Abstract
Fundo
câncer epitelial de ovário é o mais letal de todas as malignidades ginecológicas e câncer de ovário seroso de alto grau (HGSC) é o subtipo mais comum de câncer de ovário. O objetivo deste estudo foi determinar a frequência e tipos de mutações somáticas ponto em HGSC usando um protocolo de detecção da mutação chamada OncoMap que emprega tecnologia de genotipagem baseados em espectrometria de massa.
Metodologia /Principais Achados
o Center for Cancer Genome Discovery (CCGD) Programa no Instituto do Câncer Dana-Farber (DFCI) adaptou uma plataforma de genotipagem de alto rendimento para determinar o estado de mutação de um grande painel de genes de câncer conhecidos. O protocolo de detecção de mutações, denominado OncoMap foi expandida para detectar mais de 1000 mutações em oncogenes em 112 (FFPE) amostras de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina. Foi realizada OncoMap em um conjunto de 203 FFPE avançado encenado espécimes HGSC. Nós isolado ADN genómico a partir destas amostras, e depois de uma bateria de testes de controlo de qualidade, correndo cada uma destas amostras na plataforma V3 OncoMap. amostras de tumores de 56% (113/203) abrigavam mutações candidatos. Sessenta e cinco amostras apresentaram mutações individuais (32%), enquanto as restantes amostras tinham ≥2 mutações (24%). 196 chamadas mutação candidatos foram feitas em 50 genes. As mutações de oncogenes somáticas mais comuns foram encontrados em
EGFR
,
KRAS, PDGRFα, KIT e PIK3CA
. Outras mutações encontradas nos genes adicionais foram encontrados em frequências mais baixas ( 3%).
Conclusões /Significado
análise Sequenom usando OncoMap em DNA extraído de amostras de câncer de ovário FFPE é viável e conduz a a detecção de mutações potencialmente druggable. Triagem HGSC de mutações somáticas em oncogenes pode levar a terapias adicionais para esta população de pacientes
Citation:. Matulonis UA, Hirsch M, Palescandolo E, Kim E, Liu J, van Hummelen P, et al. (2011) High Throughput Interrogatório de Somatic Mutações no grau Cancer alta seroso do ovário. PLoS ONE 6 (9): e24433. doi: 10.1371 /journal.pone.0024433
editor: Lin Zhang, da Universidade da Pennsylvania School of Medicine, Estados Unidos da América
Recebido: 02 de agosto de 2011; Aceito: 09 de agosto de 2011; Publicação: 08 de setembro de 2011
Direitos de autor: © 2011 Matulonis et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O financiamento foi fornecida pelas seguintes fontes: Programa do cancro do ovário especializada de Investigação de Excelência (P50CA105009), o Franchi Fundo cancro do ovário Madeline, e do Conselho Executivo da Mulher do Instituto de Câncer Dana-Farber. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses: Drs.. Hahn e Drapkin tanto servir como consultores para e ter recebido bolsas de pesquisa da Novartis Pharmaceuticals. Esta não alterou a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas sobre a partilha de dados e materiais. Os outros autores não têm conflitos de interesse para relatar.
Introdução
cancro do ovário
epitelial é o mais letal de todos os tumores malignos ginecológicas, e novos tratamentos são necessários para ambos os pacientes recém-diagnosticados, bem como pacientes com câncer recorrente [1]. Dentro de câncer epitelial de ovário, HGSC é o subtipo mais comum e está associado com a capacidade de resposta a quimioterapia inicial, quando diagnosticada pela primeira vez. No entanto, a maioria dos cânceres se repetem e se tornam cada vez mais resistentes à quimioterapia. O sucesso da quimioterapia convencional para o tratamento de cancro do ovário atingiu um patamar, e novos meios de molecularmente e caracterizar geneticamente cancro do ovário, a fim de “personalizar” e melhorar o tratamento são necessários [2], [3].
mutações pontuais ativadoras em proto-oncogenes tem sido observado em muitos cancros humanos, e tais mutações pode conferir ‘vício oncogene’ sobre as células cancerosas relevantes [4]. Esta dependência oncogene fornece uma base para o direcionamento oncogenes activados no tratamento como exemplificado pelo sucesso do imatinib e erlotinib em cancros que abrigam
BCL-ABL
e
EGFR
alterações, respectivamente. agora provas abundantes indica que estas mutações de ganho-de-função não ocorrer aleatoriamente dentro de oncogenes, mas em vez disso, as mutações que afectam um número relativamente pequeno de codões representam a grande maioria dos acontecimentos de activação no cancro. Por exemplo, as alterações de uma única base nos codões 12, 13 e 61 no
KRAS
mutações compreendem a maioria das mutações ativadoras oncogênicos [5]. Da mesma forma,
BRAF
mutações que afetam códon 600 constituem 90% de melanoma
BRAF
mutações; alterações genéticas em um adicional de 10-12 códons responsáveis pela maior parte dos restantes associados ao câncer
BRAF
mutações identificadas até à data [6], [7].
Para identificar estas mutações oncogênicas em arquivo tecidos, nós adaptamos uma plataforma de genotipagem de alto rendimento para determinar o estado de mutação de um grande painel de oncogenes conhecidos de cancro [8], [9]. Especificamente, temos desenvolvido um protocolo de detecção de mutações, denominado OncoMap, que emprega a tecnologia de massa por espectrometria de genotipagem baseada em (Sequenom) para identificar mutações oncogénicas. A versão actual deste protocolo é capaz de detectar mais de 1000 mutações em 112 genes comumente mutado em ambas as amostras de tecidos congelados e embebidos em parafina frescos. Este relatório descreve a aplicação bem sucedida de OncoMap a uma coorte de pacientes com HGSC avançada, a fim de identificar mutações oncogênicas.
Resultados
Na análise OncoMap inicial, 56% (113/203) tumor amostras abrigava candidatos mutações oncogênicas. Sessenta e cinco amostras tinham mutações individuais (32%), enquanto o restante tinha ≥2 mutações (24%). No total, 196 chamadas de mutação candidatos foram feitas em 50 genes.
Os oncogenes mais comumente mutados foram
EGFR
(9,4%),
KRAS
(4,5%),
PDGFRα
(4,5%),
KIT
(3,0%), e
PIK3CA
(3%); outros que foram menos comumente mutados incluídos:
BRAF
(1%),
CUBN
(0,5%),
e as ARN
(2,5%). Nós também identificou mutações em muitos outros genes em frequências mais baixas, incluindo:
ABL1
(2,5%),
STK11
(2,5%),
EPHA1
(2%),
RET
(1,5%),
SMARCB1
(1,5%),
ATM
(1%),
FLT3
(1%),
MLL3
(1%),
MYC
(1%),
NF2
(1%),
NOTCH1
(1%),
NTRK1
(1%),
PIK3R1
(1%),
robo2
(1%),
APC
(0,5%),
FES
(0,5%),
FYN
(0,5%),
GATA1
(0,5%),
NF1
(0,5%),
NTRK3
(0,5 %),
PALB2
(0,5%),
PKHD1
(0,5%),
PTEN
(0,5%),
RUNX1
(0,5%) ,
SMO
(0,5%),
SPTAN1
(0,5%), e
TSHR
(0,5%).
A mutação somática mais comum identificada envolveu o gene supressor de tumores
TP53, que foi detectada em 24,8% das amostras. Desde OncoMap interroga apenas um subconjunto de
TP53
mutações e não detecta eventos de deleção, a frequência observada de
TP53
alterações concorda com recente trabalho do Projecto do Genoma do Câncer Atlas (TCGA) [10] que confirmou a descoberta de que
TP53
mutações são a mutação somática mais comum em cancros HGSC. Além disso, foram identificadas mutações em outros genes supressores de tumor incluindo
RB1
(3%) e
BVS
(3,5%).
mutações somáticas foram então validado pela HME, e os seguintes foram validados:
EGFR
,
HRAS
,
KRAS
,
ARN
,
PIK3CA
,
BRAF
,
RB1
,
TP53
,
ATM
,
CUBN
, e
FLNB
. Tabela S1 lista as mutações validados encontrados em nossa coorte de HGSC.
Discussão
O nosso grupo demonstrou que mutações somáticas oncogene pode ser detectado em HGSC usando um ensaio baseado Sequenom chamado OncoMap que usa DNA derivado a partir de tecido FFPE. Embora HGSC é caracterizada pelo número de mudanças de cópias do gene [11], as mutações de baixa frequência num certo número de genes oncogénicos foram encontrados em 56% dos cancros no nosso coorte de amostra 203, e muitas destas mutações são potencialmente druggable utilizando novos agentes biológicos. A maioria das mutações foram encontradas em baixa frequência, e mais mutações específicas foram encontradas em menos do que 5% das amostras. Validação usando HME foi realizada em genes de interesse, e vários genes importantes foram encontrados para ser mutado; todas as mutações não foram validados por causa do custo e nível de interesse. Na prática clínica, prevemos que todas as mutações identificadas pelo perfil OncoMap serão validados em laboratórios aprovados pelo CLIA.
Assim, OncoMap que usa a tecnologia Sequenom é capaz de rastrear barata para múltiplas mutações, utilizando DNA extraído de amostras de FFPE em cancros, tais como HGSC que têm múltiplas mutações presentes em baixa frequência. Outras vantagens do OncoMap incluem a capacidade de expandir rapidamente a biblioteca mutação “hotspot”, como mutações adicionais são descobertos e novos novos agentes biológicos são testados com sucesso. Limitações de OncoMap estabelecer que apenas “hotspot” mutações estão localizados e que a validação das mutações é necessário; outras mutações não incluídas no painel OncoMap vai ser desperdiçada. Embora exome todo ou sequenciamento do genoma inteiro é agora possível em laboratórios de pesquisa, o uso rotineiro destas tecnologias em amostras de parafina não é possível. Assim, OncoMap fornece um método de custo rápida, razoável para identificar mutações oncogênicas em amostras cancerosas humanas.
As implicações clínicas de mutações somáticas no HGSC são desconhecidos e terá de ser investigado. Mutações somáticas em cancros podem levar à activação constitutiva de vias de sinalização que são normalmente activados por receptores de factor de crescimento activados, e estas mutações podem levar a uma instabilidade genómica geral [12]. As alterações no número de cópias do gene e a expressão do gene, foram ambas demonstrou ser importante no cancro do ovário, enquanto que mutações têm sido sentida a ser menos importante [11].
Vários oncogenes mutados de interesse foram encontrados no nosso coorte de HGSC As amostras testadas e analisadas com OncoMap.
EGFR
foi encontrada para abrigar mutações em cerca de 10% dos casos, e inibidores de EGFR, tais como erlotinib pode ser testada neste subconjunto de cancros. No cancro do pulmão, estes inibidores são utilizados para tratar cancros que abrigam exão 20 variantes, variantes de codões 719, e substituições L858R além de outros tipos de
EGFR mutações
[13], [14]. Identificamos HGSC com uma variante códon 719 que foram validados pela HME. Assim, o teste de inibidores de EGFR parece justificado quando forem detectadas mutações EGFR. inibidores de EGFR foram testados em cancro do ovário com taxas de resposta de 10% ou menos [15] – [17]; no entanto, nenhum desses estudos prospectivamente testado cancros do ovário de mutações EGFR, uma prática rotineiramente feito por câncer de pulmão não-pequenas células que resultou na utilização orientada molecularmente de inibidores de EGFR.
EGFR
mutações e expressão foi testado para retrospectivamente de Schilder et al, e uma resposta parcial foi observada em 1 paciente que tinha uma mutação EGFR [17].
A nossa taxa de
PIK3CA
mutações de 3% encontrados em paralelos HGSC que encontraram pela Sanger Center [18]. Outros grupos relataram baixas taxas de ambos
AKT Comprar e
PIK3CA
mutações, mas maior freqüência de amplificação do gene de
PIK3CA
[19]. Inibidores da via da PI3kinase estão actualmente a ser estudados em cancro do ovário, e a actividade destes agentes tem sido relatada em cancro do ovário [20], [21]. Por exemplo, MK2206, um inibidor de AKT, foi testado num estudo de Fase 1 em pacientes com tumores sólidos avançados. Todos os 3 pacientes com câncer ovariano que foram inscritos neste estudo demonstraram uma redução em seus níveis de CA125, sugerindo atividade anti-tumoral de MK-2206 no câncer de ovário. GDC0941, um inibidor PI3kinase, também demonstrou atividade no câncer de ovário especificamente em situações de
PIK3CA
amplificação. Com o desenvolvimento de inibidores adicionais da via PI3kinase e por causa de actividade anti-cancro destes agentes em cancro do ovário, a identificação de aberrações desta via irá tornar-se cada vez mais importante em HGSC.
Outros genes validados de interesse encontrados no nosso estudo incluem
BRAF
,
KRAS
,
HRAS
, e
ARN
, e todos esses genes têm agentes biológicos disponíveis que poderiam direcionar os efeitos destas mutações oncogénicas.
TP53
mutações são encontrados comumente no cancro do ovário [22], e os nossos suportes de dados e paralelos esses dados
Este trabalho corrobora os dados TCGA recentemente publicados [10].; estudos futuros será necessário para correlacionar a presença destas mutações com actividade biológica e prognóstico do cancro e se estas mutações prever a actividade anti-cancro de agentes biológicos segmentados. Além disso, correlacionando mutações somáticas com outras avaliações objetivas da constituição genética de cancros, tais como perfil de expressão gênica e número de cópias do gene será vital para a compreensão de um quadro genético mais completo do HGSC.
Materiais e Métodos
pacientes e amostras dos pacientes
registros de Patologia foram analisados entre 1999 e 2004 da Divisão de Ginecologia Patologia da Hospital Brigham and Women, em Boston MA, e Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO) fase foram selecionados III ou IV HGSC casos de câncer de ovário. A Dana-Farber /Harvard Cancer Center Institutional Review Board (IRB) concedeu aprovação para coletar amostras de FFPE. Porque todas as amostras foram de-identificado, o IRB nos concedeu uma renúncia para recolher as amostras, sem consentimento do paciente.
amostras FFPE foram revisadas por um patologista oncologia ginecológica (MH) que analisou relatórios de patologia, bem como FFPE blocos de tecido e selecionadas as áreas de maior porcentagem de câncer que foram eventualmente tubular para extração de DNA. Os pacientes com mutações germinativas BRCA conhecida foram excluídos neste conjunto e estão a ser estudadas em um outro conjunto de dados. Foram selecionados um total de 203 amostras.
extracção de ADN e quantificação
O DNA genômico foi extraído das amostras de tecidos tubulares FFPE paciente com QIAamp DNA FFPE Kit Tissue (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, os núcleos foram desparafinados em xileno e mais lisadas em tampão de lise contendo desnaturante de proteinase K. O lisado de tecido foi incubada a 90 ° C para inverter a reticulação de formalina. Usando QiaCube, o lisado foi aplicada à coluna de ligação de ADN e a coluna foi lavada em série, e em seguida, eluiu-se em 30 ul de água destilada. O ADN genómico foi quantificada utilizando Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante. 250 ng de ADN genómico foi utilizado para a análise.
OncoMap v3.0 foi realizada em todas as amostras, e os genes e número de mutações testados na presente versão da versão OncoMap estão listados na Tabela 1. Inicialmente, foram concebidos iniciadores que permitem a detecção de mutações. DNA genómico derivado de tumor foi submetido a amplificação do genoma inteiro. Em seguida, a PCR multiplexada foi realizada em ADN genómico de tumor para amplificar regiões que albergam loci de interesse, ou nucleótidos “QUERY”. Após desnaturação, os produtos de PCR foram incubados com oligonucleótidos que recozimento imediatamente adjacente ao nucleótido consulta, e uma reacção de extensão do iniciador foi realizada na presença da cadeia de terminação de di-desoxinucleótidos que geram produtos de ADN específica para o alelo. produtos de extensão de iniciadores foram manchados em um chip especialmente concebidos e analisados por espectrometria de massa MALDI-TOF para determinar o estado de mutação. Uma vez que o alelo (ou mutação) de chamada depende exclusivamente da massa do produto de extensão do iniciador resultante, o ensaio não requer Sequenom rotulagem iniciador fluorescência caro e tem uma taxa de erro muito baixo. O custo de apenas de executar o ensaio mutacional OncoMap é de aproximadamente $ 200 por amostra independente do número de amostras analisadas.
Uma vez que as mutações foram identificadas, validação foi realizada com um subconjunto seleccionado das mutações usando o multi-base de HME extensão da química tal como descrito anteriormente [8], [9]. Iniciadores e sondas foram concebidos utilizando o software Sequenom MassARRAY Ensaio desenho 3.0, aplicando os parâmetros de extensão predefinida de multi-base, mas com as seguintes modificações: a entrada de nível máximo multiplex ajustado a 6; máxima iteração base de passe ajustado para 200.
Informações de Apoio
Tabela S1.
validados Mutações por HME. Esta tabela lista as mutações validados encontrados em nossa coorte de HGSC. A validação foi realizada por HME
doi:. 10.1371 /journal.pone.0024433.s001
(DOC)
Reconhecimentos
Os autores gostariam de agradecer Robert T. Jones, Christina K. Vai, e Christine A. Roden por seu trabalho sobre os aspectos técnicos de funcionamento de OncoMap nestas amostras.