Abstract

Introdução

Os microRNAs (miRNAs) desempenham papéis importantes na regulação de processos biológicos durante o nível pós-transcricional. Desregulamentação dos miRNAs tem sido observado em câncer, e miRNAs estão sendo investigados como potenciais biomarcadores para diagnóstico, prognóstico e previsão na gestão de câncer. Em tempo real quantitativa de polimerase de reacção em cadeia (RT-qPCR) é normalmente utilizado, quando se mede a expressão de miARN. normalização adequada dos dados de RT-qPCR é importante para garantir resultados fiáveis. O objetivo do presente estudo foi identificar miRNAs expressos de forma estável aplicáveis ​​como candidatos normalizador em futuros estudos de expressão miRNA em câncer retal.

Materiais e Métodos

Foi realizada de alto rendimento miRNA profiling (OpenArray ®) em dez pares de tecido de cancro rectal laser de micro-dissecados e estroma adjacente. A estratégia de expressão normalização média global foi aplicado para identificar os miRNAs expressos mais estavelmente para validação posterior. No primeiro experimento de validação, um painel de miRNAs foram analisados ​​em 25 pares de micro dissecados tecido de câncer retal e estroma adjacente. Posteriormente, os mesmos miRNAs foram analisados ​​em 28 pares de tecido de cancro rectal e mucosa rectal normal.

Resultados

A partir do experimento de perfil miRNA, miR-645, miR-193a-5p, miR- 27a e deixou-7g foram identificados como sendo expressos de forma estável, tanto em tecido maligno e estroma. Além disso, NormFinder confirmou a estabilidade de expressão elevada para os quatro miARNs. Nos experimentos de validação com base RT-qPCR, não houve diferença significativa entre o tumor e estroma /mucosa rectal normal foi detectado para a média dos candidatos normalizador miR-27a, miR-193a-5p e deixe-7g (primeira validação

P

= 0,801, segundo a validação

P

= 0,321). MiR-645 foi excluído da análise de dados, porque foi não detectado em 35 das 50 amostras (primeira validação) e em 24 de 56 amostras (segunda validação), respectivamente. foi observada diferença significativa no nível de RNU6B expressão entre tumor e estroma adjacente (primeira validação), e entre tumores e mucosa rectal normal (segunda validação).

Conclusão

Recomendamos a expressão de dizer miR-27a, miR-193a-5p e deixe-7g como fator de normalização, ao executar expressão miRNA análises por RT-qPCR em tecido de cancro rectal

Citation:. Eriksen AHM, Andersen RF, Pallisgaard N, Sørensen FB , Jakobsen a, Hansen TF (2016) microRNA Expression Profiling identificar e Genes Validar referência para a quantificação relativa de microRNA no câncer de reto. PLoS ONE 11 (3): e0150593. doi: 10.1371 /journal.pone.0150593

editor: Partha Mukhopadhyay, National Institutes of Health, United States |

Recebido: 08 de setembro de 2015; Aceito: 17 de fevereiro de 2016; Publicação: 03 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Eriksen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os microRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA curtas não codificantes que atuam genes reguladores como negativos ao nível pós-transcricional. Estes pequenos RNAs consistem de 18-25 nucleótidos e desempenham um papel importante na regulação de processos biológicos, tais como a diferenciação celular, proliferação e apoptose. Alterações nos perfis de expressão de miARN estão associadas com as funções celulares anormais e foram observados numa variedade de doenças, incluindo o cancro [1, 2]. Muitos miRNAs alvo oncogenes e genes supressores de tumor com envolvimento direto na carcinogênese [3]. Por causa da associação entre muitos miRNAs e câncer, miRNAs estão sendo investigados como potenciais biomarcadores para diagnóstico, prognóstico e previsão na gestão de câncer [2, 4].

em tempo real reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR) é amplamente aceite como o método de escolha para a expressão do gene quantificação relativa, uma vez que é o método mais sensível e reprodutível. No entanto, a exatidão e precisão dos resultados são dependentes de normalização de dados adequada. genes de referência são necessárias para corrigir a não-biológicos variações de amostra-a-amostra, que poderiam ser introduzidos durante todos os passos de preparação de amostras para amplificação. A utilização de genes de referência, expressa de forma estável para não-normalização pode levar a conclusões incorrectas. É geralmente aceite que um gene de referência universal, aplicável para todos os tipos de tecidos não existe [5-8]. A abordagem mais precisa é para seleccionar os genes expressos de forma estável de referência para cada experiência específica de acordo com o tecido de interesse [9].

Apesar de um número cada vez maior de estudos de expressão de miARN, a literatura é extremamente escassa, quando se trata de câncer retal e os candidatos normalizador confiáveis.

o objetivo do presente estudo foi identificar miRNAs expressos de forma estável no tecido do cancro retal para ser usado como normalisers em estudos de expressão miRNA futuras. Neste contexto miARN-normalisers serão referidos como genes de referência. Nós estudamos o perfil de miRNAs expressão no tecido tumoral dissecados-micro laser e tecido do estroma adjacente a partir de amostras de pacientes com câncer retal. Primeiro, foram selecionados os miRNAs mais estavelmente expressa de nossa tecnologia de alto rendimento com base estudo de perfis de expressão miRNA em 10 pacientes (OpenArray®, Life Technologies). Em segundo lugar, a estabilidade destes miARNs foi ainda avaliado por RT-qPCR no tecido de cancro rectal de 25 outros pacientes. Finalmente, analisou-se a estabilidade das mesmas miARNs em tecido de cancro rectal e mucosa rectal normal a partir de 28 pacientes comparáveis. Foram incluídos o pequeno RNU6B RNA nuclear comumente usado em todas as nossas análises.

Materiais e Métodos

Pacientes e amostras de tecido

Os pacientes foram selecionados aleatoriamente a partir de uma coorte de 239 pacientes submetidos a ressecção de câncer retal em Vejle Hospital, na Dinamarca entre 1999 e 2008. a inclusão só foi conseguida se o seu diagnóstico histopatológico foram adenocarcinoma rectal, se não tivessem quimio-radioterapia pré-operatória, e se fixado em formol embebido em parafina (FFPE) tecido de cancro rectal foi disponíveis

Para a expressão miRNA profiling análise, tecido tumoral de um total de 10 pacientes (5 homens, 5 do sexo feminino, idade mediana de 74 anos, intervalo 59-86 anos). foi selecionado representando diferentes estágios tumorais patológicas (pT1- pT4) e uma quantidade diferente de linfócitos no micro-ambiente do tumor (Tabela 1). Para o primeiro estudo de validação, de tecido de mais 25 pacientes com câncer retal (13 do sexo masculino, 12 do sexo feminino, idade mediana de 68 anos, intervalo 49-87 anos) foi escolhido de acordo com o estágio do tumor, mas, independentemente do número de linfócitos do estroma; quinze tumores foram classificados pT3, dez tumores foram classificados pT4. Para o segundo estudo de validação, tecido de cancro rectal e mucosa rectal normal a partir de outros 28 pacientes (13 do sexo masculino, 15 do sexo feminino, idade mediana de 70 anos, intervalo 45-89 anos) foram incluídos; todos os tumores foram classificados pT3.

De acordo com a Comissão Nacional Dinamarquês de Saúde de Ética em Pesquisa, a aprovação ética e consentimento informado por escrito não eram necessárias, porque a finalidade do estudo foi o desenvolvimento da qualidade e não existem dados clínicos foram ainda analisados ​​(Lei sobre a revisão de projetos de Pesquisa em Saúde, cf. § 14, seção 1 de Ética em Pesquisa). Não foram recolhidas amostras especificamente para o propósito do presente estudo. As amostras foram coletadas durante o tratamento padrão. O projeto foi feito de forma anônima. O tecido utilizado neste estudo não foi confirmado para ser incluído no registo de dinamarquesa Utilização de tecido humano. O estudo foi relatado à Agência de Protecção de Dados dinamarquesa.

Laser micro-dissecção

Para avaliar especificamente a expressão de miRNA em células de câncer de reto e no estroma circundante, laser micro-dissecção (LMD) foi realizado (Figura 1). secções histológicas disponíveis coradas com hematoxilina e eosina foram examinados por um patologista, a fim de seleccionar a secção mais profunda FFPE invasivo do tumor. Para o perfil de expressão de miARN, igual número de casos com um elevado versus uma baixa quantidade de linfócitos no tecido do estroma adjacentes foram seleccionados (Tabela 1). De acordo com a selecção anterior, secções (8-10 uM) foram cortadas a partir de tecido FFPE e afixada para enquadrar lâminas para LMD à base de membrana, usando Leica Microsystems LMD6500 (Leica). As lâminas foram secas durante 45 min a 60 ° C, lavadas duas vezes durante 5 minutos em xileno para remover parafina, re-hidratadas com uma série graduada de etanol (99%, 99%, 96%, 70%), lavadas em água desmineralizada, coradas durante 3 min com hematoxilina, enxaguadas durante 5 minutos em água desmineralizada, e deixou-se secar ao ar. As células de tumor (A) e do tumor micro-ambiental estroma (b) foram isolados por LMD e recolhidos separadamente nas tampas de tubos de PCR de 0,5 ml de RNase-free, em que foi adicionada uma gota de etanol. Para a segunda experiência de validação, as células tumorais foram isolados por LMD, enquanto que a mucosa rectal normal foi removido das lâminas com um bisturi.

áreas de células tumorais foram removidas (setas). As áreas a ser removido a partir do tecido do estroma foram marcadas (linhas vermelhas).

ARN extracção

O ARN foi isolado utilizando o Kit de miRNeasy FFPE (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com a as instruções do fabricante. Uma vez que a parafina foi removida antes LMD, primeiro passo foi a adição de um tampão de lise contendo proteinase K, seguido de uma curta incubação a uma temperatura mais elevada. Isto foi seguido por tratamento com DNase e tratamento tampão de RBC. O etanol foi adicionado e a amostra foi aplicada a uma coluna de centrifugação RNeasy MinElute, onde o ARN total, incluindo miARN, ligado à membrana foi removido por lavagem. Finalmente, o RNA total, incluindo miRNA, foi eluída em 14 mL de água livre de RNase.

OpenArray® Painéis

OpenArray® Painel MicroRNA Humano (Life Technologies, Foster City, CA, EUA) é uma matriz de miARN baseada em PCR de alto rendimento que permite a análise de mais de 750 miARNs pré-definida sobre uma plataforma de microfluidos. Single-stranded cDNA inverso transcrito a partir de ARN total, utilizando iniciadores de RT Megaplex ™, Piscina Humana A ou B. Cada reacção de RT tinham um volume final de 7,5 uL e continha o RNA total (3 mL) e a partir de reagentes TaqMan ® MicroRNA Transcrição Reversa Kit ( 4,5 ul) (Life Technologies).

pré-amplificação (16 ciclos) foi realizada com Megaplex ™ pré-amplificador Primers, Piscina Humano a ou B (Life Technologies) e TaqMan preAmp Mastermix (Life Technologies) de acordo com instruções padrão do fabricante para a entrada de amostra baixa (LSI). O pré-amplificador de produto foi diluída 1:40 em tampão TE. Para testar o resultado do pré-amplificação e transcrição reversa antes procedeu-se a OpenArray®, os produtos foram testados com o ensaio de qPCR única tanto para miR-16 (Grupo A) ou o miR-151-3p (Grupo B). As análises foram feitas em 20 reações ul em duplicado utilizando 1,3 mL de amostra diluída. Ambos os miARNs foram detectados.

Para o passo qPCR, TaqMan ® OpenArray® microARN humano painéis (Life Technologies) foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante. qPCR foi realizado utilizando QuantStudio 12K Flex System (Life Technologies). Todas as reacções foram realizadas em triplicado, onde cada amostra foi analisada em três diferentes painéis OpenArray®.

Validação RT-qPCR

A matriz personalizado TaqMan® microRNA Cards (Life Technologies) foram utilizados de acordo com a instruções padrão do fabricante para LSI. RNA foi reverso transcrito usando Pools Primer personalizado Mirna RT fornecidos em conjunto com os cartões da Matriz. Cada reacção RT continha 3 mL de RNA total e 4,5 ul RT mistura de reacção de TaqMan® microRNA Transcrição Reversa Kit.

5 jul produto RT foi pré-amplificado (14 ciclos) com piscinas à medida PreAmp Primer (fornecido com a matriz Cards) e TaqMan PreAmp Mastermix em 25 ul reacções. O pré-amplificador de produto foi diluída 1: 4 em tampão TE. analisa qPCR foram realizadas utilizando TaqMan® Universal Master Mix II NoAmpErase® UNG e as Applied Biosystems 7900 HT Real-Time PCR System. Todas as reacções foram realizadas em triplicado.

Ambos validação experimentos seguiram os mesmos passos como descrito acima.

A análise dos dados

Dados alto rendimento gerados a partir de TaqMan® OpenArray® RT-qPCR foi analisada utilizando a Versão 1.0.3 expressão Software suite (Life Technologies), uma ferramenta de análise de dados que utiliza o método comparativo Cq (ΔΔCq) para quantificar a expressão genética relativa através de um grande número de genes e amostras. A quantificação relativa (RQ), também chamado Change Fold (FC) -foi calculado a partir de valores Cq de acordo com as equações: (a) ΔCq = Cq (miRNA) -Cq (média global); (B) ΔΔCq = ΔCq (tumor) -ΔCq (estroma); e (c) RQ = 2

-ΔΔ

Cq

, onde Cq é definido como o número de ciclos PCR em que a fluorescência atingir o limiar na trama de amplificação.

executa Expression Suíte um teste t não emparelhado para comparação entre os grupos biológicos, assumindo que os valores para os dois grupos Cq seguem uma distribuição normal.

para analisar a estabilidade de expressão dos genes candidatos de referência, o programa de software NormFinder [10] foi utilizado de acordo com a recomendações do desenvolvedor. NormFinder calcula um valor de estabilidade de um painel de genes candidatos referência combinando o inter- e intra-grupo variação expressão. Os valores mais baixos indicam os genes de referência mais expressos de forma estável. Os valores médios dos valores em triplicado Cq foram convertidos a valores lineares para Norm Finder e análises estatísticas, pelo valor equação linear (CQ) = 2

–

Cq

, assumindo que a eficiência de amplificação para os ensaios de gene de referência é de quase 100%. As análises estatísticas foram realizadas utilizando NCSS 2007 (NSCC LLC, Kaysville, UT, EUA). Nas experiências de validação, de Wilcoxon Rank-Sum Test foi usado para testar as diferenças em medianas, quando comparando tumor e estroma (primeira validação) e do tumor e na mucosa normal (segundo validação). Os valores de p menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significativos para todos os testes.

Resultados

Identificação de genes de referência candidatos usando Expression Software Suite

perfilados um painel de mais de 750 miRNAs e controles em 10 pares de tecido de câncer retal e tecido do estroma adjacente. Inicialmente, uma estratégia de expressão normalização média global foi aplicado para identificar os miARNs expressos mais estavelmente [2]. Os dados foram excluídos de análises adicionais, se CQ-valores excederam 35 e /ou a pontuação de amplificação foi abaixo de 1,24.

A partir da análise de dados de expressão Suite, os quatro candidatos gene de referência deixe-7g, miR-193- 5p, miR-27a, e miR-645 (Tabela 2) foram seleccionados a partir dos seguintes critérios: (a) quantificação relativa (RQ) perto de 1: 1 (em que o grupo biológico de referência é tecido estromal); (B) miARN detectados em mais de 70% de todas as repetições de todas as amostras; (C) Cq valores entre 18 e 28; (D) nenhuma intenção de incluindo o miRNA como um alvo em nossos projetos futuros. Além disso, nós olhamos o p-valor, considerando um alto valor-p foi sugerindo que não há grande diferença entre os grupos de tecidos e nenhuma grande disseminação de valores Cq dentro dos grupos.

Para adicionar outro geralmente abordagem aceita, um painel de 10 miRNAs, todos reunião os critérios acima mencionados ((a) – (d)), foram analisados ​​utilizando Norm Finder (Tabela 3). RQ variaram entre 1: 0.8 a 1: 1,2 (em que o grupo biológico de referência foi estroma). O valor de p não foi considerado quando da escolha dos miRNAs para esta análise. RNU6B foi incluído nesta análise. A investigação identificou deixá-7g, miR-193a-5p, miR-27a e miR-645 entre um grupo de miRNAs com um valor baixo e quase igual a estabilidade, indicando estabilidade expressão elevada. RNU6B mostrou um valor de estabilidade de 10 vezes maior, indicando menor estabilidade expressão do que os outros candidatos de genes de referência. A alteração de dois grupos biológicos (tumorais e do estroma) em três grupos (tumor, do estroma com baixa quantidade de linfócitos, e estroma com elevada quantidade de linfócitos) teve apenas um efeito menor sobre os valores de estabilidade (dados não mostrados).

validação baseada em RT-qPCR de candidatos gene de referência em tumor e estroma adjacente

Os padrões de expressão de deixá-7g, miR-193a-5p, miR-27a, miR-645 e RNU6B foram ainda mais analisados ​​em 25 pares de câncer retal e do tecido do estroma adjacente. Uma vez que o miR-645 só foi detectada em 15 de 50 amostras, este foi eliminado da miARN outras análises de dados. Deixe-7g, miR-193a-5p e miR-27a mostraram diferentes níveis de expressão mas mensuráveis ​​e todos eles foram expressos em todas as 50 amostras. níveis Cq-primas variou 20,1-28,9 para deixá-7g, 23,2-31,1 por miR-193a-5p, e 19,7-26,4 por miR-27a. Para RNU6B o nível Cq bruto variou 12,0-23,6. Os diagramas de caixa são mostradas para a média aritmética dos let-7 g, miR-193a-5p e miR-27a, e para RNU6B na Figura 2. A média aritmética dos valores Cq para deixá-7g, miR-193a-5p e miR- 27a, e os valores para Cq RNU6B foram convertidos em valores lineares, e Wilcoxon Rank-Sum teste para diferença em medianas foi realizada. Foi observada uma diferença significativa para RNU6B (

P

= 0,004) entre o tecido tumoral eo tecido do estroma adjacente, ao passo que não foi detectada nenhuma diferença significativa para a média dos outros candidatos genes de três referência: deixe-7g, miR -193a-5p e miR-27a (

P

= 0,801).

A expressão de genes candidatos de referência em tecido de cancro rectal (n = 25) e tecido do estroma adjacente (n = 25) ( a), e em tecido de cancro rectal (n = 28) e na mucosa rectal normal (n = 28) (B). Os valores são dados como ciclos de quantificação (CQ). Boxes (verde, tecido de cancro; azul, tecido do estroma; cinza, mucosa normal) representam quartis superiores e inferiores com medianas como linhas horizontais. Bigodes representam 1,5 x do intervalo interquartil. Outliers não são mostrados. Os valores de p estão de acordo com Wilcoxon Rank Sum teste para diferença de medianas. RNU6B mostrou uma diferença significativa entre o tumor e estroma (A), e entre tumor e na mucosa normal (B). Não há diferença significativa na média do nível de deixá-7g, miR-193a-5p e miR-27a entre o tumor e estroma (A), e entre tumor e na mucosa normal (B).

validação baseada em RT-qPCR de candidatos gene de referência em tumores e mucosa normal

Como uma segunda validação, os padrões de expressão let-7 g, miR-193a-5p, miR-27a, miR-645 e RNU6B foram analisados ​​em 28 pares de tecido de cancro rectal e mucosa rectal normal. MiR-193a-5p, miR-27a e RNU6B foram detectados em todas as 56 amostras. Deixe-7g foi detectado em 55 amostras e sem ser detectado em uma amostra com a mucosa rectal normal. Uma vez que o miR-645 só foi detectada em 32 de 56 amostras, este miARN não foi incluído na análise posterior dos dados. níveis de matéria-Cq variou 18,2-29,5 para deixá-7g, 20,9-34,7 por miR-193a-5p, 18,7-29,5 por mi-27a, e 14,3-29,7 por RNU6B. Os diagramas de caixa são apresentados na Figura 2. Foi detectada não houve diferença significativa para a média aritmética dos let-7 g, miR-193a-5p e miR-27a (

P

= 0,321) entre o tecido tumoral ea mucosa normal , enquanto que para RNU6B, observou-se uma diferença significativa (

P

= 0,031).

Discussão

O uso de genes de referência fiáveis ​​para a normalização é de grande importância, quando se realiza RT-qPCR baseadas na investigação. O procedimento de normalização compensa as variações no rendimento de RNA-extração, rendimento reverso-transcrição, e eficiência de amplificação, assim, permitindo a comparação dos níveis de expressão de miRNA em todo amostras diferentes [11].

É amplamente aceito que um único , o gene de referência universal não existe, e que tem sido defendido, que a normalização é mais precisa conseguida pela selecção de genes de referência que pertencem à mesma classe de RNA como os genes investigados. Além disso, recomenda-se procurar genes expressos de forma estável em cada sistema experimental [12, 13].

Davoren

et al

. relataram a primeira identificação sistemática de genes candidatos de referência para experiências miRNA RT-qPCR no câncer de mama em 2008 [5]. Em 2010, Chang

et al

. relatou sua identificação de genes candidatos de referência para miRNA RT-qPCR no cancro colorectal [6], onde identificou os seis melhores miRNAs expressos mais estavelmente como deixá-7a, miR-16, miR-26a, miR-345, miR-425 e miR-454.

para obter informações particulares sobre genes de referência para estudos de expressão de miRNA no cancro rectal, foi realizada uma pesquisa PubMed. Usando os termos mesh “microRNAs” e “câncer retal”, encontramos 9 artigos sobre estudos de expressão do cancro retal, publicados até fevereiro de 2015, que incluiu informações sobre o uso de genes de referência. (Tabela 4; [3, 14-21])

Esta pesquisa revelou que os pequenos RNAs nucleares foram genes de referência habituais em experiências do cancro retal, onde RNU6B foi preferido. No entanto utilizar estes pequenos RNAs como genes de referência pode ser problemático, apesar de eles mostram níveis estáveis ​​de expressão em tecidos normais, eles mostraram diferentes níveis de expressão em tecido de cancro em comparação com o tecido normal [4]. Além disso, os detalhes de selecção e de validação dos genes de referência utilizados e se ou não foram expressos de forma estável em toda a tecido investigado muitas vezes não são fornecidas. Nenhum dos estudos aplicou um miRNA como gene de referência.

Além disso, de acordo com Peltier

et al

., O gene de referência mais comumente usado em experimentos do cancro retal, RNU6B, demonstrou ser um das espécies de RNA expressas menos estavelmente [8].

Para o melhor de nosso conhecimento, esta é a primeira OpenArray® base e posterior identificação RT-qPCR-validado de genes de referência apropriados em amostras de câncer retal sozinho. Porque, até agora, RNU6B tem sido o controle endógeno mais comumente usado em estudos de câncer retal, decidimos incluí-lo em nossos experimentos para comparação. Nós perfilado a expressão de miRNAs humanos (incluindo RNU6B) em 10 pares de tecido de câncer retal e tecido do estroma adjacente. Uma vez que os genes de referência vão ser usado para a normalização no futuro RT-qPCR análises sobre biópsias de câncer retal contendo apenas células de tumor e tecido do estroma adjacente, que não incluem mucosa rectal normal nas primeiras análises. Ao aplicar o valor da expressão média global para a normalização, que identificou os miRNAs mais estavelmente expressa: deixe-7g, miR-193a-5p, miR-27a e miR-645. Média global de normalização tenha sido previamente demonstrado ser superior a outras abordagens de normalização na redução variações técnicas e mostrando mudanças biológicas [2].

O uso subsequente de NormFinder confirmou a estabilidade de expressão elevada para os quatro miRNAs, que eram tudo sobre dez vezes mais estável do que o gene de referência RNU6B frequentemente utilizado. Como a quantidade de linfócitos estromais fez sem alterações substanciais aos valores de estabilidade, concluiu-se que a quantidade de linfócitos não influenciam os níveis de expressão destes miRNAs, eo número de linfócitos no compartimento estromal não foi tida em consideração nos experimentos de validação .

a nossa primeira experiência de validação foi realizado em uma coorte maior de 25 pares de tecido e confirmou não houve diferença significativa (

P

= 0,801) no valor da expressão média para deixá-7g, miR- 193a-5p e miR-27a entre o tecido de câncer retal e tecido do estroma adjacente. A ausência de uma diferença significativa não prova um nível de expressão iguais entre o tecido tumoral e tecido do estroma adjacente; No entanto, por outro lado, um elevado valor de p fala em favor da igualdade ou diferenças menores. A diferença significativa na expressão de RNU6B entre o tecido do tumor e estroma adjacente (

P

= 0,004) está em concordância com os resultados anteriores [8]. MiR-645 foi excluída, uma vez que não foi representado em todas as amostras.

Para validar ainda mais os resultados, fizemos uma segunda validação em uma coorte de 28 pares de tecido de cancro rectal e mucosa rectal normal. Como nos dois primeiros experimentos, nós não encontramos uma diferença significativa (

P

= 0,321) entre a média aritmética dos níveis de expressão let-7 g, miR-193a-5p e miR-27a na rectal tecido de cancro e o compartimento de comparação (neste caso, a mucosa rectal normal), enquanto que uma diferença significativa foi detectada para o nível de expressão de RNU6B (

P

= 0,031). Como no primeiro estudo de validação, miR-645 foi não detectado em uma parte considerável das amostras (24 de 56) e, portanto, ainda não é adequado como um gene de referência neste cenário.

miR-645 foi amplamente detectada em OpenArray®, mas não nas duas experiências de validação. Porque não existiram diferenças nas características básicas entre as amostras utilizadas na experiência de identificação e as validações subsequentes, as diferenças na taxa de detecção é susceptível de ser causada pela plataforma. As principais variações na detecção de miR-645 em nas diferentes plataformas enfatiza a importância da validação dos resultados de um método de alto rendimento.

De acordo com www.miRBase.org, deixe-7g, miR-193a-5p e miR-27a não pertencem às mesmas miRNA-famílias, que reduzem a chance de que eles podem ser co-regulado. A seleção de três genes de referência cumprem Vandesompele

et al

. Recomendação de utilizar pelo menos três genes de referência adequadas para calcular um fator de normalização [12].

Em conclusão, com base em um alto -throughput estudo e dois posteriores RT-qPCR experimentos de validação com base RT-qPCR miRNA de perfil, recomenda-se o valor médio de deixá-7g, miR-193a-5p e miR-27a como fator de normalização, ao executar expressão miRNA análises por RT-qPCR em tecido de cancro rectal.

Informações de Apoio

Tabela S1. Os dados do experimento de avaliação inicial (OpenArray®)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0150593.s001

(XLSX)

S2 Table. Os dados do primeiro experimento de validação (tumor e estroma)

doi: 10.1371. /Journal.pone.0150593.s002

(XLSX)

S3 Tabela. Os dados do segundo experimento de validação (tumor e na mucosa rectal normal)

doi: 10.1371. /Journal.pone.0150593.s003

(XLSX)

Reconhecimentos

Estamos muito grato pela assistência técnica prestada por Birgit Roed Sørensen, Pia Nielsen, Tina Brandt Christensen e Lone Hartmann Hansen.