-rank mostrou que tanto OS (Fig. 6) e DFS (Fig. 7) foram inversamente correlacionados com a atividade DPPIV plasmático. Assim, quando a atividade DPPIV plasmática foi maior do que 165 UP /L OS e DFS foram significativamente pior (-log rank p = 0,009 = 0,018, respectivamente) (Fig. 6A e 7A).

(A) curva de Kaplan-Meier eo teste de log-rank. análise (B) multivariada das variáveis ​​clínico-patológicas e atividade DPPIV plasmática na previsão OS. O número de pacientes em risco em cada grupo em momentos individuais também está incluído.

(A) curva de Kaplan-Meier e teste log-rank. análise (B) multivariada das variáveis ​​clínico-patológicas e atividade DPPIV plasmática na previsão DFS. O número de pacientes em risco em cada grupo em momentos individuais também está incluído.

Por outro lado, a análise multivariada mostrou que a atividade DPPIV plasmática (p = 0,001), grau histológico (p = 0,02 ) e invasão local (p = 0,01) foram factores independentes que influenciam OS paciente (Fig. 6B), e que a actividade de DPPIV plasmática (P = 0,005), invasão vascular (p = 0,02) e fase agrupados (p = 0,02) foram prognóstico independente fatores de DFS (Fig. 7B).

Discussão

a transformação maligna de normal a tecido canceroso está associada com modificações glicoproteína de superfície celular. Essas alterações fenotípicas podem desempenhar um papel crucial na oncogénese e podem ser marcadores úteis para distinguir tumores malignos de tecidos benignos [8]. No que diz respeito CRC, a sequência adenoma-carcinoma do intestino grosso descreve que a progressão gradual do normal para o epitélio displásico, e, portanto, a carcinoma, é o resultado da acumulação sucessiva de mutações genéticas que conduzem a níveis alterados de várias glicoproteinas, como algumas peptidases [6,8].

o primeiro resultado relevante em nosso estudo foi que DPPIV apresentaram maiores níveis de mRNA em lesões pré-neoplásicas adenomatosos e no CRC quando comparado com a mucosa circundante não envolvido, embora não se correlacionou com patológica variáveis ​​e com a sobrevivência dos pacientes de CRC de 5 anos. Anteriormente, foi relatado que a actividade e expressão de duas outras peptidases de serina, alfa proteína de activação de fibroblastos (FAP) e prolil endopeptidase (PEP), foi maior nos adenomas e nas fases iniciais de CRC, respectivamente [22,24]. Além disso, a expressão FAP correlacionados com pior sobrevida [22,23] e atividade PEP fez isso com uma melhor sobrevida global e livre de doença [25]. Embora essas influências divergentes sobre CRC prognóstico sugerem diferentes papéis ativos para essas peptidases de serina nesta doença, a expressão ea atividade aumenta destas peptidases em tecidos neoplásicos e pré-neoplásicas devem ser levados em conta na concepção de novas abordagens terapêuticas para o cancro colorectal.

Devido à sua expressão variável em tumores sólidos e suas diversas funções biológicas, o papel exato que DPPIV desempenha no cancro continua a ser elucidado. Tem sido descrito que a DPPIV podem promover ou impedir o desenvolvimento de tumores, dependendo do tipo específico de tumor ou na fase de desenvolvimento do tumor é [13]. Este fenómeno de especificidade tumor apresenta dificuldades práticas na aplicação inibidores de peptidase em terapias contra o câncer, e este ponto está a ser activamente investigados hoje em dia [35,36]. Uma nova tendência neste tópico consiste na utilização dos pró-fármacos citotóxicos activado para ser activado por peptidases específicas apenas quando estes peptidases são mais activas ou altamente expresso, visando a danificar a célula neoplásica, sem alterar a funcionalidade da enzima [35,36]. Alguns pesquisadores estão trabalhando em pró-drogas com FAP como um alvo [35]. Desde a sua DPPIV homóloga também é altamente ativo em adenomas e CRC, sugerimos que esta peptidase serina poderia ser alvo de pró-fármacos semelhantes.

glicoproteínas de superfície celular pode ser lançado para o espaço extracelular, aparecem em diversos fluidos corporais e tornaram-se soro útil ou biomarcadores plasmáticos para ajudar na triagem, diagnóstico, estadiamento, prognóstico e monitorização da terapêutica do câncer. O exemplo mais relevante no seguimento clínico de pacientes com CCR é o antígeno carcinoembrionário (CEA) [34]. No entanto, a análise de DPPIV no plasma ou no soro destes pacientes tenha provado ser um método fiável para a detecção precoce de CRC, sendo complementar para o exame de sangue clássico oculto nas fezes e outros marcadores biológicos que estão sob investigação clínica hoje em dia [14, 17-20].

Vários autores [14,17,19] descreveram diminuições nos níveis circulantes de pacientes DPPIV de CRC comparação com indivíduos saudáveis. Além disso, os aumentos de esta enzima têm sido observados no soro de metastático

vs. pacientes não metastáticos [14,17,19,20]. Estes dados foram obtidos por imunodetecção, sugerindo a sua utilidade potencial para o diagnóstico precoce e o acompanhamento clínico. Também detectou que a actividade de DPPIV medida por métodos f luorimétricos foi significativamente diminuída no plasma de pacientes de CRC. Por outro lado, verificou-se que esta actividade não foi correlacionada com o estado metastático ou com qualquer outra variável patológico.

As diferenças elevadas no número de pacientes entre os grupos com e sem metástases poderia estar na origem desta parcial discrepância. Outras causas também deve ser considerado, porque ele tem sido descrito que vários fenómenos biológicos podem influenciar a actividade de DPPIV circulante /CD26 sem afectar o nível de proteína. Neste sentido, a presença de moléculas que alteram a actividade desta enzima circulante tem sido relatada [37,38]. Nazarian et ai. [38] demonstraram em um estudo muito recente que pacientes com câncer de próstata metastático apresentaram diminuição da atividade DPPIV circulando, enquanto os níveis de proteína foram semelhantes no que diz respeito a pacientes com tumor primário localizado. Esta constatação apontou para um pequeno peptídeo que circula como uma possível causa desta inibição [38] e abre novas perspectivas de mais estudos para esclarecer a utilidade potencial da análise combinada dos níveis de actividade e proteína DPPIV no soro /plasma de pacientes com câncer.

uma vez que os níveis e as atividades do PEP e FAP plasmáticos também foram correlacionados com a sobrevivência de pacientes com CCR [19,25], o principal objetivo do nosso estudo foi analisar prospectivamente a correlação entre atividade plasmática da sua homóloga DPPIV e sobrevida em 5 anos dos pacientes. Os dados mostraram que os pacientes com atividades DPPIV plasmáticos mais elevados tiveram sobrevida global e livre de doença mais pobres. Estes dados mostraram melhor sensibilidade, mas pior especificidade do que os obtidos com o CEA. A análise multivariada demonstrou que DPPIV é um fator prognóstico independente influenciar a sobrevida do paciente CRC. Portanto, existem evidências convincentes de que a determinação de DPPIV circulante pode ser útil no diagnóstico precoce [14,17-19,21] e também no prognóstico de CRC.

A origem de DPPIV circulantes em pacientes com câncer é uma questão controversa. hipóteses correntes colocar a sua origem no fígado e as células do sistema imunológico [14] e no microambiente tumoral [8,14,19,38]. Foi realizada a análise imuno-histoquímica ao longo da sequência adenoma-carcinoma para conhecer a localização de DPPIV nos tecidos colorrectais. As células não neoplásicas de mucosa colorretal não manchar com DPPIV. Por outro lado, adenoma e células CRC mostrou imunomarcação citoplasmática positiva com reforço membrana luminal. Este padrão imuno-histoquímico concorda com a maior atividade e os níveis de mRNA temos também encontrados em neoplasias. Além disso, encontramos imunocoloração com DPPIV nas células inflamatórias da lâmina própria na mucosa normal e neoplásico. Este achado poderia sugerir que DPPIV é liberado de ambas as células imunes e neoplásicas em CRCs.

Em conclusão, o presente estudo demonstra que a DPPIV é regulado para cima em tecidos adenomatosos e CRC quando comparado com a mucosa não envolvido. atividade DPPIV plasmática é menor do que em indivíduos saudáveis ​​e está associada independentemente com pior sobrevida de 5 anos em pacientes com CCR. A determinação da actividade de DPP-IV no plasma é um método seguro, minimamente invasiva e barata, e pode ser complementar para a determinação dos níveis de proteína CD26 pacientes com CCR. Novos estudos, com maior número de pacientes, coleta pré-operatório e pós-operatório amostras de plasma em vários pontos de tempo [21], devem ser realizados para confirmar o valor preditivo destes resultados ao tempo de diagnóstico e durante o acompanhamento dos pacientes.

Agradecimentos

Agradecemos a Arantza Pérez (UPV /EHU) por sua contribuição técnica para este estudo e Professor Juan Bilbao (UPV /EHU) por seu apoio estatístico.