Abstract

Há uma necessidade urgente de melhorar a terapia para o carcinoma do ovário avançado, que pode ser satisfeita através da administração de anticorpos monoclonais imuno-moduladora (mAbs) para gerar uma resposta imune tumor-destrutivo. Utilizando o modelo do cancro do ovário do rato ID8, investigou-se a eficácia terapêutica de várias combinações de mAb em ratos com injecção intraperitoneal (i.p.) com o transplante de tumor estabelecido de 3 × 10

6 células ID8 10 dias anteriormente. Enquanto a maioria dos mAbs testados foram ineficazes quando administrados individualmente ou em conjunto, os dados confirmam a nossa verificação anterior de que dois i.p. injecções de uma combinação de anticorpo anti-CD137 com anti-DP-1 mAb duplica a sobrevivência global. Os ratinhos tratados com o mAb esta combinação tem um aumento significativo na frequência e número total de células T CD8 +

células T tanto na lavagem peritoneal e baços, e estas células são funcionais como demonstrado pela actividade citolítica e da produção de IFN-γ específica de antigénio. Enquanto que a administração de anticorpos anti-CD137 mAb como um agente único semelhante aumenta + células T

CD8, mas estes não têm actividade funcional, o que pode ser atribuído ao aumento da regulação do co-inibidor de DP-1 e TIM-3 moléculas induzidas por CD137 . A adição de cisplatina a droga anti-cancro para a combinação de dois mAb aumentaram a sobrevivência geral 90 dias (e era provavelmente curativa) por um mecanismo que inclui um CD8 sistémica

+ resposta de células T com a especificidade do tumor e a memória imunológica. Surpreendentemente, o tratamento combinado de cisplatina e CD137 /DP-1 mAb também deu origem à sobrevivência a longo prazo de ratinhos com tumores pulmonares TC1 estabelecidos. Uma combinação similar de os mAbs 2 e cisplatina deve ser considerado por ‘tradução’ clínica.

Citation: Wei H, Zhao L, Li W, Fan K, Qian W, Hou S, et al. (2013) Combinatória PD-1 bloqueio e CD137 de ativação terapêutico Eficácia em murino modelos de cancro e sinergia com a cisplatina. PLoS ONE 8 (12): e84927. doi: 10.1371 /journal.pone.0084927

editor: Ramon Arens, Leiden University Medical Center, Holanda

Recebido: 05 de junho de 2013; Aceito: 20 de novembro de 2013; Publicação: 19 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wei et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 81.372.528), Ministério da Ciência Tecnologia da China “973” (No. 2012CB917104), os subsídios especiais do Ministério da Educação da China e da Shanghai Comissão de Educação para uma excelente equipa de investigação em Oncologia e Xangai KeyProject em Oncologia, bem como por RO1CA134487 de US National Institutes of Health. As agências de financiamento não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

epitelial carcinoma do ovário (EOC) é a principal causa de morte por doenças malignas ginecológicas nos Estados Unidos e é a quarta causa mais comum de morte por câncer em mulheres [1]. Mais de 70% das mulheres com EOC presente com doença avançada e disseminação do tumor por toda a cavidade peritoneal [2]. O tratamento padrão para câncer de ovário é debulking cirúrgico seguido de quimioterapia à base de platina-taxano [3]. A cisplatina e os seus derivados de platina são agentes quimioterapêuticos de primeira linha para o tratamento de cancro do ovário. A cisplatina induz a apoptose por irreversivelmente intercalantes de ADN através de aductos de DNA inter e intracadeia, induzindo, assim, danos no DNA e activação da maquinaria apoptótica [4]. A maioria dos pacientes são sensíveis à quimioterapia no início; no entanto, a maioria acabará por ter uma recaída e morrer da doença. Portanto, novos complementares são necessárias estratégias para melhorar o resultado do cancro do ovário.

Existem várias razões para esperar que a imunoterapia para EOC poderia ser eficaz [5]. EOC células expressam antigénios associados ao tumor contra as quais foram detectadas respostas imunes específicas [6-10]. Estudos pioneiros por Coukos indicam que mecanismos imunológicos desempenham um papel importante na evolução clínica uma vez que existe uma estreita correlação entre a sobrevivência e infiltração do tumor com CD3

+ células T [11]. metástases EOC são frequentemente restringida à cavidade peritoneal, o que facilita a entrega local de agentes terapêuticos [12]. A maioria dos pacientes com doença avançada, pode ser posto em remissão clínica temporária em que a carga tumoral é pequeno e, portanto, mais propensos a responder [9]. No entanto, o sucesso clínico com imunoterapias para EOC tem sido modesto [13].

Vários estudos recentes têm demonstrado eficácia terapêutica tanto em modelos de rato e de pacientes humanos por administração de Acms que podem modificar a resposta imunitária quando utilizada por si só ou em combinações. Por exemplo, os mAbs para CTLA4 têm eficácia anti-tumoral com a sobrevivência global prolongada em pacientes com melanoma metastático, e um mAb anti-CTLA4 é clinicamente aprovado pela FDA [14]. efeitos terapêuticos benéficos foram demonstradas em ratos com tumores estabelecidos [14,15], mediante a contratação de CD137 (também conhecido como 4-1BB), utilizando anticorpos agonistas, aptâmeros de ARN dimérica ou de células tumorais que expressam um anticorpo anti-CD137 de cadeia simples ligado à superfície [15, 16], e os dados pré-clínicos têm conduzido a ensaios clínicos com mAbs humanizados dirigidos contra CD137 [17]. A morte programada de 1 (PD-1) é um receptor de proteína de co-inibitório sobre as células T com uma estrutura semelhante à de CTLA-4, mas com uma função biológica e ligando de especificidade distinta [18]. O bloqueio da interacção entre DP-1 e o seu ligando, PD-L1, potencia respostas imunitárias de células T in vitro e medeia a actividade anti-tumor [19-21]. Os resultados pré-clínicos têm conduzido a ensaios clínicos recentemente reportados mostram que o anti-DP-1 e anti-PD-L1 mAbs produzir uma actividade antitumoral impressionante no cancro do pulmão de células não pequenas, melanoma e cancro das células renais com regressão completa conseguido em alguns pacientes [22-24].

Apesar da eficácia anti-tumoral promissora dos vários mAbs, muitos tumores são refractários ao tratamento com um único anti-CD137, anticorpo anti-PD-1 ou anti-CTLA4 mAbs [25,26] e combinações de dois ou mais mAbs podem ser necessários. Nós recentemente demonstrado em todas as 4 modelos de tumor de rato, incluindo o clone de ID8 do cancro do ovário murino MOSEC, que repetida de entrega no local do tumor de uma combinação de Acsm para CD137 /DP-1 /CTLA4 causada regressões de tumor a longo prazo e mesmo curas e que uma combinação de mAb que também compreendia um mAb para CD19 foi ainda mais eficaz [27]. Ainda que estes dados são importantes, demonstrando que a passagem de uma resposta inflamatória do tipo Th2, que é prevalente em tumores [28-30], para uma resposta do tipo Th1 pode ser curativa, entrega repetida de 3-4 mAbs aos locais tumorais não é prático para “tradução” clínica.

O problema associado com a necessidade para a entrega local pode ser superado para cancros do ovário, uma vez que crescer e metástase principalmente na cavidade peritoneal e são, portanto, acessível. Além disso, o número de mAbs necessários pode ser reduzido a dois, uma vez que já descobriram que uma combinação de anticorpos anti-CD137 e anti-DP-1 mAbs podem duplicar a sobrevivência de ratinhos com tumores ID8 estabelecido, embora isso não é curativa [28]. Com base nestas descobertas, temos agora a comparação

In vivo

efeito terapêutico, como medido prolongou a sobrevivência geral, de anti-CD137 /DP-1 combinação com o dos mAbs indicados como agentes individuais, bem como com outros mAbs e combinações de mAb. Nós investigamos ainda mais os mecanismos imunológicos sistêmicos e locais contratados pelos anti-CD137 /PD-1 mAbs simples ou combinados. É importante notar, que, subsequentemente, mostrou que uma combinação de anticorpo anti-CD137 /DP-1 mAbs com a cisplatina droga anti-cancro prolonga significativamente a vida útil e é provavelmente curativa a 80% dos ratinhos com carcinoma de ID8 estabelecida por um mecanismo que envolve CD8 funcional

+ células T e tem especificidade para o antigénio de tumor, bem como a memória imunológica. Um regime semelhante também resultou na sobrevivência a longo prazo de 33,3% de ratinhos com carcinoma do pulmão de TC1 estabelecida. Uma abordagem semelhante deve ser “traduzível” para a clínica.

Materiais e Métodos

Ratos e linhas celulares

Para os experimentos realizados na China, 6-8 -week C57BL feminino foram adquiridos a partir do Centro Experimental animal da Segunda Médica Militar protocolos universitários e animais foram aprovados pelo Institutional Review Board da segunda Universidade médica Militar. Experiências com animais realizados em ratos Seattle utilizados adquiridos de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) e os protocolos foram aprovados pelo Institutional Review Board da Universidade de Washington.

ID8 é um clone do carcinoma do ovário MOSEC de C57BL /6 origem [31] e TC1 é um clone derivado de células epiteliais de pulmão primários de ratinhos C57BL /6 co-transformadas com HPV-16 de E6 e E7 [27]. As células de linfoma de células T de murídeo EL4 são de origem C57BL 6 /[32]. células tumorais TC1 ID8 e foram cultivadas no meio DMEM completo suplementado com 10% de FBS (Thermo Scientific, Rockford, IL), 100 U /mL de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina antes de suspensões de células foram preparadas e transplantada para ratinhos. As células EL4 e os esplenócitos foram mantidas num meio completo de RPMI-1640 suplementado com FBS a 10%, HEPES 25 mM, glutamina 2 mM, 100 U /mL de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina.

Reagentes

Os seguintes anticorpos monoclonais (mAb) utilizados em experiências com animais foram adquiridos a BioXcell (West Lebanon, NH): anti-CD137 (Clone lob12.3), anti-DP-1 (clone RMP1-14), anti- CTLA4 (clone 9D9) e anti-NK1.1 (clone PK136), anti-CD8 (clone 2.43), anti-CD4 (clone GK1.5) e de controlo (clone 2A3). O anticorpo anti-CD137 de 2A clone foi preparada no nosso laboratório, como descrito anteriormente [33].

Os estudos em animais

Os ratinhos foram injectados intraperitonealmente (i.p.) com 3 × 10

6 ID8 células em 0,1 mL de PBS. Nos dias 10 e 14 após a inoculação do tumor, os ratinhos foram injectados i.p. com 0,5 mg de cada mAb no total de 0,5 mL de PBS como mostrado nas legendas das figuras. Em experiências com /cisplatina combinada terapia de mAb, grupo de ratinhos (10 ratinhos por grupo) tendo 10 dias tumor ID8 estabelecidos receberam duas doses de controlo, anti-DP-1, anti-CD137 e anti-DP-1 /mAb CD137 (0,5 mg por dose por ratinho) em 4 dias de intervalo, com ou sem cisplatina (10 mg /kg) a co-administração ao seu primeiro tratamento. Os ratos foram pesados ​​a cada segundo dia e verificados diariamente para barrigas inchadas como indicativos de informações ascite e para qualquer evidência de toxicidade, tais como o comportamento alterado, incapacidade de se mover, comer ou beber. Seguindo as diretrizes institucionais, os ratos foram mortos quando eles desenvolveram ascite e teve um aumento de peso 30%. A sobrevivência de cada rato foi registado e sobrevivência global foi calculada. Para as experiências de terapia combinada em modelo de tumor TC1, ratinhos (6 por grupo) foram injectados por via subcutânea (s.c.) com 5 × 10

5 células TC1 em 0,1 mL de PBS. Nos dias 5 e 9 após o transplante do tumor, os ratinhos foram injectados intratumoralmente (i.t.) com os mAbs e /ou cisplatina, utilizando a dose /programação acima descrito. Três diâmetros perpendiculares de s.c Os tumores foram medidos a cada dois dias utilizando um compasso de calibre e os volumes tumorais foram calculados de acordo com a fórmula: 1/2 × (comprimento) x (largura)

2. Os ratinhos foram sacrificados quando pareceram moribundos ou seu s.c. os tumores atingiram 10 mm de diâmetro.

Para a avaliação do desenvolvimento da memória imunológica, 15 de longo prazo sobreviventes camundongos que receberam cisplatina /anti-PD1 /CD137 terapia combinada (agrupados a partir de 2 experiências independentes) ou 5 camundongos normais pareados por idade (que serviu como controle) foram desafiados ip ou s.c. com 3 × 10

6 células ID8 ou 1 × 10

6 sing�icos mas antigenicamente diferentes células TC1. O crescimento do tumor em ratinhos foi avaliada tal como descrito acima.

Para as experiências de depleção, um anticorpo anti-CD4 (0,2 mg /murganho), anti-CD8 (0,2 mg /murganho), anti-NK1.1 (0,1 mg /rato) ou mAb de controlo (0,2 mg /rato) foi injectado IP 48 e 72 horas antes do tratamento e a cada 3-4 dias depois para a duração dos experimentos. A depleção de subpopulações de células adequados foi confirmada por análise de citometria de fluxo (dados não apresentados).

Avaliação de subconjuntos de células imunitárias em baços e lavagens peritoneal por citometria de fluxo

Mice

que tinha sido transplantado i.p. com células ID8 foram sacrificados 7 e 14 dias depois de terem sido injectados com o anticorpo anti-PD1, anti-CD137, anti- PD1 /CD137 ou controlo como nas experiências de terapia. Foram preparadas suspensões de células individuais de baços, conforme descrito anteriormente [27]. Para obter células imunitárias peritoneais, 3 ml de PBS foi injectada na cavidade peritoneal de ratinhos com tumores ID8 imediatamente após a eutanásia, o ventre foi massajado e o líquido foi removido, filtradas através de um filtro celular de 70 uM (BD Biosciences, San Jose, CA) , as células foram lavadas e imunológicas foram isolados usando um tampão de isolamento de linfócitos do rato (Cedarlane, Burlington, Ontário) seguindo as instruções do fabricante.

suspensões monocelulares foram lavadas com tampão de coloração de FACS e incubadas com o inibidor de ligação ao receptor FC de ratinho durante 10 minutos, antes da coloração com anticorpos de CD45 (clone 30-F11), CD3 (clone 145-2C11), CD4 (clone GK1.5), CD8 (clone 53-6,7), CD19 (clone eBio1D3), CD11b (clone M1 /70), GR-1 (clone RB6-8C5), TIM-3 (clone 8B.2C12) e DP-1 (clone J43; todos de eBioscience, San Diego, CA) durante 30 minutos. Para a coloração intracelular de FoxP3 (clone FJK-16s; eBioscience), IFN-γ (XMG1.2 clone; eBioscience), e IL-10 (clone JES5-16E3; eBioscience), as células foram fixadas, permeabilizadas e coradas seguindo as instruções de kit Cytofix /Cytoperm (BD Bioscience). A citometria de fluxo foi realizada utilizando FACSCalibur (BD Biosciences) e a população de linfócitos foi seleccionado por gating células CD45-positivas. Os dados foram analisados ​​usando o software Fluxo de Jo (árvore da estrela, Ashland, OR). Todos citometria de fluxo, as experiências foram realizadas pelo menos 3 vezes.

A avaliação da resposta imunitária específica do antigénio

isolados esplenócitos de ratinhos tratados foram cultivados na presença de 10 ug /mL mesotelina H-2Db-restrito peptídeos -derived (mesothelin aminoácidos 406-414) ou controlar peptídeo HPV-E7-derivado (HPV-E7 49-57, tudo em Xangai Ciência Peptide Biotecnologia Co.Ltd, Xangai.) durante 3 dias. Subsequentemente, o IFN-γ nos sobrenadantes foi detectado pelo rato IFN-γ Quantikine Kit ELISA (R D systems, Minneapolis, MN). Os resultados foram analisados ​​depois de normalização de acordo com os números de células T.

Para os ensaios de CTL, células efetoras foram obtidos por coculturing 5 × 10

6 esplenócitos com 5 × 10

5 células ID8 UV irradiado para 4 dias. células alvo EL4 pulsadas com péptido foram gerados por adição de 10 ug /ml de péptido e incubou-se durante 4 horas. A actividade de CTL foi medida usando o kit CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, Madison, WI) seguindo as instruções do fabricante. Em resumo, as células alvo foram incubadas com números variáveis ​​de células efectoras para cerca de 4 horas, e os sobrenadantes foram então analisados ​​para a libertação de lactato desidrogenase. Os resultados são expressos como percentagem de lise especifica, calculada como (libertação experimental-libertação espontânea de libertação /total libertação espontânea) x 100. Em algumas experiências, as células efectoras foram incubadas com anti-CD4 ou CD8 anticorpo (10 ug /ml) durante 2 horas antes do ensaio de CTL.

ELISA

Os ratinhos injectados i.p. com 3 × 10

6 células ID8 10 dia antes foram injectados duas vezes em intervalo de 4 dias com 0,5 mg de cada mAb em 0,5 mL de PBS. Duas semanas após a última injecção de Acm, células do sistema imunológico peritoneais (1 × 10

6 /poço) colhidos a partir de ratinhos tratados foram estimulados in vitro com 50 ng /ml de PMA e 1 ug /ml de ionomicina durante 6 horas antes da análise de IL-2 e a produção de IFN-γ nos sobrenadantes por ELISA de acordo com o manual (R D systems). Os resultados foram analisados ​​depois de normalização de acordo com os números de células T em células imunitárias peritoneais totais.

Estatísticas

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (M ± SEM). Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste t de GraphPad Prism 5. Student foi utilizado para comparar a diferença estatística entre os dois grupos e one-way ANOVA foi utilizada para comparar três ou mais grupos. As taxas de sobrevivência foram analisados ​​utilizando o método de Kaplan-Meier e avaliadas com o teste log-rank. As diferenças foram aceites como significativa a p . 0,05

Resultados

efeito antitumoral sinérgica de anti-CD137 /PD-1 mAbs

Foram avaliadas a eficácia antitumoral de diferentes combinações de IP Acms agonistas ou antagonistas contra moléculas co-estimulatórias ou co-inibidor em ratinhos C57BL transplantado 10 dias antes com 3 × 10

células 6 ID8. Com base em literatura publicada, indicando um potencial terapêutico em vários modelos tumorais testadas Acsm para CD137, CD40, CTLA-4, DP-1, a TIM-3 e LAG-3 [34,35], como agentes isolados e em combinações. ratos não tratados e ratinhos que receberam um controle mAb desenvolveu ascite cerca de 30 dias após a inoculação do tumor e tiveram que ser sacrificados. Como mostrado na Figura 1, a maior parte das combinações testadas mAbs tiveram pouco ou nenhum efeito sobre a sobrevivência geral de ratinhos portadores de tumor, e nenhum dos mAbs foi terapeuticamente eficaz quando utilizado sozinho. Consistente com os nossos resultados publicados recentemente [27], o tratamento combinado de anti-CTLA4, DP-1 e CD137 mAbs de sobrevivência significativamente prolongada de ratinhos com o tempo médio de sobrevivência aumentando-se para 80 dias (Figura 1a, b; p 0,05 comparado com os controlos) . O tratamento combinado de anti-CTLA4, PD-1, TIM-3 e CD40 mAbs também suprimiu o crescimento do tumor, mas foi menos eficaz com o tempo de sobrevida média de 49 dias. Outras combinações de mAb, incluindo anti-CTLA4 /DP-1, anti-CTLA4 /DP-1 /CD40, anti-CTLA4 /DP-1 /TIM-3, anti-CTLA4 /DP-1 /LAG-3 e anti-CTLA4 /DP-1 /LAG-3 /CD40 não tinha efeito sobre o crescimento do tumor.

Mice (5 /grupo) transplantado i.p. com 3 × 10

i.p. 6 células ID8 10 dias anteriormente foram injetados duas vezes, a intervalos de 4 dias com as combinações indicadas de mAb (0,5 mg de cada mAb /ratinho); a sobrevivência foi registada (A, C) e o tempo médio de sobrevivência foi calculada (B, D). A experiência foi repetida uma vez com resultados semelhantes. E, ratinhos (8-9 /grupo) i.p. transplantado com 3 × 10

i.p. 6 células ID8 3 dias anteriormente foram injetados duas vezes em 4 dias de intervalo com 0,5 mg de controle, anti-PD-1, anti-CD137 e anti-PD-1 /CD137 mAb e sua sobrevivência foi registrada. * P 0,05, ** P 0,01, em comparação com ratos tratados de controlo AMC.

A seguir, repetiu as experiências anteriores usando dois diferentes clones de mAb contra CD137 (2A e lob12.3). Como mostrado na Figura 1C e D, embora o tratamento de mAb único não prolongou a sobrevivência global, a combinação de anti-DP-1 mAb com anticorpos anti CD137-mAb sobrevivência igualmente prolongada de ratinhos com o tempo médio de sobrevivência duplicou (p 0,05 comparado com o controle e grupos individuais de mAb), que foi ainda reforçada pela adição de mAb anti-CTLA4 (p 0,01 comparado com os grupos de controlo e mAb individuais). Uma repetição da experiência originou resultados semelhantes (dados não mostrados).

Notavelmente, não se detectou qualquer expressão de CD137 e as moléculas PD-1 e os seus respectivos ligandos CD137L e PD-L1 /PD-L2 na superfície de células de cancro do ovário ID8 (dados não mostrados), excluindo o possibilidade de que a inibição do crescimento do tumor ID8

in vivo

está directamente mediada pelo anticorpo anti-CD137 mais anti-DP-1 mAb.

Curiosamente, quer anti-CD137 ou anti-PD-1 mAb sozinho protegidos contra crescimento de células ID8 em 3 dias estabelecidos modelo ID8 com as respectivas de 66,7% e 37,5% dos ratos que sobreviveram 90 dias em que o experimento foi encerrado e os ratos sacrificados (Figura 1E). A cavidade peritoneal de ratinhos estes estava livre de tumor. É digno de nota que o anti-CD137 mAb foi mais eficaz do que o mAb anti-PD1 e que uma combinação dos dois era modestamente mais eficaz (ratinhos sobreviventes 77,8%) do que o anti-CD137 mAc sozinho.

O aumento da percentagem de células T efetoras e diminuição da percentagem de células imunossupressoras induzida por anti-CD137 /PD-1 mAbs

Para explorar se combinada anti-PD-1 /CD137 mAbs induziu uma imune sistémica resposta, que injectado ratinhos transplantados 10 dias antes com células ID8 (como nas experiências de terapia), quer com uma combinação de anti-DP-1 /CD137 sozinho ou mAb mAb. Sete dias mais tarde, foram analisadas por citometria de fluxo da percentagem, o número absoluto e a função efectora de subpopulações de linfócitos nos baços dos ratinhos tratados. Como mostrado na Figura 2A, os baços de ratinhos tratados com combinada anti-PD1 /CD137 mAbs apresentado um aumento significativo na frequência e o número absoluto de células CD3

+ (p 0,01) e CD8

+ T (p 0,001), as células e diminuição dos níveis de CD4

+ FoxP3

+ regulamentar células T (Treg) (p 0,001) e GR-1

+ CD11b

+ células supressoras mielóides derivadas (MDSCs) (p 0,05 ); lotes representativos são mostrados na (Figura 2B). Combinado anti-PD1 /CD137 mAbs também elevou os níveis de CD44

+ CD62L

– efetoras /de memória (p 0,01), CD44

+ CD62L

+ memória central (p 0,05), IFN -γ produtora de efector CD8

+ células T (p 0,01) e diminuiu

+ células T CD8 produtoras de IL-10 (p 0,001) nos baços (Figura 3A); lotes representativos são apresentados na Figura 3B. Os dados indicam que os anticorpos anti-DP-1 /CD137 mAbs terapia gerado uma resposta imunitária sistémica dominado por CD8 aumentaram significativamente

+ células T efectoras e células diminuiu imunossupressores.

Mice (3 /grupo) transplantado i.p. com 3 × 10

i.p. 6 células ID8 10 dias antes, foram injectados com 0,5 mg de controlo, anti-CD137 e anti-DP-1 ou anti-DP-1 /CD137 mAb e a injecção de mAb foi repetido 4 dias mais tarde. Sete dias após a segunda injecção, os baços foram colhidos e suspensões de células únicas preparadas e coradas com anticorpos contra marcadores de fluorescência marcado de subconjuntos de linfócitos antes da análise por citometria de fluxo. As percentagens e números de CD3

+, CD4

+, CD8

+, CD19

+, FoxP3

+ /CD4 e GR-1

+ CD11b

+ células em baços são mostrados em (a) e dotplots representativos são mostrados em (B). Os dados são apresentados como M ± SEM de 3 ratinhos /grupo e são representativos de 3 expericias independentes. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0.001, as conclusões anti-PD-1 ou CD137 mAbs individuais são comparados com mAb de controlo, e os resultados com anti-mAbs PD-1 /CD137 são comparados com o controlo e com mAb única.

Mice (3 /grupo) que tinha sido transplantado i.p. com 3 × 10

i.p. 6 células ID8 10 dias antes, foram injectados duas vezes, a intervalos de 4 dias com 0,5 mg de controlo, anti-CD137 e anti-DP-1 ou anti-DP-1 /mAb CD137. Os baços de ratinhos tratados foram analisados ​​para fenótipos e as funções efectoras de células T CD8

+ linfócitos T por citometria de fluxo de 7 dias após a segunda injecção de mAb. As percentagens e números de CD44

+ CD62L

– efetoras /memória e CD44

+ CD62L

+ de memória central e IFN-γ- e IL-10 células produtoras na CD8

+ população de células T são apresentados em (a) e dotplots representativos são mostrados em (B). Os dados são apresentados como M ± SEM de 3 ratinhos em cada grupo e são representativos de 3 expericias independentes. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0.001, PD-1 ou mAb CD137 comparação com mAb controle, PD-1 /mAb CD137 em comparação com o controle e mAb única.

resposta CTL antígeno-específica induzida pelo anti-CD137 /PD-1 mAbs

O nosso estudo anterior demonstrou que combinados /DP-1 /CD137 mAbs anti-CTLA4 induzir um antígeno potente tipo Th1 resposta imune espec�ico em baços de ratinhos ID8 de rolamento [27], cujos esplenócitos produziram altos níveis de IFN-γ após estimulação por péptido derivado a partir de células que expressam mesotelina ID8, um antigénio do tumor do ovário bem caracterizada [9]. Do mesmo modo, detectou-produção de IFN-γ por esplenócitos de ratinhos tratados com anti-combinada PD-1 /CD137 mAbs em resposta à estimulação por mesotelina, mas não um peptídeo derivado de HPV-E7 utilizada como controlo (dados não apresentados). Nós ainda determinado se os esplenócitos tinha actividade citolítica. Os esplenócitos de ratinhos tratados com anti-DP-1 /CD137 mAbs foram re-estimuladas com células ID8 UV-irradiada durante 4 dias antes dos ensaios de CTL foram realizados utilizando células EL4 pulsadas com HPV-E7 ou péptido derivado da mesotelina como células alvo. Como mostrado na Figura 4A, os esplenócitos de anti-DP-1 /CD137 ratinhos tratados exibiu actividade citotóxica em células EL4 pulsadas com mesotelina, mas não com o péptido HPV-E7. Pré-incubação com anticorpo CD8 suprimiu a actividade de morte (Figura 4B). Concluímos que combinada mAbs anti-DP-1 /CD137 eliciou uma resposta de CTL específica de antigénio-tumoral mediada por células CD8.

Ratos (3 /grupo) i.p. transplantado com 3 × 10 i.p.

6 células ID8 10 dias anteriores foram injetados duas vezes, a intervalos de 4 dias com 0,5 mg de anticorpos anti-DP-1 /CD137 mAb. Sete dias após a segunda injecção de Acm, reunidos os esplenócitos (5 × 10

6) a partir de 3 ratinhos foram incubados com 5 x 10

5 células ID8 UV-irradiada durante 4 dias. Os esplenócitos resultantes foram então avaliados quanto à actividade de CTL específica de antigénio por CytoTox 96 ensaio de citotoxicidade não radioactivos utilizando células EL4 mesotelina pulsadas com H-2Db-restrito ou péptido E7 de HPV-como células alvo (A). A actividade de morte, também foi avaliada na presença de anticorpos anti-CD4, anti-CD8 ou anticorpo de controlo (B). Os dados foram expressos como m ± SEM dos poços em triplicado.

resposta imune tipo Th1 local promovido pelo anti-CD137 /PD-1 mAbs

Para analisar a alteração nas células imunes locais, ratinhos com 10 dias tumor ID8 estabelecidos foram tratados com simples ou combinada /CD137 mAbs e suas lavagens peritoneais 1 anti-PD-foram colhidas 7 dias após a última injecção de Acm. Confirmando as nossas descobertas anteriores [27], o tratamento de anti-DP-1 /CD137 mAbs induzidos aumentaram significativamente a infiltração de células CD3

+ (p 0,01) e CD8

+ (p 0,01) de células bem como a diminuição da infiltração de CD19

+ (p 0,001) em comparação com células como controlo ou tratamento com mAb única (Figura 5A). Outras análises de expressão de CD44 e CD62L mostrou que a maioria de CD4

+ e CD8

células + T de anti-PD-1 /CD137 mAbs ratos tratados eram CD44

+ CD62L

– efetoras /memória T células e as suas percentagens eram muito mais elevados (p 0,01) do que a de controlo ou de ratos individuais tratados mAb (Figura 5B); dotplots representativos são mostrados na Figura S1. Também confirmámos a diminuição dos níveis de Tregs e MDSCs como relatado anteriormente (dados não apresentados; Ref 27).

Ratos (3 /grupo) i.p. transplantado com 3 × 10 i.p.

6 células ID8 10 dias anteriores foram injetados duas vezes, a intervalos de 4 dias com 0,5 mg de controlo, anti-CD137 e anti-DP-1 ou anti-DP-1 /mAb CD137. Duas semanas mais tarde, lavagem peritoneal de ratinhos tratados foi analisada por citometria de fluxo para a percentagem de linfócitos e fenótipo peritoneais. As percentagens de CD3

+, CD4

+, CD8

+ e CD19

+ linfócitos no lavado peritoneal e CD44

+ CD62L

– efetoras /células de memória em CD4

As células CD8 + e

+ T são mostrados em (a) e (B), respectivamente. A percentagem de PD-1

+ TIM-3

+ e PD-1

-Tim-3

+ células CD4 peritoneal

+ e CD8

células + T são mostrados em (C) com dotplots representativos na Figura S2. Os dados são apresentados como M ± EPM de 3 ratos de cada grupo e são representativos de 2 expericias independentes. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0.001, PD-1 ou mAb CD137 comparação com mAb controle, PD-1 /mAb CD137 em comparação com o controle e mAb única.

Single CD137 mAb ratinhos tratados também apresentaram aumento da infiltração de CD3

+ (p 0,05), CD8

+ (p 0,05) e CD44

+ CD62L

– efector /memória CD8

+ T (p 0,05) células na cavidade peritoneal, embora não foi eficaz em prolongar a sobrevivência global (Figura 1D). Para explorar os mecanismos subjacentes à insuficiência de protecção do tumor induzido sozinho por anticorpos anti-CD137 mAb, que examinaram a expressão de moléculas co-inibitória de DP-1 e regulador imunológico T mucina imunoglobulina celular (TIM-3) em células T, que têm sido relatados ser estreitamente associado com a exaustão funcional das células T [36,37]. Como mostrado na Figura 5C, CD137 mAb anti-sobre-regulada a expressão de DP-1 e TIM-3 em células CD4 peritoneal

+ e CD8

+ células T e única anti-DP-1 mAb teve pouco efeito sobre TIM-3 expressão embora atenuou a expressão de DP-1 em células CD8

+ células T, em comparação com o mAb de controlo. Notavelmente, concomitante PD-1 bloqueio preveniu significativamente a sobre-regulação de DP-1 e TIM-3 em células T induzida por activação CD137; dotplots representativos são mostrados na (Figura S2). Consistente com a regulação positiva de DP-1 e TIM-3, as células T peritoneais isolados de CD137 mAb anti-ratinhos tratados produziram níveis mais baixos de IL-2 e IFN-γ (Figura S3).

longa duração efeito antitumoral induzida por combinado anti-CD137 /PD-1 mAbs e cisplatina

Estudos anteriores relataram que CD137 anti-mAb synergizes com cisplatina, um quimioterápico comumente usado para ovário cancro, para induzir a regressão do murino CT-26 do cancro do cólon em 60% dos ratos [38]. Para explorar a eficácia da /CD137 1 mAbs anti-PD-mais cisplatina no modelo do cancro do ovário ID8, primeiro tratada ratinhos portadores de tumor com i.p. injecção de uma dose de cisplatina seguido por 2 doses de anti-DP-1 /CD137 mAbs em 4 dias de intervalo. Como mostrado na Figura 6A, combinada anti-DP-1 /CD137 tratamento /cisplatina produziu um efeito significativo anti-tumor, em comparação com uma única mAb, ambos os mAbs ou cisplatina isoladamente, resultando na sobrevivência a longo prazo de 80% (8 murganhos dos 10 ) ratos; não havia nenhum benefício de sobrevivência a partir sozinho ou combinado com qualquer anti-PD-1 ou anti-CD137 mAbs cisplatina. Obtivemos resultados similares de uma experiência repetida. A remoção de células CD8

+ células T revogada completamente o efeito anti-tumoral (Figura 6B), demonstrando um papel fundamental destas células na protecção do tumor. Os sobreviventes de longo prazo desenvolveu uma resposta imunitária sistémica com memória e tumor-especificidade como demonstrado pela sua resistência a desafio com células ID8, mas não para o desafio com células TC1 antigenicamente não relacionadas (Figura 6c). Controle, ratos naïve sucumbiu a desafiar tanto com ID8 ou células TC1 que tiveram taxas de crescimento semelhantes (Figura 6D).

Mice (10 /grupo) transplantado i.p. com 3 x 10

6 células ID8 10 dias antes, foram injectados i.p. com duas doses de controlo, anti-DP-1, anti-CD137 e anti-DP-1 /mAb CD137 (0,5 mg por dose por ratinho) no intervalo de 4 dias, com ou sem a co-administração de cisplatina (10 mg /kg) ao primeiro foi avaliada tratamento e a sua sobrevivência (A). (10 /grupo) Os ratinhos tratados com combinada anti-PD 1 /CD137 /cisplatina foram esgotadas de subconjuntos de linfócitos por injecção de anticorpos anti-CD4 (0,2 mg /murganho), anti-CD8 (0,2 mg /murganho), anti-NK1. 1 (0,1 mg /murganho) ou mAb de controlo (0,2 mg /ratinho) 48 e 72 horas antes do primeiro tratamento e a cada 3-4 dias, subsequentemente, durante a duração das experiências. ratinhos portadores de tumores não tratados foram como controlos negativos (grupo UNT).