Abstract

histona deacetilase inibidores (HDACi) representam uma classe promissora de agentes epigenéticas com propriedades anticancerígenas. Aqui, relatamos que (S) -2, uma base HDACi-hidroxamato romance, mostrado anteriormente ser eficaz contra células de leucemia mielóide aguda, era também um potente indutor de apoptose /diferenciação em células LNCaP de cancro da próstata e PC3 humanos. Em células LNCaP (S) -2 era capaz de desencadear H3 /H4 acetilação da histona, fosforilação H2AX como um marcador de dano de ADN e a produção de G

0 /L paragem do ciclo

1 célula. Consistentemente, (S) -2 conduziu a expressão aumentada de ambos os níveis de mRNA e proteína p21 em células LNCaP, mas, ao contrário do SAHA, não em células da próstata PNT1A não tumorigénicas normais. Estudos mecanísticos demonstraram que a (S) a apoptose em células LNCaP desenvolvidos através da clivagem de pró-caspase 3 e 9 e de poli (ADP-ribose) -polimerase -2-induzida acompanhada pela perda dose-dependente do potencial de membrana mitocondrial. De facto, a adição do inibidor da caspase-Pan Z-VAD-FMK reduz grandemente a apoptose mediada por droga, enquanto o anti-oxidante

N-acetil-cisteína

era praticamente ineficaz. Importante, dados preliminares com ratinhos nus xenoenxertados com células LNCaP mostraram que a (S) -2 provocou uma diminuição no volume do tumor e um aumento da fosforilação da H2AX dentro das células cancerosas. Além disso, as células de cancro da próstata PC3 altamente metastáticos também eram sensíveis a (S) -2 que: i) a paragem do crescimento e apoptose induzida moderada; ii) as células para a diferenciação e acumulação de lípidos neutros direccionais; iii) redução da potencial capacidade de invasão de células através da diminuição da quantidade de actividade de MMP-9 e para cima de regulação de TIMP-1 de expressão; e iv) inibiu a motilidade celular e migração através da Matrigel. No geral, o (S) -2 tem provado ser um poderoso HDACi capazes de induzir a paragem do crescimento, a morte celular e /ou diferenciação de células LNCaP de cancro da próstata e células PC3 e, devido à sua baixa toxicidade e eficácia

In vivo

, também pode ser de interesse clínico para apoiar a terapia do cancro da próstata convencional

Citation:. Laurenzana a, Balliu M, Cellai C, Romanelli MN, Paoletti F (2013) Eficácia da desacetilase de histona Inhibitor (S) -2 contra LNCaP e câncer de próstata PC3 Human Cells. PLoS ONE 8 (3): e58267. doi: 10.1371 /journal.pone.0058267

editor: Chunhong Yan, Albany Medical College, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de abril de 2012; Aceito: 05 de fevereiro de 2013; Publicação: 04 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Laurenzana et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações de MIUR (Ministério da Educação, Universidades e Investigação PRIN 2006 a FP, # 200606139), da Universidade de Florença, Itália (ex 60% de 2009 e de 2010 a FP e MNR), Ente Cassa di Risparmio di Firenze 2007- 9 (Florença, Itália; # 2007,1019 para FP) e Associazione Italiana contro le Leucemie, Linfomi e Mieloma (AIL) sezione di Firenze para FP. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as mudanças epigenéticas são reversíveis rearranjos cromatina capazes de modular a expressão do gene dentro da célula, sem modificar sequência de DNA. A acetilação é o mais amplamente estudado modificação pós-traducional de proteínas histona [1], devido à actividade equilibrada das duas famílias de enzimas, nomeadamente as histona acetiltransferase (HATs) e desacetilases de histonas (HDAC) que catalisam a acetilação /desacetilação de histonas, respectivamente , e modificando deste modo a conformação da cromatina e a acessibilidade de DNA para factores de transcrição [2], [3], [4]. Além disso, os chapéus e HDACs contribuir para a modulação da expressão gênica por interacção directa com proteínas reguladoras chave nonhistone [5] como p53, GATA1, GATA2, receptor de ácido retinóico, NF-kB e proteínas do citoesqueleto, como α-tubulina [6], [7], [8]. Não é surpreendente, portanto, que as actividades destas enzimas aberrantes pode reprimir a transcrição de genes específicos onco-supressores e chumbo, eventualmente, para a formação de tumor [9], [10]. E, de fato, hipoacetilação histona, devido à sobre-expressão de HDAC, tem um papel reconhecido na tumorigênese de diferentes tipos de câncer que afetam o estômago [11], cólon [12], [13], de mama [14] e de próstata [15], [ ,,,0],16], [17].

com especial atenção ao câncer de próstata, esta é a malignidade não-cutâneo mais frequentemente diagnosticado e a terceira principal causa de mortes relacionadas ao câncer em homens no mundo ocidental. Embora um certo número de opções terapêuticas estão disponíveis para o cancro da próstata mais cedo, em pacientes recidivantes de tratamento primário com cirurgia e /ou radioterapia, ou a doença metastática que apresenta, a privação de androgénio permanece o esteio da terapia. No entanto, apesar da ablação de androgénios, praticamente todos os tumores, eventualmente progredir com doenças resistente à castração [18], [19], [20], que necessitam de ser tratados com agentes citotóxicos convencionais ou agentes epigenética, tais como inibidores de HDAC (HDACi). Este último emergiram como uma nova classe de agentes anti-cancro potentes capazes de induzir a paragem do crescimento tumoral de células, a diferenciação e /ou apoptose [16], [17]

In vitro

e agindo como sensibilizadores à radiação em células de cancro por baixo atividade -Regulamentação reparação do ADN [21], [22], [23]. Alguns destes HDACi mostrou no entanto várias limitações

in vivo

devido à sua alta toxicidade, baixa solubilidade, e meias-vidas curtas [24], [25]. Portanto, o desenvolvimento de novos HDACi com propriedades anticancerígenas e perfis baixos tóxico é um alvo crucial da investigação translacional.

Temos relatado anteriormente um novo conjunto de HDACi baseado em hidroxamato potente caracterizada por um anel 1,4-benzodiazepina ( BDZ) utilizado como o tampão e ligada, através de uma unidade de ligação tripla ligação, a uma cadeia alquilo linear que leva uma função hidroxâmico como o Zn

++ – grupo [26] quelante. Entre estes híbridos, um em particular, MC133 (S) -2 [doravante (S)

– Página 2] mostrou ser um agente pró-apoptótica muito eficaz no sentido de leucemia mielóide aguda culta e primário diferente células (AML)

in vitro

e

ex vivo

, e era praticamente seguro para ratos

in vivo

até 150 mg /kg /semana [27].

no presente estudo examinámos o potencial antitumoral de (S) -2 em duas das linhas mais amplamente investigados epiteliais humanas de células de cancro da próstata, isto é, a de LNCaP sensíveis ao androgénio, e o androgénio-insensíveis e altamente metastático PC3, usando o humano não tumorigénica PNT1A células epiteliais da próstata como o controlo. (S) -2 proliferação de células de câncer de próstata inibido, induziu uma maior resposta apoptótica em comparação com SAHA (ou Vorinostat; um dos melhores desempenhos HDACi aprovado pelo FDA para o tratamento de linfoma cutâneo de células T) [28], [29] em células LNCaP e também a uma menor extensão nas células PC3 altamente metastáticas cuja migração e invasão propriedades foram drasticamente reduzidos pela droga. Em contraste, as células epiteliais normais da próstata PNT1A eram praticamente insensível droga. apoptose importante, (S) induzida -2 em células LNCaP desenvolvido através de um mecanismo dependente de caspase.

Materiais e Métodos

Cultura de Células e tratamentos

não metastático LNCaP e metastático PC3 células cancerosas da próstata, e as células não tumorigénica humanos PNT1A epiteliais da próstata foram um presente tipo de P. Chiarugi (Dept. Ciências bioquímicas, Universidade de Florença), que obteve as linhas celulares da Colecção Europeia de culturas de células [30]. células da próstata humano foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS). As células foram mantidas a 37 ° C ° em 5% de CO

2 atmosfera humidificada. (S) -2 e SAHA (ou Vorinostat; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) [28], [29] foram dissolvidos em sulfóxido de dimetilo (DMSO, Sigma-Aldrich) a uma concentração de 0,1 M e armazenada no escuro à temperatura ambiente (RT). soluções de drogas de trabalho foram obtidas por diluição apropriada da solução-mãe com o meio de cultura. DMSO foi empregado como veículo, a uma dose final de ≤0.1% (v /v) em cultura, tanto para (S) -2 e SAHA. Em caspase experiências de inibição de Z-VAD-fmk (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA) e o anti-oxidante N-acetilcisteína (NAC; Sigma-Aldrich) foram adicionados em cultura de 2 h antes de (S) -2 adição.

Cell Cycle Analysis

células da próstata foram tratados durante 24 h sem /com 2,5 mM de drogas, em seguida, novamente suspensas numa solução de iodeto de propídio /RNase (BD PharMingen, San Diego, CA) e incubada à TA no escuro durante 15-30 minutos. As percentagens de células em relação ao G

0 /G

1, G

2 /M, e fase S foram determinados com a ajuda de Becton Dickinson FACSCalibur sistema.

Western blot

As células recolhidas foram ressuspendidos em 20 de tampão RIPA mM (pH 7,4), contendo um cocktail de inibidores de proteases (Calbiochem, Merck, Darmstadt, Alemanha) e tratou-se com ultra-sons (MICROSON XL-2000, Minisonix, Farmingdale, NY, EUA) . As proteínas foram doseadas pelo BCA Protein Assay (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA), analisadas por SDS-PAGE e transferência de Western como descrito noutro local [31]. As membranas foram sondadas com anticorpos primários contra: acetilo-H3, H4-acetilo, e H4 (Upstate Biotechnology, Millipore, Bilerica, MA, EUA); PARP, γ-H2AX, H2AX, H3 e Caspase 9 (Signaling Technology celular, Danvers, MA, EUA); α-tubulina e acetilado α-tubulina (Sigma-Aldrich), a caspase 3 e p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). preparações de IgG conjugados com peroxidase adequado (Sigma-Aldrich) foram utilizados como anticorpos secundários; o procedimento de ECL foi empregado para o desenvolvimento.

A quantificação da Membrana Mitocondrial Potencial

Para determinar mudanças na transmembrana da membrana mitocondrial induzida por drogas potencial (Δψm), as células foram coradas com JC-1 (Invitrogen , Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), um corante catiônico que apresenta potencial acumulação dependente na mitocôndria, indicada por uma mudança de emissão de fluorescência de verde (525 ± 10 nm) para vermelho (610 ± 10 nm). células LNCaP (0,5 × 10

6) foram tratados sem /com 2,5 e 5 uM (S) -2 durante 72 h e depois ressuspensos em RPMI 1640 contendo 15 ug /ml de JC-1 de corante durante 30 min à temperatura ambiente em o escuro; após o que as células foram lavadas e a fluorescência foi medida por citometria de fluxo. despolarização mitocôndrias é especificamente indicado por uma diminuição no vermelho a relação da intensidade de fluorescência verde [32].

Caspase 3 Activation Assay

células cancerosas da próstata (10

5 células /ml) foram incubados com 2,5 uM (S) -2 durante 48 h e, em seguida, submetidos ao ensaio de detecção da apoptose carboxifluoresceína FLICA Kit de caspase (caspase 3 FLICA, Tecnologia Immunochemistry, Bloomington, MN, EUA). As células foram coradas com o reagente FAM-DEVD-FMK FLICA dissolvida em PBS durante 1 h a 37 ° C, e lavadas duas vezes em PBS antes da realização do ensaio de citometria de fluxo.

técnica de zimografia

Análise da gelatinase (MMP-9) a actividade foi realizado como anteriormente descrito [33]. Resumidamente, as células PC3 foram semeadas em placas de 6 poços e tratadas com o aumento da quantidade de (S) -2 em meios isentos de soro durante 24 h. As aliquotas de meios condicionados (CM) foram misturados com 4 × (v /v) de tampão de amostra (0,25 mol /L Tris-HCl, pH 6,8, 0,4% de SDS, 40% de glicerol e azul de bromofenol), em seguida carregado numa SDS a 10% gel contendo 1 mg /mL de gelatina (Sigma-Aldrich) e executada sob condições não redutoras, à tensão constante de 125 V. Após a electroforese, o gel foi incubado em tampão de renaturação (2,5% de Triton X-100) à temperatura ambiente durante 30 min , lavou-se duas vezes com água destilada (10 min de cada vez), e, em seguida, incubadas com o tampão de desenvolvimento (50 mmol /L de Tris pH 8,0, 5 mmol /l, CaCl

2, 0,2 mol /l de NaCl e 0,02% de Brij-35 ) a 37C ° durante a noite, coradas em 0,5% de solução de azul de Coomassie durante 2 h e descorado com uma solução de [ácido acético a 5%, metanol a 10% (v /v) em água destilada] até bandas de actividade gelatinolítica foram visualizadas e, em seguida, medida por análise densitométrica com imagem J Software.

Ensaio

células PC3-cicatrização de feridas foram cultivadas em placas de 6 cm até confluência e, em seguida, a monocamada foi riscado usando uma fina ponta de pipeta estéril para produzir uma estreita ferida no substrato. O meio e os detritos foram aspirados e substituído com meio fresco, na presença de diferentes concentrações de (S) -2. Fotos foram tiradas antes e 24 h após a lesão com o auxílio de um Nikon E 4500 Photocamera (Nikon) em uma Nikon TMS-F de contraste de fase microscópio (Nikon Instruments, Florença, Itália).

Invasividade Ensaio

Para estas experiências foram usadas câmaras de Boyden em que os poços superior e inferior foram separadas por filtros de policarbonato porus revestidos com Matrigel (50 ug /filtro) (Becton Dickinson, BD, New Jersey, EUA). As culturas foram pré-tratadas com /sem (S) -2 (2,5-5 uM), durante 24 h e em seguida alíquotas de células PC3 (20 × 10

3) foram transferidas no compartimento superior da câmara. Capacidade invasiva de células foi avaliada após 6 h e expressa como o número absoluto de ± SD células presentes nos filtros; cinco campos microscópicos diferentes para cada condição foram examinados.

Red Oil O Coloração de lipídios neutros

lipídios neutros foram detectados (i) histoquimicamente [34] sobre monocamadas de células que foram rapidamente corrigidos com? -? 0 ° C de metanol, coradas com Oil Red O (ORO) (Sigma-Aldrich), e (ii) espectrofotometricamente (Cary 50 digitalização, Varian, Victoria, Austrália) a 510 nm através da gravação de absorvância de ORO a seguir à extracção ligado a células com isopropanol [35], [36]. acumulação ORO foi expressa como absorvância relativa unidade /mg de proteína celular.

Quantitativo de PCR em Tempo Real Análise

qRT-PCR foi realizada com ADNc transcrito reverso de células tratadas e não tratadas utilizando o 7500HT Applied Biosystems sistema de acordo com protocolos padrão. Fold de p21, MMP-9, e o TIMP-1 de indução foram calculados pelas mudanças de p21 ou MMP-9 ou valores de TIMP-1 em células não tratadas Ct

relação

e tratados foram normalizados para o rRNA 18S de amplificação era Ct realizada com a configuração de PCR padrão: 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos e de 60 ° C durante 60 segundos utilizando uma detecção com base SYBR Green (SYBR Green master mix; Applied Biosystems) e os seguintes iniciadores: para a p21, para a frente 5 ‘ -CTGCCCAAGCTCTACCTTCC-3 ‘? e reversa 5′-CAGGTCCA CATGGTCTTCCT-3′; para a MMP-9 directo 5’-GCTACCACCTCGAA CTTTGAC-3 ‘e inverso 5′-TGCCGGATGCCATTCAC-3′; por TIMP-1, directo 5’-CCAACAG TGTAGGTCTTGGTGAAG-3 ‘e inverso 5′-CTGTGGCTCCCTGGAACA-3’; e para 18S rRNA, frente 5’CGGCTACCACATCCAAGGAA-3 ‘? e reverso 5′-GCTGGAATTACCGCGGCT-3’.

Preliminar

in vivo

Experimentos com um xenoenxerto modelo murino

o protocolo e os resultados em relação a esta abordagem preliminar para

in vivo

experimento foi relatado na seção de Informação de Apoio (Figura S1).

Análise estatística

o Student

T

-test análise ou de uma via de variância foram usadas para avaliar a significância estatística dos resultados. A diferença entre os valores foi considerado significativo em

P

≤ 0,05.

Resultados

(S) -2 Pede células LNCaP a G

0 /G

1 celular parada do ciclo e alterações na morfologia

células LNCaP, cultivadas sem /com o aumento (S) -2 concentrações (1, 2,5 e 5 mM) até 72 h, foram submetidos a uma dose e tempo-dependente paragem de crescimento para atingir 50% de inibição após dois dias de incubação com 1-2,5 uM (S) -2; enquanto que em culturas tratadas com 5 uM no número de células viáveis ​​diminuiu significativamente para níveis bem abaixo da densidade de revestimento de partida (Figura 1A). O efeito de (S) -2 sobre a progressão do ciclo celular de LNCaP como medido por citometria de fluxo mostrou que um 24-h de exposição a 2,5 uM da droga aumentou significativamente a percentagem de células em G

0 /L

1 (a partir de 59 a 93%) e diminuição da população de células em fase S (de 29 para 2%) (Figura 1B, em cima). Em addittion, após tratamento, a morfologia típica de células LNCaP alterado para um fenótipo fusiforme, bastante ampliada, para se obter monocamadas que foram caracterizados por uma perda parcial da célula e os contactos entre as células residuais (Figura 1B, meio) reduzidos. Consistentemente, o ciclo celular da proteína p21 inibidor – relatada como sendo de modulada por HDACi [37] – aumentada de uma maneira dependente do tempo em resposta a 2,5 uM (S) -2; a proteína foi detectada a partir de 6 h de tratamento, aumentaram após 15 horas e atingiu um pico às 24 h (Figura 1B, parte inferior)

(A), -. As células (10

5) foram semeadas em 6- bem placas e deixadas a ligar durante a noite. No dia seguinte (S) -2 foi adicionado às concentrações indicadas (0-5 uM) e as células viáveis ​​(tripano Blu-negativa) foram contados com o auxílio de uma câmara de Burker ao longo das seguintes três dias. (B, em cima) – (S) -2 induzida G

0 /G

prisão e ciclo 1 célula aumentou a expressão da p21. células LNCaP (2 × 10

5) foram tratados com 2,5 mM de droga durante 24 h, em seguida, foram destacadas e as alíquotas de suspensões de células foram incubadas com um iodeto de propídio (PI) solução durante 30 min e, subsequentemente, analisadas por citometria de fluxo (ADN quantidade, X-eixo; um total de eventos, eixo Y). A percentagem de células nas diferentes fases do ciclo celular foi calculada pelo programa ModFit e mostrado em cada painel. (B, no meio) – de contraste de fase de culturas de imagens complementares indicaram que (S) -2 induziu alterações morfológicas e uma diminuição marcada na densidade celular. (B, inferior) – As células foram tratadas com 2,5 jiM da droga para os pontos de tempo indicados e os níveis de proteína p21 foram monitoradas por imunotransferência; GAPDH foi também examinada para assegurar a igualdade de carregamento de amostras em cada pista. (C) – a paragem do crescimento celular de LNCaP não era estritamente dependente da presença contínua de droga. As células foram semeadas em placas de 6 poços (10

5 células /poço) e deixadas a ligar durante a noite. No dia após as culturas foram adicionados sem /com 2,5-5 uM (S) -2 para 3d e em seguida substituído por meio isento de droga para 3d adicional e em comparação com as culturas em que a droga foi constantemente mantida até 6d quando as células viáveis ​​foram contadas. Cada barra representa a média obtida a partir de poços em triplicado ± DP.

Além disso, a paragem do crescimento de células LNCaP expostas a (S) -2 não era estritamente dependente da presença contínua de droga. Esta suposição derivado a partir do número de células em culturas tratadas monitorização sem /com 2,5 ou 5 uM (S) -2 para 3d e em seguida substituído por meio isento de droga para 3d adicional, enquanto que em culturas de companhia a droga foi mantida de forma constante para a 6d. As células permaneceram praticamente preso mesmo após a substituição de meio isento de droga valores que eram semelhantes aos das culturas continuamente expostas ao fármaco (Figura 1C). Obtendo-se

(S) -2-induziu apoptose em células LNCaP Depende a ativação da Caspase Cascade e Rompimento de mitocondrial Integridade

Entre os eventos induzidos HDACi primeiros a nível DNA houve a formação de rupturas de filamentos duplos (DSB) e a fosforilação da H2AX para produzir γ-H2AX que ajuda na reparação de danos no DNA [38]. A resposta de células LNCaP de (S) -2, como determinado por imunocoloração demonstrou que 2,5 uM da droga aumentou significativamente o sinal γ-H2AX dentro de 6 horas e estes níveis eram bastante sustentada até 24 h, seguindo um padrão semelhante ao da droga acetil-H4 induzida (Figura 2A, em cima). Além disso, o aparecimento de apoptose, tal como indicada por clivagem do substrato poli caspase (ADP-ribose) polimerase (PARP), foi detectada a partir de 15 h de tratamento e aumentaram de forma constante até 48 h (Figura 2A, inferior) quando cerca de 80% de células LNCaP mostraram a: (i) activação mediada pela droga da caspase 3 (Figura 2B) e (ii) transferência dependente da dose na proporção de fluorescência de JC-1 vermelho /verde para denotar uma dissipação progressiva da transmembrana mitocondrial potencial (ΔΨm ) (Figura 2C)

(a), -. as células foram incubadas com o fármaco (2,5, 5 uM) para os pontos de tempo indicados. extratos de células inteiras foram analisados ​​por Western blot para detectar: ​​fosfo-H2AX, que é desencadeado na sequência de danos ao DNA; PARP clivada e o seu fragmento para denotar activaction apoptótica; e acetil-H4 devido à inibição da actividade de HDAC. GAPDH e α-tubulina foram utilizados como controlos de carga. (B) – As células não tratadas ou tratadas com a droga (2,5 mM durante 48 h) foram incubados durante o último 60 min com FAM-DEVD-FMK carboxyfluoresceine, em seguida, lavadas duas vezes com PBS e a sua fluorescência verde foi medida por citometria de fluxo. O histograma do número de eventos (eixo Y) frequência

contra

fluoresceína intensidade (eixo X) mostrou dois picos: as células caspase-negativos (células não marcados) foram à esquerda da região de P2; enquanto que as células de caspase-positivos que foram marcadas com Flica ocorreu dentro da região de P2. (C) – O tratamento com (S) -2 levado a um potencial transmembranar mitocondrial (ΔΨ) dissipação dependente da dose. Este efeito foi avaliado com o auxílio do corante JC-1, que agrega em mitocôndrias normais e emite fluorescência vermelha, mas não pode acumular-se nas mitocôndrias que tenham perdido o seu potencial transmembranar, e, por conseguinte, emite um sinal verde difusa citoplasmática em células mortas. despolarização mitocondrial é indicado por uma diminuição no vermelho /verde rácio de intensidade de fluorescência (/G R) [32]. Os valores foram normalizados usando o sinal de controlo (apenas veículo) como um valor arbitrário de 100%. Cada barra representa a média de duas experiências independentes realizadas em triplicado. (D) – células LNCaP foram tratadas com (S) -2 (2,5-5 uM) ou com (S) -2 (5 uM), mais 15 mM de N-acetilcisteína (NAC) aplicado 2 h antes da adição de drogas. A activação de apoptose foi revelado pela clivagem de PARP e a fosforilação de H2AX e estes eventos, bem como a acetilação α-tubulina mediada por drogas não foram contrastados por NAC. GAPDH foi utilizada como proteína de referência. (E) – Z-VAD-fmk impediu a clivagem induzida por drogas da PARP e a fosforilação de H2AX. As células LNCaP foram tratadas como acima mas, em vez de NAC, culturas foram pré-incubadas com 30 uM de Z-VAD-fmk, durante 2 h antes de ser tratada durante 24 h com a droga. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​para a clivagem de PARP, a activação de caspase 3 e 9, a fosforilação H2AX, bem como acetilação de H4 e α-tubulina; α-tubulina foi utilizada como controlo de carga.

Além disso, para investigar o mecanismo de (S) -2-apoptose induzida em células LNCaP, os efeitos do anti-oxidante N-acetil-cisteína ( NAC) e do inibidor da pan-caspase Z-VAD-fmk foram examinados separadamente. Diferentemente do que o relatado para células LMA [27], na presença de NAC 15 mM no meio de cultura não foi capaz de diminuir a clivagem induzida por drogas da PARP afastando assim um papel importante de espécies reactivas de oxigénio (ROS) em apoptose mediada por drogas (Figura 2D). Em vez disso, as experiências realizadas sem /com 30 uM pan-caspase inibidor de Z-VAD-fmk revelou que este composto era capaz de prevenir a activação mediada pela droga da caspase 9 e 3, bem como da clivagem de PARP e aumento de γ-H2AX [ ,,,0],39], sugerindo, assim, que (S) -2-apoptose induzida em células LNCaP desenvolvido através de um mecanismo dependente de caspases (Figura 2E). Vale a pena notar que a acetilação induzida por drogas de H4 e α-tubulina não foi prejudicada por Z-VAD-fmk.

(S) -2 metas células LNCaP, mas não as células normais da próstata PNT1A

O valor de translação potencial de (S) -2 foi avaliada comparando as actividades de ambos os (S) -2 SAHA e no que diz respeito à indução de apoptose e a acetilação das histonas em células LNCaP e células epiteliais de próstata PNT1A imortalizadas normais. (S) -2 solicitado um aumento acentuado nos níveis de fragmento de PARP clivada γ-H2AX e acetil-H3 em células LNCaP com muito mais eficácia do que o SAHA (Figura 3A, esquerda). Além disso, a (S) -2 pareceu ser relativamente segura para as células normais PNT1A que, em vez disso, foram um alvo sensível de SAHA como revelado pela clivagem da PARP após tratamento com 5 jiM da droga (Figura 3A, à direita), enquanto que os níveis de acetil-H3 PNT1A em células permaneceu relativamente constante, independentemente de ambos os indutores

(a) -. células LNCaP e PNT1A foram incubadas durante 24 h com quantidades crescentes de qualquer um de (S) -2 e SAHA. Os extractos celulares foram sujeitos a Western immunoblotting para detectar fosfo-H2AX, PARP clivada e o seu fragmento e acetil-H3; a-tubulina foi utilizada como controlo de carga. (B) – os níveis de ARNm de p21 a partir de células LNCaP e PNT1A incubadas com /sem (S) -2 ou SAHA durante 24 h foram medidos por quantitativa PCR em tempo real. PNT1A células normais eram, aparentemente, menos sensível a (S) -2, em comparação com SAHA. Colunas, média de três amostras independentes: bares ± SD; diferença significativa (

P

≤0.05). (C) -. A clivagem de PARP e níveis γ-H2AX induzida em células LNCaP e PNT1A por um H-tratamento de 24 com /sem (S) -2 foram comparadas no mesmo blot

Além disso, o crescimento prender em (S) -2-tratados células LNCaP foi associada com um aumento acentuado, dependente da dose (7-13 vezes) nos níveis de ARNm de p21 que foram igualmente reforçada por SAHA embora com uma progressão menos dependente da dose (Figura 3B, esquerda) . Deve notar-se que a expressão de p21 em células PNT1A não foi afectada pelo (S) -2, enquanto que surpreendentemente sobre-regulada por 5 uM SAHA (Figura 3B, direita). Além disso, os resultados obtidos através da comparação no mesmo blot os efeitos da (S) -2 em células LNCaP e PNT1A têm claramente demonstrado que LNCaP foram definitivamente mais sensibilidade do que as células normais PNT1A em termos de clivagem de PARP e níveis γ-H2AX (Figura 3C) .

(S) -2 induz a paragem do ciclo celular, apoptose e diferenciação de células PC3

O efeito de (S) -2 sobre a proliferação das células de cancro da próstata PC3 altamente metastáticos também tem sido avaliada. As células cultivadas durante três dias sem /com quantidades crescentes de (S) -2 sofreu uma inibição dependente da dose da proliferação (Figura 4A) de acordo com o aumento significativo na proporção das células paradas em G

0 /L

1 fase (de 46 a 75%) ea diminuição (40-15%) de células em fase S (Figura 4B). Consistentemente, p21 foi significativamente up-regulada a 15 e 24 h de tratamento (Figura 4C). De interesse, (S) -2-induzida níveis de acetil-H3 já foram reforçadas em 24 horas e aumentou ainda mais aos 48 h, justamente quando o efeito de SAHA começou a declinar (Figura 4D).

(A) – As células (10

5) foram semeadas em placas de 6 poços e deixou-se ligar durante a noite. No dia após a (S) -2 foi adicionado às concentrações indicadas e número de células foi determinado ao longo dos próximos três dias. (B) – As células foram incubadas durante 24 h com 2,5 uM (S) -2 para determinar a% de células marcadas com PI em diferentes fases do ciclo celular, tal como determinado por citometria de fluxo. Imagens de culturas não tratadas e tratadas foram tomadas com o auxílio de um microscópio de contraste de fase. (C) – os níveis de ARNm de p21 em células PC3 a partir de culturas tratadas com /sem (S) -2 quantitativa foram medidos por PCR em tempo real. (D) – A análise por Western blot comparativo dos níveis acetil-H3 em extractos celulares a partir de PC3 tratadas com qualquer um de (S) -2 ou SAHA; α-tubulina foi utilizada como controlo de carga.

No entanto, as células PC3, apesar da sua sensibilidade a (S) -2-mediada citostase, parecia ser mais resistentes do que as células LNCaP a apoptose induzida por drogas como demonstrado pelo facto de que um padrão semelhante de PARP clivada γ-H2AX e acetil-α-tubulina nas duas linhas celulares pode ser obtida apenas pelo tratamento das células PC3 com o dobro da dose empregue para as células LNCaP (Figura 5A). Além disso, o ensaio de fluorescência para a activação de caspase 3 em 2,5 uM (S) -2 indicou que cerca de 23% de células PC3 sofreram apoptose após 48 h-tratamento (Figura 5B)

ie

menos de um terço em relação para células LNCaP tratadas. Além disso, as células PC3 restantes no prato Após incubação durante 72 h, com quantidades crescentes de droga tornou-se maior em tamanho em relação aos controlos e acumulado dentro do citoplasma neutro gotículas lipídicas, coradas positivamente com óleo-Red O (ORO), como resultado de droga induzida a diferenciação adipogênica (Figura 5C), que já foi referida a ocorrência de estas células [40]

(a), -. As amostras de PC3 e LNCaP de células tratadas com /sem (S) -2- (2,5 e 5 ^ M) durante 24 horas foram analisados ​​por Western blot e imunodetectado para: PARP clivada e o seu fragmento, γ-H2AX e acetil-α-tubulina, enquanto α-tubulina foi utilizada como controlo de carga. (B) – As células não tratadas ou tratadas com 2,5 uM (S) -2 durante 48 h foram incubadas apenas 1 h antes de ser colhido com FAM-DEVD-FMK carboxyfluoresceine e, em seguida, lavadas duas vezes com PBS e a sua fluorescência verde foi medida por escoamento citometria (ver comentário do ponto B na Figura 2). (C) – A avaliação microscópica dos efeitos de (S) -2-se na acumulação de gotículas de lípido neutro dentro das células PC3 tratadas durante três dias. Após a fixação, as células foram coradas com uma solução ORO; quantificação da coloração ORO foi realizada como descrito em Materiais e Métodos.

(S) -2 Reduz Invasividade, migração e mobilidade das células PC3

As metaloproteinases de matriz (MMP), divulgado pela células tumorais para o ambiente extracelular são cruciais para promoveu-cancro degradação de tecidos e invasão juntamente com o processo metastático [41], [42], [43]. MMP-9 a partir do meio condicionado de culturas PC3 foi submetida a zimografia de gelatina e mostraram um decréscimo dependente da dose da MMP-9 atividade (Figura 6A) que foi acompanhada por um ligeiro, mas não significativo, a diminuição da MMP-9 de expressão (Figura 6B, esquerda). Em vez disso, a expressão do inibidor de tecido de metaloproteinase-1 (TIMP-1) – conhecido por exercer efeitos anti-metastáticos, contrastando a actividade da MMP-9 e outras MMPs [44], [45] – foi notavelmente aumentada após 24 h de tratamento (Figura 6B, direita)

(a), -. as aliquotas de meios condicionados a partir de culturas PC3 foram incubadas com /sem (S) -2 na ausência de FCS foram submetidas a zimografia de gelatina e a análise densitométrica das MMP actividade -9 (percentagem de controlo). (B) – os níveis de MMP-9, e o TIMP-1 de mRNA a partir de células PC3 tratadas com /sem (S) -2 durante 24 horas, foram determinadas por quantitativa PCR em tempo real. (C) – (S) -2 motilidade celular PC3 inibido

in vitro

. As culturas confluentes foram “ferido” com o auxílio de uma ponta de plástico estéril e mantidas sem /com quantidades crescentes de droga durante 24 h. A microscopia de contraste de fase foi usada para tirar fotos das monocamadas. (D) – (S) -2 diminuiu invasividade de PC3. As culturas foram pré-tratadas com /sem (S) -2 (2,5-5 uM), durante 24 h e em seguida alíquotas de células PC3 (20 × 10

3) foram transferidas no compartimento superior da câmara. Células que migraram através do Matrigel nos filtros de câmaras de Boyden foram contadas depois de 6 h, e expressa como o número absoluto de células ± desvio padrão; cinco campos microscópicos diferentes (ampliação: x200) para cada condição foram examinados e diferença significativa entre as amostras foi estabelecida em

P

≤0.05

Além disso, os resultados do “cicatrização de feridas”.